WO2007105734A1 - 不凍活性を有する甲殻類由来タンパク質 - Google Patents

不凍活性を有する甲殻類由来タンパク質 Download PDF

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WO2007105734A1
WO2007105734A1 PCT/JP2007/054989 JP2007054989W WO2007105734A1 WO 2007105734 A1 WO2007105734 A1 WO 2007105734A1 JP 2007054989 W JP2007054989 W JP 2007054989W WO 2007105734 A1 WO2007105734 A1 WO 2007105734A1
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crustacean
protein
extract
antifreeze activity
antifreeze
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Satoru Chiba
Mitsutoshi Kubota
Satoko Nishizawa
Naoko Okamoto
Kenichi Suzuki
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Nippon Suisan Kaisha, Ltd.
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a protein having antifreeze activity, a method for producing the same, and utilization.
  • Ice Nuclear Protein INP
  • Anti-Freeze Protein AFP
  • Ice nuclei active bacteria are bacteria that have the ability to freeze pure water at 24 ° C without being frozen even at 20 ° C. It is clear that water acts as a nucleus when water begins to freeze. Such bacteria are known to cause frost damage on plants. Bacteria belonging to the genus Pseudomonas and Erwinia are known as the ice nucleus active bacteria (Non-patent Documents 12).
  • the ice nucleus protein is a protein having ice nucleus activity obtained from these ice nucleus active bacteria. Ice nucleoproteins are mostly derived from microorganisms and have been proposed for use in the food field, but at present they have not been put to practical use.
  • Antifreeze protein is a protein that exhibits an activity of inhibiting the growth of ice crystals, and is produced by species that live in many low-temperature environments. These species include fish inhabiting the Antarctic Ocean and low-temperature environments, plants growing in cold regions, beetle larvae that overwinter in cold regions, and microorganisms that adapt to low temperatures. So far, plant-derived antifreeze protein (patent document 1 2), lichen-derived antifreeze protein (patent document 2), fish-derived antifreeze protein (patent document 3 4), insect-derived antifreeze protein (patent document 5), etc. Reported Has been. Despite the fact that antifreeze proteins have been obtained from such a wide range of species, there are no reports on antifreeze proteins derived from crustaceans.
  • Patent Document 1 International Publication WO98 / 04148
  • Patent Document 2 International Publication W099Z37673
  • Patent Document 3 International Publication W096Z11586
  • Patent Document 4 International Publication WO97Z02343
  • Patent Document 5 International Publication WO99Z00493
  • Patent Document 6 International Publication WO90Z13571
  • Non-Patent Document l Appl. Microbiol. 28, p456, (1974)
  • Non-Patent Document 2 Pro 4th Int. Cont. Plant. Path. Bact. P725, (1978)
  • An object of the present invention is to provide a substance having antifreeze activity that can be used in a wide range of fields including foods in terms of safety, activity, productivity, and price.
  • the present invention provides the proteins (1) to (3) having antifreeze activity.
  • a protein having antifreeze activity derived from crustaceans (1) A protein having antifreeze activity derived from crustaceans.
  • the crustacean-derived protein has a molecular weight of about 37,000, about 16,000 and / or about 15,400 under reducing conditions, as determined by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide electrophoresis, N
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the protein having antifreeze activity according to (1), wherein the terminal amino acid is a protein represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the present invention provides crustacean extracts having antifreeze activity (4) to (6).
  • Crustacean extracts with antifreeze activity including proteins with antifreeze activity derived from crustaceans.
  • a protein having an antifreeze activity derived from a crustacean has a molecular weight measurement by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide electrophoresis of about 37,000, about 16,00 0 and / or about 15,400 under reducing conditions.
  • the shellfish extract having antifreeze activity according to (4) which has a molecular weight and whose N-terminal amino acid is a protein represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the present invention provides a method for producing a crustacean extract having antifreeze activity (7) to (: 13).
  • Crustacean shell, meat and / or visceral force A method for producing a crustacean extract having antifreeze activity, characterized by hot water extraction.
  • the present invention provides a food quality improver comprising a protein having antifreeze activity (14) to (: 17) or a crustacean extract having antifreeze activity, and a food to which the quality improver is added.
  • a food quality improver comprising a protein having antifreeze activity (14) to (: 17) or a crustacean extract having antifreeze activity, and a food to which the quality improver is added.
  • a protein having antifreeze activity (1) to (3), a shellfish extract having antifreeze activity (4) to (6), or (7) to (14) A food quality improving agent containing a crustacean extract having antifreeze activity produced by any method.
  • a food with improved quality characterized by adding the quality improver of (14).
  • the protein having antifreeze activity of the present invention is a crustacean-derived protein suitable for addition to foods, it can be added to various foods. In particular, by adding to frozen foods, quality deterioration due to freezing of frozen foods can be suppressed. In addition, because it is contained in many shellfish and discarded shells, it can be used for waste and can be manufactured at low cost.
  • FIG. 1 is a diagram showing a chromatography chart of a protein extracted from krill in Example 1.
  • FIG. 2 is a chart showing a Sephacryl S-200 HR gel filtration column chromatography chart of Example 1.
  • FIG. 3 shows a chart of Sephacryl S-200 HR gel filtration column chromatography of Example 1. 4] Photo of electrophoresis using SDS-polyacrylamide gel confirming the molecular weight of this protein sample 1.
  • FIG. 8 is a graph showing the temperature stability of the antifreeze activity of this protein sample 2.
  • FIG. 9 is a diagram showing the measurement results of the recrystallization inhibitory activity of this protein sample 2.
  • FIG. 11 A diagram showing the measurement results of antifreeze activity of extract powders A and B.
  • FIG. 15 shows a chart of Superdex G30 gel filtration chromatography of the protein extracted from the krill dry powder of Example 8.
  • FIG. 16 is a chart showing a reverse phase HPLC chart of Example 8.
  • FIG. 17 is a chart showing a reverse-phase HPLC chart of Example 8.
  • FIG. 21 is a view showing the salt solubility of the lost body to which extract powder B is added.
  • FIG. 22 is a diagram showing the amount of DMA produced by the lost body to which extract powder B is added.
  • the crustacea refers to the arthropod submaxillary crustacean network, and further includes the casil shrimp net (C mark harocarida), the mukadebi sub net (Remipedia), the daphnia sub net (Branchiopoda), and This refers to animals classified as Maxillopoda and Malacostraca.
  • the crustacea there are shrimp, crayfish, strength, krill, krill, shrimp, and shrimp in shrimp (decapoda) that are widely used for food in the fishery industry.
  • antifreeze activity is evaluated by thermal hysteresis.
  • Thermal hysteresis is usually the same as the freezing temperature and freezing point of water, but if a substance such as antifreeze protein is present, it binds to the surface of the ice crystal and inhibits crystal growth, causing the freezing point to drop. The difference between the melting temperature and freezing temperature that occurs.
  • antifreeze activity the freezing point of the solution was obtained by an osmometer (eg, OSMOMETER OM 801 manufactured by Vogel), and thermal hysteresis was evaluated.
  • the recrystallization inhibitory activity of ice crystals is the activity of suppressing this recrystallization. That is, the activity of keeping small ice crystals small.
  • the antifreeze protein of the present invention has the activity of inhibiting the recrystallization of ice crystals, and can also suppress the deterioration of food quality due to temperature change during frozen storage, which is not limited to freezing frozen foods.
  • the presence or absence of ice crystal recrystallization inhibitory activity was measured by observing ice crystals with a microscope and observing the number of micro ice crystals. That is, 2 ⁇ l of a protein sample having an inhibitory activity on recrystallization of ice crystals dissolved in a 30% sucrose solution is dropped on a cover glass, and the cover glass is placed on top of it and sandwiched between them. (Olympus ⁇ 2 microscope, Linkam LK600 temperature controller) Cool the cooling stage at 20 ° C, 30 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 20 ° C, 30 ° C, and 10 ° C in the order of 0.1 ° C / sec.
  • the number of ice crystals having an area of 10.01 35 ⁇ m 2 was counted as micro ice crystals. If a substance having an activity to inhibit recrystallization of ice crystals is not added, the ice crystals grow larger and the number of micro ice crystals decreases, but the activity of inhibiting ice crystal recrystallization increases the number of micro ice crystals.
  • protein is first extracted from crustaceans.
  • General methods for extracting, separating and concentrating proteins can be used. That is, all tissues present in crustaceans are crushed, and the resulting suspension is centrifuged to remove insoluble substances.
  • a surfactant anionic, nonionic, zwitterionic, cationic, polymeric surfactant, etc.
  • nonionic surfactants are suitable.
  • the obtained supernatant can be separated and concentrated by the following general method. Separation by “sulfuric acid fraction” as a salting-out method.
  • the protein obtained by the above method is subjected to heat treatment, reduction treatment, or heat reduction treatment to produce a protein exhibiting antifreeze activity.
  • a reducing agent such as 2-mercaptoethanol, dithiothreitol, and ascorbic acid
  • the antifreeze protein of the present invention can be obtained directly.
  • the antifreeze protein of the present invention can also be obtained by decomposing a protein extracted at a low temperature by heat treatment or reduction treatment. At this time, the hot water extraction is preferably at 60 ° C or higher, particularly preferably at 80 ° C or higher.
  • the extract is heated (at 60 ° C or higher) or treated with a reducing agent such as 2-menolecaptoethanol, dithiothreitol, or ascorbic acid. As a result, the extracted protein is decomposed to obtain antifreeze protein.
  • the protein having antifreeze activity of the present invention has a molecular weight of about 37,000, about 16,000 and / or about 15,400 under reducing conditions by molecular weight measurement by sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide electrophoresis. And a protein having an N-terminal amino acid represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is included.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • SEQ ID NO: 1 or 2 is included.
  • the above extract has antifreeze activity as it is, but when it is further purified and concentrated, it can be purified and concentrated using the characteristics of these proteins as an index.
  • the protein of the present invention has antifreeze activity and ice crystal recrystallization inhibitory activity, addition of the protein to food can suppress food deterioration due to freezing.
  • the amount added to the food is the strength depending on the type of food, the purpose of use, and the total weight of the food. In the case of an extract having a purity such as the protein sample 2 of Example 1 and each extract powder of Example 8, It is preferable to add about 0.00001% to 10%, preferably about 0.0001% to 0.1%.
  • the extract was suspended in a homogenizer using 420 ml of an extract containing 50 mM ammonium bicarbonate (pH 7.9) and lmM P MSF per 80 g of frozen Antarctic krill.
  • Triton-X100 manufactured by Sigma
  • Triton-X100 was added to this suspension so as to be 0.1%, and the mixture was stirred for 1 hour under ice cooling. Thereafter, the suspension was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 30 minutes, and the resulting supernatant was subjected to ammonium sulfate fractionation. That is, the precipitate obtained by adding 35-65% saturated ammonium sulfate is 30 x 10,000 x g. Centrifugation was performed for a minute and recovered.
  • this fraction was put into a dialysis membrane, and polyethylene glycol 6000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was coated around the dialysis membrane. The fraction was allowed to stand at 4 ° C for about 3 hours and concentrated about 10 times. This was then dialyzed overnight at 4 ° C against 10 mM ammonium bicarbonate (pH 7.9) solution. After dialysis, it was applied to 1.6 ( ⁇ 60 ( ⁇ 3 11 & ( ⁇ 71 S-200 HR gel filtration column chromatography, which had been equilibrated with the same solution. The peak indicated by the chromatographic arrow shown in Fig. 2 This fraction was put into a dialysis membrane, dialyzed with distilled water, and then freeze-dried, and 80 mg of protein (this protein sample) was obtained from 80 g of frozen Antarctic krill. 1) was obtained.
  • polyethylene glycol 6000 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • this protein sample 1 was measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Using 10% acrylamide gel, run for 12 hours at 12 mA using a buffer solution containing 0.1% SDS, 25 mM Trishydroxymethylaminomethane, 192 mM glycine (pH 8.6), then CBB R Protein was stained at -250. As a result, it was shown that this protein has a subunit structure of about 200 kDa composed of monomers of about 86 kDa or 90 kDa (Fig. 4; the leftmost column is a molecular weight marker, the second column from the left is 200 kDa).
  • the Nile blue A solution was prepared by dissolving 0.25 g in 100 ml of distilled water, then adding 1 ml of concentrated sulfuric acid, boiled for 2 hours, and filtered through a filter. The gel after electrophoresis was transferred into this solution and incubated at 50 ° C for 30 minutes. Thereafter, the mixture was transferred to a 5% acetic acid solution, incubated at 50 ° C. for 2 days, and further incubated in a 0.5% hydrochloric acid solution for 5 minutes, followed by washing with distilled water. As a result, bands of 86 kDa, 90 kDa, and 200 kDa developed, indicating that fatty acids were bound to these proteins (Fig. 4; rightmost column).
  • N-terminal amino acid sequence of this protein sample 1 was analyzed. That is, SDS-polyacrylamide electrophoresis was performed in the same manner as in Example 2, and then transferred to a polyvinylideneidene film using a semi-dry transfer apparatus. The band of this protein sample 1 was cut out, and the N-terminal amino acid sequence was analyzed with a protein sequencer (ABI 473A type protein sequencer). As a result, it was revealed that the N-terminal amino acid sequence of this protein sample was as shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing. This also indicates that there is an isoform having a similar amino acid sequence in the present protein sample 1.
  • Heat hysteresis was measured as antifreeze activity for the protein sample 1 and the protein sample 2 described above.
  • the freezing point of the solution was determined by OSMOMETER OM 801 manufactured by Vogel, and the thermal hysteresis was determined.
  • the thermal hysteresis increased in a concentration-dependent manner at a protein concentration force of S0 to 10 mg / ml, and a thermal hysteresis of 0.42 ° C was shown at a concentration of 10 mg / ml (Fig. 6).
  • this protein sample 1 showed no increase in thermal hysteresis. From this result, it was shown that low molecular weight proteins produced under reduction had antifreeze activity.
  • ice crystals were directly observed with a microscope, and the presence or absence of antifreeze activity was examined based on whether there was a characteristic change such as bipyramidal or hexagonal shape.
  • 1 ⁇ 1 of the purified protein solution is dropped on the cover glass, and the cover glass is placed on the cover glass and placed on the stage of the Olympus BH2 microscope, and cooled by the Linkam LK600 temperature controller. The temperature was cooled at 0.1 ° C. per second, and ice crystals were observed.
  • this protein sample 2 was added, bipyramidal ice crystals as shown in FIG. 7 were observed.
  • the protein sample 2 was tested for temperature stability. Each sample was dissolved in 50 mM aqueous ammonium hydrogen carbonate solution ( ⁇ 7 ⁇ 9) (protein concentration 7.5 mg / ml) and kept at 0 to 90 ° C. for 1 hour, and then antifreeze activity was measured. As a result, it was shown that the antifreeze activity is 100-110% of the activity of the sample kept at 0 ° C and is stable to heat (Fig. 8).
  • the protein sample 1 In order to confirm in which part of the krill the protein sample 1 is contained, it is divided into the eyeball, meat, liver viscera, and shell, and confirmed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. It was confirmed to exist. In particular, since it was confirmed that the shell contained a large amount, the shell strength of the Antarctic krill was purified by the same method as in Example 1, and 10 g of protein with a shell strength of 20 mg was obtained.
  • a suspension containing 2 L of tap water was prepared.
  • the prepared suspension was heated at 80 ° C. for 30 minutes and then centrifuged at 5000 G for 30 minutes to recover 2.6 L of the supernatant.
  • the supernatant was concentrated under reduced pressure at 45 ° C. to obtain 0.52 L of a concentrated solution. This enrichment
  • the liquid was dried with a spray dryer to obtain a powder (extract powder A). The weight of the obtained powder was 121 g, and the protein content in the powder was 24.2%.
  • the shell was separated from krill, dried and pulverized to obtain a dried krill shell.
  • a cake suspension of 7 L of tap water was prepared for 1 kg of the dried krill shells obtained.
  • the prepared suspension was heated at 80 ° C. for 30 minutes and then centrifuged at 5000 G for 30 minutes to recover 4.7 L of the supernatant.
  • the supernatant was concentrated under reduced pressure at 45 ° C. to obtain 0.86 L of a concentrated solution.
  • This concentrated solution was dried with a spray dryer to obtain a powder (extract powder B).
  • the weight of the obtained powder was 124 g, and the proportion of protein contained in the powder was 10.6%.
  • Extract powder A was confirmed to contain protein power S with a molecular weight of 37 kDa, and extract powder B contained 16 kDa and 15.4 kDa proteins. ( Figure 10)
  • the antifreeze activity of the extract powders A and B was observed.
  • the extract powder was suspended in distilled water, desalted by ethanol precipitation, and hot hysteresis was measured with an osmometer. It was confirmed that the heat hysteresis increased in both extract powders depending on the protein concentration (Fig. 11). From the above results, it was shown that the krill-derived extract powder produced by the above extraction method contains a protein having antifreeze activity.
  • Table 2 when comparing the thermal hysteresis per lmg / ml, the antifreeze activity of extract powder B extracted from dried krill shells is about 3 times stronger than that of extract powder A. Was observed.
  • the growth inhibitory effect of ice crystals by the krill-derived extract powder was observed with a microscope. Obvious The extract powder was suspended in distilled water in a cooling stage installed in a micromirror, and then applied so as to be sandwiched between two cover glasses. The temperature in the cooling stage was lowered to 30 ° C, and the suspension was frozen once, and then raised to around 0 ° C to produce ice crystals. Next, the temperature inside the cooling stage was decreased at a rate of C / min, and the state of ice crystals growing as the temperature decreased was observed. When suspensions of krill hole-derived extract powder A and krill shell-derived extract powder B were used, as shown in FIGS. 12 and 13, ice crystal growth was suppressed and hexagonal flat ice crystals were observed. Therefore, it was demonstrated that both these extract powders have the effect of inhibiting the growth of ice crystals.
  • the recrystallization control effect of ice crystals by krill-derived extract powder was observed. That is, the protein sample 2 a 1 dissolved in a 30% sucrose solution is dropped on a cover glass, and the cover glass is placed on the cover glass and placed on a stage of an optical microscope (Olympus BH2 type). The temperature inside the cooling stage is set to 20 using a temperature controller (LK600 manufactured by Linkham). C, 30. C, 20. C, 30. C, 20. C, 30. C, —10. 0.1 in the order of C. After repeated cooling and heating at C / sec, the mixture was kept at ⁇ 10 ° C. for 30 minutes, and ice crystals having an area of 10.01 to 35 ⁇ 2 were counted as fine ice crystals. As shown in FIG. 14, it was confirmed that the krillhole derived powder A peaked at a concentration of 0.001%, and the krill shell derived powder B had a recrystallization inhibitory activity in a concentration-dependent manner.
  • the measurement conditions of the reverse phase HPLC are as follows.
  • Starch gel was prepared using RVA (Rapid Pisco Analyzer) from potato starch. After freezing at _20 ° C, stored at _10 ° C and observing the water separation after thawing, it was confirmed that the increase in water separation was suppressed by adding krill-derived extract powder (Figure 18). In addition, after freeze-drying the starch gel after freezing for 7 days and observing the structure with an electron microscope, the starch gel to which the extract powder was added had a finer structure compared to the gel with no additive. It was confirmed that (Figs. 19 and 20) This is thought to be because the krill-derived extract powder suppressed the growth of ice crystals during the freezing storage of starch gel and the deterioration during the freezing storage of the starch gel.
  • RVA Rapid Pisco Analyzer
  • Meat was collected from Sukesutara, a fresh fish caught off Sanriku, and minced with a 3mm mesh mincer. Take 500g of this, add 50g of water and 50g of sugar, and extract powder B To 0 to 0.1%, and stirred for 25 seconds with a desktop mixer. I dropped it and used it as a shampoo. Each sample was then frozen overnight at 25 ° C and then stored for 2 weeks at 10 ° C and used for the measurement of salt solubility and TMAO degradation, which are indicators of storage stability.
  • the suspension solution was centrifuged at 7,000 111 for 15 minutes, and the protein concentration of the obtained supernatant was measured by the biuret method, and the volume was also measured. Based on the above measurements, the salt solubility was calculated from the ratio of the protein content in the supernatant to the protein content in the suspension. As a result, as shown in Fig. 21, the salt solubility increases with the amount of the extract powder ⁇ , and the addition of the extract powder ⁇ tends to suppress the deterioration of the quality of the fallen shellfish during frozen storage. Indicated.
  • DMA amount (mM) (440 nm measured value) ⁇ 1 ⁇ 3 X 2 X 50 ⁇ 1000 ⁇ (sample weight) X 1000
  • Cooked rice was prepared and evaluated according to the formulation shown in Table 4 (by this formulation, the added rice cake contains 0.000 36% of this protein sample 2 in the cooked rice).
  • 1. 35 times the amount of water was added to polished rice (Kirara 397 H17 rice) and cooked using a household rice cooker. After cooking, it was steamed for 30 minutes and then molded with 20g x 10 sushi stamps. Then, after freezing at _20 ° C for 3 days, it was transferred to 10 ° C and stored frozen for 5 days. Evaluation was performed by natural thawing for about 2 hours at room temperature to evaluate the texture. As a result, as shown in Table 4, the additive was sticky and tasted better than the control.
  • Evaluation was made using the formulation shown in Table 5 (with this formulation, the additive contains 0.00033% of the present protein sample 2 in the steamed tea cake). After mixing the ingredients, 60g each was added to a heat-resistant container, placed in a steamer and steamed. After removing the rough heat at room temperature, the sample was frozen at 20 ° C for 3 days and stored frozen at 10 ° C for 5 days. The evaluation was performed by steaming with a steamer for 10 minutes to evaluate the texture.
  • the soup product did not contain "soo" compared to the control, the texture was smooth, and it had a good taste without drip.
  • the protein of the present invention is mostly contained in crustacean shells that are discarded except for being used as a raw material for meal, chitin, and chitosan, so that it can be prepared in large quantities and can be produced at low cost. . Also, since it is a food-derived protein, it can be applied to food additives.
  • the protein of the present invention has antifreeze activity and recrystallization crystallization activity of ice crystals, it can be widely used for the purpose of maintaining the quality of frozen foods and the like.

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Abstract

　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約37,000、約16,000及び／又は約15,400の分子量であり、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１又は２で示される、甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質。 　このタンパク質は、安全性、活性、生産性、価格等の面で従来の不凍性タンパク質より優れており、食品をはじめとする広い分野で使用できる。

Description

明 細 書
不凍活性を有する甲殻類由来タンパク質
技術分野
[0001] 本発明は、不凍活性を有するタンパク質およびその製造方法、利用に関する。
背景技術
[0002] 水は 0°Cで氷になるといわれている力 厳密には、純水を冷やしても 0°Cでは凍り始 めず、凝固点以下の温度でも凍結しない過冷却現象が知られている。水の凍結は、 温度が o°c以下になると水の中に存在する何らかの物質が氷の核になり、結晶が成 長するという過程で進行する。この凍結現象をコントロールすることができれば、食品 の冷凍保存技術、微生物や生物組織の保存技術などをはじめ、人口降雨技術、冷 熱輸送技術などあらゆる分野での利用が可能になると考えられている。
[0003] 水の凍結に関係する物質として注目されてレ、るのが、氷核タンパク質（Ice Nuclear Protein; INP)と不凍タンパク質（Anti-Freeze Protein; AFP)である。
[0004] 氷核活性細菌は、 20°Cでも凍結しなレ、純水を 2 4°Cで凍結させる能力を もつ細菌のことで、水が凍結を開始するときの核として働くことが明らかとなっており、 このような細菌は植物に凍霜害を引き起こす原因になることが知られている。この氷 核活性細菌としてはシユードモナス（Pseudomonas)属、エルウイニイァ（Erwinia)属の 細菌が知られている（非特許文献 1 2)。氷核タンパク質は、これら氷核活性細菌か ら得られる氷核活性を有するタンパク質である。氷核タンパク質は、微生物由来のも のが大半であり、食品分野での利用も提案されているが、あまり実用化されていない のが現状である。
[0005] 不凍タンパク質は、氷晶の成長を阻止する活性を示すタンパク質であり、多くの低 温環境下で生息している生物種によって生産されるタンパク質である。それらの生物 種とは、南極海や低温環境下に生息している魚、寒冷地で生育している植物、寒冷 地で越冬する甲虫の幼虫、低温に適応する微生物などである。これまでに植物由来 不凍タンパク質 (特許文献 1 2)、地衣類由来不凍タンパク質 (特許文献 2)、魚由来 不凍タンパク質 (特許文献 3 4)、昆虫由来不凍タンパク質 (特許文献 5)などが報告 されている。これだけ広範囲の生物種から不凍タンパク質が得られているにもかかわ らず、甲殻類に由来する不凍タンパク質についての報告はされていない。
特許文献 1：国際公開 WO98/04148公報
特許文献 2：国際公開 W099Z37673公報
特許文献 3 :国際公開 W096Z11586公報
特許文献 4 :国際公開 WO97Z02343公報
特許文献 5：国際公開 WO99Z00493公報
特許文献 6 :国際公開 WO90Z13571公報
非特許文献 l :Appl. Microbiol. 28, p456, (1974)
非特許文献 2 : Pro 4th Int. Cont. Plant. Path. Bact. P725, (1978)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、安全性、活性、生産性、価格等の面で、食品をはじめとする広い分野で 使用できる不凍活性を有する物質を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 発明者は、多くの種類の生物種から不凍タンパク質が見出されていることから、南 極海に生息するォキアミにもそのようなタンパク質が含まれている力もしれないとの考 えに基づき、試験を開始した力 S、公知の文献に記載されているような方法では不凍活 性を有する物質を得ることができなかった。抽出方法を工夫することにより、不凍活性 を有するタンパク質を見出し、さらに氷核活性を有するタンパク質も見出した。さらに ォキアミ以外の甲殻類にも注目した結果、同様の抽出方法を採用することにより類似 のタンパク質を得ることに成功した。
[0008] 本発明は、（1)〜（3)の不凍活性を有するタンパク質を提供する。
(1)甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質。
(2)甲殻類由来のタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリルアミド 電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約 37,000、約 16,000及び/又は約 1 5，400の分子量であり、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質であ る（1)の不凍活性を有するタンパク質。 (3)甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属す るものである（1)又は（2)の不凍活性を有するタンパク質。
[0009] 本発明は、（4)〜（6)の不凍活性を有する甲殻類抽出物を提供する。
(4)甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質を含む不凍活性を有する甲殻類抽 出物。
(5)甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) - ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約 37,000、約 16,00 0及び/又は約 15,400の分子量であり、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示され るタンパク質である (4)の不凍活性を有する甲殻類抽出物。
(6)甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属す るものである（4)又は（5)の不凍活性を有する甲殻類抽出物。
[0010] 本発明は、（7)〜（： 13)の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法を提供する
(7)甲殻類の殻、肉及び/又は内臓力 熱水抽出することを特徴とする不凍活性を 有する甲殻類抽出物の製造方法。
(8)熱水抽出が 60°C以上の熱水である（7)の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製 造方法。
(9)甲殻類の肉及び/又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び/又は内臓 の抽出液を加熱処理及び/又は還元処理することを特徴とする不凍活性を有する 甲殻類抽出物の製造方法。
(10)甲殻類の肉及び/又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び/又は内 臓の抽出液が、抽出液に含まれるドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリルアミド 電気泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元し た場合、約 86,000のバンドと約 90,000のバンドを示し、 N末端アミノ酸が配列番号 3又 は 4で示されるタンパク質を精製及び/又は濃縮したものである（9)の不凍活性を有 する甲殻類抽出物の製造方法。
(11)甲殻類の殻、肉及び Z又は内臓から界面活性剤を添加した抽出液で抽出する ことを特徴とする（9)又は（10)の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。 (12)加熱処理が 60°C以上にすることであり、還元処理が還元剤を添加することであ る（9)、（10)又は（11)の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
(13)甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属 するものである（7)ないし（12)いずれかの不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造 方法。
[0011] 本発明は、（14)〜（： 17)の不凍活性を有するタンパク質または不凍活性を有する 甲殻類抽出物を含む食品の品質改良剤及び当該品質改良剤を添加した食品を提 供する。
(14) (1)ないし（3)いずれかの不凍活性を有するタンパク質、（4)ないし（6)いずれ 力、の不凍活性を有する甲殻類抽出物、又は、（7)ないし（14)いずれかの方法で製 造した不凍活性を有する甲殻類抽出物を含む食品の品質改良剤。
(15) (14)の品質改良剤を添加したことを特徴とする品質改良された食品。
( 16 )食品が冷凍食品である（ 15 )の食品。
(17)食品が卵、小麦粉、又は、魚肉を材料として使用する食品である（15)又は（16 )の食品。
発明の効果
[0012] 本発明の不凍活性を有するタンパク質は、食品への添加に適した甲殻類由来のタ ンパク質であるから、各種食品に添加することができる。特に冷凍食品に添加するこ とにより、冷凍食品の冷凍による品質劣化を抑制することができる。また、甲殻類の中 でも廃棄される殻にも多く含有されることから、廃棄物の利用にもなり、かつ、安価に 製造すること力 Sできる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]実施例 1のォキアミから抽出したタンパク質のクロマトグラフィーのチャートを示し た図である。
[図 2]実施例 1の Sephacryl S-200 HRゲルろ過カラムクロマトグラフィーのチャートを示 した図である。
[図 3]実施例 1の Sephacryl S-200 HRゲルろ過カラムクロマトグラフィーのチャートを示 した図である。 園 4]本タンパク質試料 1の分子量を確認した、 SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いた 電気泳動の写真である。
園 5]本タンパク質試料 2の分子量を確認した、 SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いた 電気泳動の写真である。
園 6]実施例 4の不凍活性の測定結果を示す図である
園 7]実施例 4の不凍活性を測定した試験におけるバイピラミダル型の氷結晶の写真 である。
園 8]本タンパク質試料 2の不凍活性の温度安定性を示す図である。
園 9]本タンパク質試料 2の再結晶化阻害活性の測定結果を示す図である。
園 10]エキス粉末 A及び Bの SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析結果を示す写 真である。
園 11]エキス粉末 A及び Bの不凍活性の測定結果を示す図である。
園 12]エキス粉末 Aの不凍活性を測定した試験における六角平面状の氷結晶の写 真である。
園 13]エキス粉末 Bの不凍活性を測定した試験における六角平面状の氷結晶の写 真である。
園 14]エキス粉末 A及び Bの氷結晶の再結晶化阻害活性の測定結果を示す図である
[図 15]実施例 8のォキアミ乾燥粉末から抽出したタンパク質の Superdex G30ゲルろ 過クロマトグラフィーのチャートを示した図である。
[図 16]実施例 8の逆相 HPLCのチャートを示した図である。
[図 17]実施例 8の逆相 HPLCのチャートを示した図である。
園 18]デンプンゲルにおけるォキアミ由来エキス粉末の離水防止効果を示す図であ る（図中、殻とはォキアミ殻由来のエキス粉末 B、ホールとはォキアミホール由来のェ キス粉末 Aを用いたデータである）。
園 19]エキス粉末無添加のデンプンゲル (7日間冷凍保存)電子顕微鏡で観察した 写真である。
園 20]エキス粉末 Aを添加したデンプンゲル (7日間冷凍保存）電子顕微鏡で観察し た写真である。
[図 21]エキス粉末 Bを添加した落とし身の塩溶解性を示す図である。
[図 22]エキス粉末 Bを添加した落し身の DMA生成量を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明において甲殻類とは、節足動物大顎亜門甲殻網を指し、さらにカシラエビ亜 網 (C印 harocarida)、ムカデェビ亜網 (Remipedia)、ミジンコ亜網 (Branchiopoda)、ァゴ ァシ亜網 (Maxillopoda)、ェビ亜網 (Malacostraca)に分類される動物を指す。特に水産 産業上食用として多く利用されているェビ目（十脚目）に含まれるェビ、ザリガニ、力 二、ォキアミ目のォキアミ、ナンキヨクオキアミ、シヤコ目のシヤコなどが挙げられる。
[0015] 本発明において不凍活性は、熱ヒステリシスで評価する。熱ヒステリシスとは通常、 水の凍結温度と凝固点は同一であるが、不凍タンパク質のような物質が存在すると氷 結晶の表面へ結合し、結晶の成長が阻害され、凝固点が降下し、そのとき生じる融 解温度と凍結温度の差のことをいう。本明細書の実施例では、不凍活性として、ォス モメーター（例： Vogel社製 OSMOMETER OM 801)により、溶液の凝固点を求め、熱 ヒステリシスを評価した。
[0016] 凍結した水が温度上昇によりわずかに溶けた場合に、溶けた水が再度、残存して レ、る氷結晶のまわりに氷結するため、氷結晶の大きさはどんどん成長し大きくなつたり 、小さい氷結晶同士が結合して大きな結晶を形成したりする現象がある。この現象は 氷結晶の再結晶化と呼ばれる。本発明において氷結晶の再結晶化阻害活性とは、こ の再結晶化を抑制する活性である。すなわち、小さい氷結晶を小さいままで維持する 活性である。本発明の不凍タンパク質は、この氷結晶の再結晶化阻害活性を有し、 冷凍食品などの凍結の際だけでなぐ冷凍保存中の温度変化による食品の品質劣 化も抑制することができる。
[0017] 本発明において、氷結晶の再結晶化阻害活性の有無は、氷結晶を顕微鏡で観察 し、微小氷結晶数を観察する方法により測定した。すなわち、 30%スクロース溶液に 溶解した氷結晶の再結晶化阻害活性を有するタンパク質試料 2 μ 1をカバーガラス上 に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟み、温度制御のできる光学顕微鏡 (ォリンパス社製 ΒΗ2型顕微鏡、リンカム社製 LK600温度制御装置）のステージに乗 せ、冷却ステージ内の温度を 20°C 30°C 20°C 30°C 20°C 30°C 10°C の順に 0.1°C/秒で冷却、加熱を繰り返した後、— 10°Cで 30分保持し、 10.01 35 μ m2の面積を有する氷結晶を微小氷結晶として、その個数を数えた。氷結晶の再結晶 化阻害活性を有する物質を添加しないと氷結晶は大きく成長し微小氷結晶が少なく なるが、氷結晶の再結晶化阻害活性あると微小氷結晶数が多くなる。
[0018] 本発明の不凍活性を有するタンパク質を製造するには、まず、甲殻類からタンパク 質を抽出する。タンパク質を抽出し、分離、濃縮するための一般的な方法を用いるこ とができる。すなわち、甲殻類に存在するすべての組織を破砕し、得られた懸濁液を 遠心分離し、不溶性物質を取り除く。この際に界面活性剤（陰イオン系、非イオン系、 両性イオン系、陽イオン系、高分子界面活性剤など)を使用することにより可溶化が 促進され、抽出性が増す。特に、非イオン系の界面活性剤が適している。得られた上 澄みは次に示す一般的な方法でタンパク質を分離 ·濃縮することができる。塩析によ る方法として硫安分画による分離'濃縮方法。有機溶媒による分離'濃縮方法として アセトン、エタノール、プロパノール、メタノールを用いた方法。塩酸、硫酸、三塩化酢 酸を用いた酸沈殿法。水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール、デキストランを用い た分離 ·濃縮方法。限外ろ過 (膜濃縮）による分離 ·濃縮方法。イオン交換クロマトダラ フィー担体、疎水クロマトグラフィー担体、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー担 体、逆相クロマトグラフィー担体、及びゲルろ過クロマトグラフィー担体でそれぞれ吸 着 ·分離することができる。さらには上澄みを加熱処理して他のタンパク質を熱変性さ せ沈殿させることもできる。また得られた分離物は凍結乾燥やスプレードライなどで粉 末ィ匕することもできる。さらに不凍活性を有するタンパク質が氷結晶の表面に吸着す る性質を利用してタンパク質が含まれている水溶液から氷結晶を介して分離すること も可能である。
[0019] 上記方法で得られたタンパク質を、加熱処理、還元処理、または、加熱還元処理を 施すことにより不凍活性を示すタンパク質を生成する。 2-メルカプトエタノール、ジチ オスレィトール、ァスコルビン酸などの還元剤を添カ卩し、さらに加熱することで不凍活 性を示す。不凍活性を有するタンパク質を得るためには抽出処理や分離 ·濃縮処理 時に適時、還元剤をカ卩えて加熱処理などを行うことが好ましいが、添カ卩しなくても加 熱処理を施すだけでも得ることが出来る。
[0020] 具体的な製造例としては、甲殻類の肉、内臓、及び/又は殻の冷凍品、生のまま、 あるいは乾燥品を破砕して懸濁液を製造する。これを熱水抽出すれば、本発明の不 凍タンパク質が直接得られる。また、低温で抽出したタンパク質を加熱処理、または 還元処理して分解させることによつても本発明の不凍タンパク質が得られる。このとき 、熱水抽出は 60°C以上が好ましぐ特に好ましくは 80°C以上である。また、 0〜60°C の低温で抽出した場合は、抽出液を加熱処理（60°C以上にする）あるいは、 2—メノレ カプトエタノール、ジチオスレィトール、ァスコルビン酸などの還元剤による処理をす ることにより、抽出されたタンパク質が分解されて不凍タンパク質が得られる。
[0021] 本発明の不凍活性を有するタンパク質には、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリ アクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約 37,000、約 16,000及 び/又は約 15,400の分子量であり、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタ ンパク質が含まれる。上記の抽出液はそのままで不凍活性を有するが、さらに精製、 濃縮する場合は、これらのタンパク質の特徴を指標に精製、濃縮することができる。
[0022] 本発明のタンパク質は不凍活性、氷結晶の再結晶化阻害活性を有するので、食品 に添加することにより、凍結による食品の劣化を抑制することができる。食品への添加 量は、食品の種類、使用目的による力 食品の総重量に対して、実施例 1の本発明 タンパク質試料 2や実施例 8の各エキス粉末のような純度の抽出物の場合、 0.00001 %〜10%、好ましくは 0.0001%〜0.1%程度添加するのが好ましい。
[0023] 以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものでは ない。
実施例 1
[0024] く南極ォキアミ（ホール)からの不凍活性を有するタンパク質の抽出.精製〉
冷凍南極ォキアミ 80gに対して 50mM炭酸水素アンモニゥム（pH7. 9)、 lmM P MSFを含む抽出液 420mlを用いてホモジナイザーで懸濁した。この懸濁液に Triton -X100 (シグマ社製）を 0.1%になるように加えて、氷冷下で 1時間攪拌した。その後、 この懸濁液を 10,000 X gで 30分間遠心分離を行い、得られた上清に対して硫安分画 を行った。すなわち 35〜65%飽和の硫安を加えて得られる沈殿を 10,000 X gで 30 分間遠心分離を行い回収した。この沈殿に対して 1M硫酸アンモニゥム、 50mM炭 酸水素アンモニゥム（ρΗ7· 9) (Α液）を含む溶液を加えて懸濁した。この懸濁液を 10 ，000 X g 20分間遠心して得られた上清を上記 A液の緩衝液で平衡ィ匕してある 2.6c m X 20cm (106ml)の疎水カラムクロマトグラフィー（TOYOPEARL Phenyl 650M 東ソ 一社製）に供与し、 50mM炭酸水素アンモニゥム (PH7. 9) (B溶液）を用いて直線濃 度勾配でタンパク質を溶出した。この結果、図 1に示すクロマトグラフィーの Aピークの 画分を得た。
[0025] さらにこの画分を透析膜に入れ、その周囲にポリエチレングリコール 6000 (和光純 薬工業株式会社製)をまぶし、 4°C下で約 3時間静置し約 10倍に濃縮した。これを次 に 10mM炭酸水素アンモニゥム (pH7.9)溶液に 4°Cで一晩透析した。透析後、同溶 液で予め平衡化しておいた 1.6(^ 60(^の3印11&(^71 S-200 HRゲルろ過カラムクロ マトグラフィ一に供与した。図 2に示すクロマトグラフィーの矢印で示すピークの画分 が得られた。この画分を透析膜に入れ、蒸留水にて透析した後、それを凍結乾燥し た。この精製方法により 80gの冷凍南極ォキアミから 80mgのタンパク質 (本タンパク 質試料 1)を得た。
[0026] この本タンパク質試料 1に終濃度で ImMになるように 2-メルカプトエタノールを加え て 85°C 5分間の加熱を行い、再度 Sephacryl S-200HRゲルろ過クロマトグラフィーに 供した。その結果、図 3に示すように低分子側にピーク Bが現れた。このピーク B画分 を集め、凍結乾燥により濃縮した。この方法により 102mgの本タンパク質試料 1から 7 Omgのタンパク質を得た（本タンパク質試料 2)
実施例 2
[0027] <タンパク質の分子量の確認 >
本タンパク質試料 1の分子量を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した 。 10%アクリルアミドゲルを用いて、 0. 1%SDS、 25mMトリスヒドロキシメチルアミノメ タン、 192mMグリシン（pH8. 6)を含む緩衝液を用いて、 12mAで約 2時間泳動を行 つた後、 CBB R-250でタンパク質を染色した。その結果このタンパク質は約 86kDa 又は 90kDaの単量体によって構成される約 200kDaのサブユニット構造を有するこ とが示された（図 4 ;最左列は分子量マーカー、左から 2列目は 200kDaのサブュニッ トを、 3列目は 86kDa又は 90kDaの単量体を示す）。糖鎖の確認は SDS-ポリアクリル アミドゲル電気泳動後、ゲルを約 1時間室温で 7. 5%の酢酸溶液に浸した。次いで 0 .2%過ヨウ素酸に移し、 4°Cで 45分間インキュベートした。さらにシッフ試薬（和光純 薬工業 (株)）に移し、 45分間冷凍した。その後、シッフ試薬を除き、 10%酢酸で洗 浄した。その結果、 86kDa、 90kDa、 200kDaのバンドが発色し、これらのタンパク 質には糖が付いていることが示された（図 4 ;右から 2列目）。脂質の確認は Nile Blue
Aにより検出した。 Nile blue A溶液は 0.25gを 100mlの蒸留水に溶解し、その後 濃硫酸を lmlカ卩え、その後、 2時間ボイルし、フィルターでろ過して作成した。この溶 液中に電気泳動後のゲルを移し 50°Cで 30分間インキュベーションした。その後、 5 %酢酸溶液に移し、 50°Cで 2日間インキュベートし、さらにその後 0. 5%塩酸溶液に 5分間インキュベートし、蒸留水で洗浄した。その結果、 86kDa、 90kDa、 200kDa のバンドが発色し、これらのタンパク質に脂肪酸が結合してレ、ることが示された（図 4； 最右列)。
[0028] 本タンパク質試料 2については、 15— 25%アクリルアミドゲルで電気泳動により、 3 7kDa、 16kDa及び 15· 4kDaにバンドが確認された（図 5)。
実施例 3
[0029] 本タンパク質試料 1の N末端アミノ酸配列を分析した。すなわち、実施例 2と同様に S DS -ポリアクリルアミド電気泳動を行った後、セミドライ式転写装置を用いてポリフツイ匕 ビニリデン膜に転写した。そして本タンパク質試料 1のバンドを切出し、その N末端アミ ノ酸配列をプロテインシーケンサー（ABI社製 473A型プロテインシーケンサー）で分 析した。その結果、本タンパク質試料の N末端のアミノ酸配列は、配列表の配列番号 3及び 4に示したとおりであることが明らかとなった。またこのことから、本タンパク質試 料 1中には、類似のアミノ酸配列を持つアイソフォームが存在することが示された。
[0030] 同様に本タンパク質試料 2の 37KDaのタンパク質につレ、て N末端アミノ酸配列を分 析した。その結果、本タンパク質試料 2の N末端のアミノ酸配列は、配列表の配列番 号 1及び 2に示したとおりであることが明ら力となった。またこのことから、本タンパク質 試料 2中にも、類似のアミノ酸配列を持つアイソフォームが存在することが示された。 実施例 4 [0031] <不凍活性の測定 >
上記本タンパク質試料 1及び本タンパク質試料 2について不凍活性として熱ヒステリ シスを測定した。 Vogel社製 OSMOMETER OM 801により溶液の凝固点を求め、熱ヒ ステリシスを求めた。その結果、本タンパク質試料 2では、タンパク質濃度力 S0〜10mg /mlで濃度依存的に熱ヒステレシスが上昇して、 10mg/mlの濃度では 0. 42°Cの熱ヒ ステレシスが示された（図 6)。一方、本タンパク質試料 1では熱ヒステレシスの上昇は 認められなかった。この結果より還元下で生成した低分子量のタンパク質が不凍活 性を有してレ、ること示された。
[0032] また、氷結晶を直接顕微鏡で観察し、その形態にバイピラミダルや六角形などの特 徴的な変化があるかどうかで不凍活性の有無を調べた。精製されたタンパク質溶液 1 μ 1をカバーガラス上に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟んで Olympus 社製 BH2型顕微鏡のステージに乗せ、リンカム社製 LK600温度制御装置により冷却 ステージ内の温度を毎秒 0.1°Cで冷却して行き、氷結晶を観察した。その結果、本タ ンパク質試料 2を添加した場合には、図 7に示したようなバイピラミダル型の氷結晶が 観察された。
<温度安定性 >
本タンパク質試料 2の温度安定性について試験した。各試料を 50mM 炭酸水素 アンモニゥム水溶液（ρΗ7· 9)に溶解し (タンパク質濃度 7.5mg/ml)、 0〜90°Cにそれ ぞれ 1時間保持し、その後、不凍活性を測定した。その結果、 0°Cで保持した試料の 活性に対して不凍活性は 100〜110%を保持しており熱に安定であることが示され た（図 8)。
実施例 5
[0033] <再結晶化阻害活性の測定 >
本タンパク質試料 2の氷結晶の再結晶化阻害活性として、氷結晶を顕微鏡で観察 し、微小氷結晶数を観察した。すなわち、 30%スクロース溶液に溶解した本タンパク 質試料 2 /i 1をカバーガラス上に滴下し、さらにその上にカバーガラスを乗せて挟み、 光学顕微鏡 (ォリンパス社製 BH2型）のステージに乗せ温度制御装置 (リンカム社製 LK600)により冷去 Pステージ内の温度を 20°C 30°C 20°C 30°C 20°C 3 0°C 10°Cの順に 0. 1°C/秒で冷却、加熱を繰り返した後、 10°Cで 30分保持 し、 10. 01 35 μ πι2の面積を有する氷結晶を微小氷結晶として数えた。その結果、 図 9に示したように濃度 1. 0 X 10— 2mg/mlにピークを示し、氷結晶の再結晶化阻害 活性を有することが確認された。
実施例 6
[0034] く南極ォキアミの各部位からの本タンパク質試料 1の精製 >
上記本タンパク質試料 1がォキアミのどの部位に多く含まれるかを確認するために 眼球、身肉、肝勝臓、殻に分けて、 SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認し たところいずれの部位にも存在することが確認された。特に殻に多く含まれることが確 認されたので南極ォキアミの殻力もも実施例 1と同じ方法で精製したところ、 10gの殻 力 20mgのタンパク質が得られた。
実施例 7
[0035] <甲殻類由来タンパク質の不凍活性の測定 >
ォキアミ以外の甲殻類由来タンパク質の不凍活性の観察を行った。実施例 1と同様 の方法により、タラパガ二、ズワイガニ、アメリカザリガニの殻力 加熱生成物を精製し 、観察を行った結果、不凍活性を有することが確認された (表 1)。
[0036] [表 1]
Figure imgf000013_0001
* 1：蛋白質濃度は 1 mg ml * 2 :蛋白質濃度は CU mg ml 実施例 8
く南極ォキアミからの不凍タンパク質の抽出方法の検討〉
1.ォキアミホールからの抽出
冷凍ォキアミ 2kgをフードプロセッサーで粉砕後、水道水 2Lをカ卩えた懸濁液を作製 した。次に作製した懸濁液を 80°Cで 30分間加熱した上で 5000G30分間、遠心分離し 上清 2.6Lを回収した。この上清を 45°Cで減圧濃縮し、濃縮液 0.52Lを得た。この濃縮 液をスプレードライヤーで乾燥し粉末 (エキス粉末 A)を得た。得られた粉末の重量は 1 21gであり、その粉末に含まれるタンパク質の割合は 24.2%であった。
2.ォキアミ殻乾燥物からの抽出
ォキアミから殻を分離し乾燥した上で粉砕し、ォキアミ殻乾燥物を得た。得られたォ キアミ殻乾燥物 lkgに対して水道水 7Lをカ卩ぇ懸濁液を作製した。次に作製した懸濁 液を 80°Cで 30分間加熱した上で 5000G、 30分間、遠心分離し上清 4.7Lを回収した。 この上清を 45°Cで減圧濃縮し、濃縮液 0.86Lを得た。この濃縮液をスプレードライヤ 一で乾燥し粉末 (エキス粉末 B)を得た。得られた粉末の重量は 124gであり、その粉 末に含まれるタンパク質の割合は 10.6%であった。
[0038] 前記エキス粉末 Aおよび Bの SDS-ポリアクリルアミド電気泳動分析を行った。エキス 粉末 Aには分子量 37kDaのタンパク質力 S、エキス粉末 Bには 16kDa及び 15.4kDaのタ ンパク質が含まれていることが確認された。 （図 10)
<エキス粉末 A及び Bの不凍活性の測定 1 >
エキス粉末 Aおよび Bの不凍活性の観察を行った。エキス粉末を蒸留水に懸濁後、 エタノール沈澱処理により脱塩を行った上で熱ヒステレシスをォスモメーターにより測 定した。両エキス粉末共にタンパク質濃度依存的に熱ヒステレシスが上昇しているこ とが確認された（図 11)。以上の結果から、上記の抽出方法で製造したォキアミ由来 エキス粉末には不凍活性を有するタンパク質が含まれていることが示された。また、 表 2に示したように lmg/ml当たりの熱ヒステレシスを比較するとォキアミ殻乾燥物から 抽出したエキス粉末 Bの不凍活性がエキス粉末 Aと比較して 3倍程度不凍活性が強 レ、ことが観察された。
[0039] [表 2]
Figure imgf000014_0001
<エキス粉末 A及び Bの不凍活性の測定 2 >
ォキアミ由来エキス粉末による氷結晶の成長抑制効果を顕微鏡により観察した。顕 微鏡に設置した冷却ステージ内にエキス粉末を蒸留水に懸濁した上で 2枚のカバー ガラスで挟みこむようにアプライした。冷却ステージ内の温度を 30°Cまで下降させ 一旦懸濁液を凍結させた上で 0°C付近まで昇温させて氷結晶のつぶを作製した。次 に C/minの速度で冷却ステージ内の温度を低下させて、温度低下に伴い成長する 氷結晶の様子を観察した。ォキアミホール由来エキス粉末 A、ォキアミ殻由来エキス 粉末 Bの懸濁液を使用した場合、共に図 12、 13に示したように氷結晶の成長が抑制 されて六角平面状の氷結晶が観察された。よってこれら両エキス粉末が氷結晶成長 抑制効果を有してレ、ること力 S示された。
<エキス粉末 A及び Bの氷結晶の再結晶化阻害活性の測定 >
ォキアミ由来エキス粉末による氷結晶の再結晶化制御効果を観察した。すなわち、 30%スクロース溶液に溶解した本タンパク質試料 2 a 1をカバーガラス上に滴下し、さ らにその上にカバーガラスを乗せて挟み、光学顕微鏡 (ォリンパス社製 BH2型）のス テージに乗せ温度制御装置（リンカム社製 LK600)により冷却ステージ内の温度を 2 0。C、— 30。C、 20。C、— 30。C、 20。C、— 30。C、— 10。Cの順に 0. 1。C/秒で冷却、 加熱を繰り返した後、—10°Cで 30分保持し、 10. 01〜35 μ πι2の面積を有する氷結 晶を微小氷結晶として数えた。図 14に示したようにォキアミホール由来エキス粉末 A では濃度 0.001%をピークに、ォキアミ殻由来エキス粉末 Bでは濃度依存的に再結晶 化阻害活性を有することが確認された。
く南極ォキアミ乾燥粉末力 の不凍活性を有するタンパク質の抽出 '精製〉 南極ォキアミ乾燥粉末 5gに対して 20mM Tris-HCl ( H 7.5) pPMSF ImMを含む抽 出液 50mlを加え、懸濁後、 90°Cで 30分抽出した。その後、この懸濁液を 10,000 X gで 30分間遠心分離を行レ、、上清を得た。これを 20mM Tris-HCl (pH 7.5)で平衡化した Superdex G30 (GE Healthcare)に供し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。このとき 図 15に示すクロマトグラムの溶出量 8〜10ml (図 15 A)及び 18〜20ml (図 15 B)の画 分に不凍活性を有するタンパク質が存在することを温度制御装置と顕微鏡を用いた 、氷結晶の形状変化で確認した。次にこれらの画分を逆相 HPLCに供した。すなわち 、それぞれの画分 20 μ ΐを終濃度 0.1%トリフルォロ酢酸に調整し、 0.1%トリフルォロ酢 酸で平衡化した ODSカラム（Mightysil RP-18 GP、 150-4.6mm)を装着した高速液体 クロマトグラフィー（JASCO PU-1580、 UV-1570、 DG-1580_53、 HG-1580_32、 CO—1 565)に供し、 0〜40%ァセトニトリルの直線濃度勾配により、タンパク質を分離.溶出し た。この結果を図 16 (溶出量 8〜10ml画分）、図 17 (18〜20ml画分）に示す。図示し たように、本タンパク質は 2.41、 2.78, 4.11、 6.36, 8.89、 10.00、 17.73、 19.92、 23.70、 26.84、 31.48、 41.65と 2.28、 2.93、 10.44、 28.58、 33.1の保持時間で溶出されるピーク を有していた。
上記逆相 HPLCの測定条件は以下のとおりである。
カラム： Mightysil RP-18 GP、 150-4.6mm
溶離液：
0-10min： 0.1%トリフルォロ酢酸水溶液
10-60min : 0.08%トリフルォロ酢酸、 80%ァセトニトリノレ
流速： 0.8 ml/min.
カラム温度： 25°C
実施例 9
[0040] <ォキアミ由来エキス粉末の添カ卩によるデンプンゲル離水防止効果 >
ォキアミ由来エキス粉末の添カ卩によるデンプンゲル離水防止効果を観察した。馬鈴 薯デンプンを原料として RVA (ラピッドピスコアナライザー）を用いてデンプンゲルを作 製した。 _ 20°Cで凍結した上で、 _ 10°Cで保存し、融解後の離水の様子を観察した 結果、ォキアミ由来エキス粉末を添加することで離水量上昇が抑制されることが確認 された（図 18)。また、 7日間冷凍保存後のデンプンゲルをフリーズドライしたうえで構 造を電子顕微鏡で観察した結果、エキス粉末を添加したデンプンゲルの方が無添カロ のゲルと比較してきめ細かい構造をとっていることが確認された。 （図 19、 20)これは ォキアミ由来エキス粉末がデンプンゲルの冷凍保存中の氷結晶の成長を抑制し、デ ンプンゲルの冷凍保存中の劣化を抑制しているためであると考えられる。
実施例 10
[0041] <水産物への応用ースケソゥタラ落とし身への添加一 >
三陸沖で漁獲された鮮魚であるスケソゥタラから肉を採取し、 3mmメッシュのミンサ 一で挽肉状にした。それを 500g取り、水 50g、砂糖 50gを加え、さらにエキス粉末 B をそれぞれ 0〜0· 1%になるように加え、卓上ミキサーで 25秒間攪拌した。これを落 とし身サンプノレとして使用した。次にそれぞれを一 25°Cで一晩凍結し、その後一 10 °Cで 2週間保存したものを保存性評価の指標となる塩溶解性、 TMAO分解度の測 定用に用いた。
溶解'卜牛の洵 I
落とし身 3gに 0.1M KC1 20mM Tris_HCl(pH7.5)溶液を 27ml加え、ホモジナイズした (10,000卬 m X 30秒 3回）、その後、 5, 000卬 m X 10分間の遠心分離を行レ、、沈殿物 を得て、さらにその沈殿物に 0.5M KC1 20mM Tris_HCl(pH7.5)を 27ml加えて攪拌す る。再び 5, 000卬 m X 10分間の遠心分離を行い、得られた沈殿物に 0.5M KC1 20mM Tris_HCl(pH7.5)溶液を 27ml加えて攪拌し、 1M ATP30 μ 1加えて一晚氷蔵下で保存 する。その後攪拌し、ビウレット法にてその懸濁溶液の蛋白質濃度と容量を測定して おく。さらに懸濁溶液は7，000 111 15分間遠心分離を行レ、、得られた上澄みの蛋白 質濃度をビウレット法で測定し、併せて容量も測定した。以上の測定より、先の上澄 み中の蛋白質量と懸濁液中の蛋白質量の比から塩溶解性を算出した。その結果、 図 21に示すように塩溶解性についてはエキス粉末 Βの添カ卩量とともに増加しており、 エキス粉末 Βの添加により冷凍保存時のスケソゥタラ落とし身の品質劣化が抑制され る傾向が示された。
ΤΜΑΟの分解反応の測定
落とし身サンプル 10gに対して蒸留水 10ml、 10%トリクロ口酢酸（TCA) 10mlを加え てホモジナイズする（12,000卬 m X 2分間）。その後遠心分離（7,500 X 20分）して上澄 みを得る。沈殿物には 5%TCA溶液を 5ml加えよく攪拌し、遠心分離を行い上澄みを 得る。この操作を 2回行レ、、ここまで得られた上澄みを 50mlメスフラスコに加え、さらに 5%TCA溶液でメスアップし、これを TCA抽出液とする。
TCA抽出液 lmlと蒸留水 3mlを混合し、銅—アンモニア試薬 0.4ml、 5。/。二硫化炭素— ベンゼン溶液を添カ卩し、 40°C 5分間インキュベートした。その後、振とうを繰り返し、 遠心分離 (3,500 X 5分）を行レ、、得られた上澄みに対して無水硫酸ナトリウム約 0.2g 入りの試験管に移し、その溶液を 440nmで吸光値を測定する。生成する DMA量は次 の式で表される。 DMA量 (mM)= (440nm測定値） ÷ 1 ·3 X 2 X 50 ÷ 1000 ÷ (サンプル重量） X 1000
ΤΜΑΟの分解による DMAの生成量は図 22に示すようにエキス粉末 Βの添加量とと もに低下していくことが示された。エキス粉末 Βの添加により ΤΜΑΟが分解され DMA と同等量のホルムアルデヒドが生じる。 DMAの生成量が抑制されたことは、ホルムァ ルデヒドの生成が抑制されたことを意味し、ホルムアルデヒドによる冷凍保存時のスケ ソゥタラ落とし身の冷凍変性が抑制されることを示す。
実施例 11
[0042] <食品への応用 >
1.うどん
うどんを表 3に示す配合 (この配合により、添カ卩品はうどん中に本タンパク質試料 2を 0.00036%含有する）で混合、混捏し圧延後、ビニールで麵帯を包み、室温下で 1時 間熟成した。その後、さらに圧延し、切り出しを行い、沸騰水中で 10分間茹でた。そ の後流水中で 5分間冷却し、ざるに移し、 5分間水切り後、 20°Cで 1晚凍結した。そ の後、 10°Cへ移し 2週間凍結保存した。室温下で約 2時間自然解凍を行い、その 食感について評価した。またコントロールとして本発明のタンパク質を含まないうどん を作成して比較を行った。その結果、表 3のように本タンパク質試料 2を含むうどんは コントロールと比較して、麵の表面が滑らかであり、かつモチモチした食感で弾力が あった。
[0043] [表 3]
Figure imgf000018_0001
2.炊飯米 表 4に示す配合 (この配合により、添力卩品は炊飯米中に本タンパク質試料 2を 0.000 36%含有する）で炊飯米を作成し評価を行った。精白米（きらら 397 H17年産米） に対して 1. 35倍量の水を加えて家庭用の炊飯器を用いて炊いた。炊飯後、 30分間 蒸らした後、 20g X 10個の寿司の押し型で成型した。その後、 _ 20°Cで 3日間凍結 後、一 10°Cへ移し 5日間凍結保存した。評価は室温下で約 2時間自然解凍を行い、 食感を評価した。その結果、表 4に示すようにコントロールに比べて、添加品は粘りが あり、食味が良好であった。
[表 4]
Figure imgf000019_0001
3.茶碗蒸し
茶碗蒸しを表 5に示した配合 (この配合により、添加品は茶碗蒸し中に本タンパク質 試料 2を 0.00033%含有する）で作成し評価を行った。材料を混合した後、耐熱容器 に 60gずつ加え、蒸し器に入れ、蒸した。室温下で粗熱を取った後、 20°Cで 3日間 凍結し、 10°Cで 5日間凍結保管した。評価は蒸し器で 10分間蒸して食感を評価し た。
その結果、コントロールに比べて添カ卩品は"す"が入らず、食感も滑ら力、なものであり、 またドリップもなく良好な食味であった。
[表 5] 茶碗蒸し配合 比較品 添加品 卵
だし（顆粒）
食塩 …一…..3g—一… ―.3g
…一…..3g…—一 3g 水 467g 407g 実施例 2の凍結乾燥品の 10%溶液 60g 滑らかさ Δ 〇 鬆（す）の状況 X O 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質は、ミール、キチン、キトサン原料に利用される以外はその大半 が廃棄される甲殻類の殻に多く含まれるために、大量調製が可能で、かつ安価に生 産することが出来る。また、食品由来のタンパク質であるから食品への添カ卩に応用し
;0 CO 0：
やすい。本発明のタンパク質は、不凍活性、氷結晶の再結晶化ひ W.阻害活性を有するの で、冷凍食品等の品質保持などの目的に広く利用が可能である。
[配列表フリーテキスト]
配列番号： 1 o O;
N末端アミノ酸配列
配列番号： 2
N末端アミノ酸配列
配列番号： 3
N末端アミノ酸配列
配列番号: 4
N末端アミノ酸配列
[配列表]
く丄丄 0〉 Nippon uisan Kaisha Ltd.
く 120〉 不凍活性を有する甲殻類由来タンパク質
く 130〉 YCT-1258
く 141〉 2007-03-13 く 150〉 JP 2006-67758
く 151〉 2006-03-13
く 160〉 4
く 210〉 1
く 211〉 20
く 212〉 PRT
く 213〉 南極ォキアミ (Euphausiacea sp.)
く 400〉 KYGGEFPARPDNIXFENVDG (一文字記号）
Lys Ί yr Gly Gly lu Phe Pro Ala Arg Pro Asp Asn lie Xaa Phe ulu
Asn Val Asp Gly (三文字記号） く 210〉 2
く 211〉 19
く 212〉 PRT
く 213〉 南極ォキアミ (Euphausiacea sp.)
く 400〉 TTYKYGGEFPARPDNXXFE (一文字記号）
Thr Thr Tyr Lys Tyr Lrly Lrly Glu Phe Pro Ala Arg Pro Asp Asn Xaa
Xaa Phe Glu (三文字記号）
く 210〉 3
く 211〉 20
く 212〉 PRT
く 213〉 南極ォキアミ (Euphausiacea sp.)
く 400〉 DYDVAHEQQDVNAFLTKITG (一文字記号）
Asp Tyr Asp Val Ala His Glu Gin Gin Asp Val Asn Ala Phe Leu Thr
Lys He Thr Gly (三文字記号) 20
く 210〉 4
く 211〉 18
く 212〉 PRT
く 213〉 南極ォキアミ (Euphausiacea sp.)
く 400〉 SDPKFQQDINTRLXNVYE (一文字記号）
¾er Asp Pro Lys Phe uln ln Asp lie Asn i'hr Arg Leu Xaa Asn Val
Glu (三文字記号)

Claims

請求の範囲
[1] 甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質。
[2] 甲殻類由来のタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリルアミド電 気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約 37,000、約 16,000及び/又は約 15,4 00の分子量であり、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示されるタンパク質である請 求項 1の不凍活性を有するタンパク質。
[3] 甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属する ものである請求項 1又は 2の不凍活性を有するタンパク質。
[4] 甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質を含む不凍活性を有する甲殻類抽出 物。
[5] 甲殻類由来の不凍活性を有するタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポ リアクリルアミド電気泳動法による分子量測定で、還元条件下、約 37,000、約 16,000 及び/又は約 15,400の分子量であり、 N末端アミノ酸が配列番号 1又は 2で示される タンパク質である請求項 4の不凍活性を有する甲殻類抽出物。
[6] 甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属する ものである請求項 4又は 5の不凍活性を有する甲殻類抽出物。
[7] 甲殻類の殻、肉及び Z又は内臓力 熱水抽出することを特徴とする不凍活性を有 する甲殻類抽出物の製造方法。
[8] 熱水抽出を 60°C以上の熱水を用いて行う請求項 7の不凍活性を有する甲殻類抽 出物の製造方法。
[9] 甲殻類の肉及び Z又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び/又は内臓の 抽出液を加熱処理及び Z又は還元処理することを特徴とする不凍活性を有する甲 殻類抽出物の製造方法。
[10] 甲殻類の肉及び Z又は内臓を圧搾して得た体液、又は、殻、肉及び/又は内臓の 抽出液が、抽出液に含まれるドデシル硫酸ナトリウム（SDS)—ポリアクリルアミド電気 泳動法による分子量測定で、非還元下では約 200,000の分子量であり、還元した場 合、約 86,000のバンドと約 90,000のバンドを示し、 N末端アミノ酸が配列番号 3又は 4 で示されるタンパク質を精製及び/又は濃縮したものである請求項 9の不凍活性を 有する甲殻類抽出物の製造方法。
[11] 甲殻類の殻、肉及び/又は内臓力 界面活性剤を添加した抽出液で抽出すること を特徴とする請求項 9又は 10の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
[12] 加熱処理が 60°C以上にすることであり、還元処理が還元剤を添カ卩することである請 求項 9、 10又は 11の不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方法。
[13] 甲殻類が、ェビ類、ザリガニ類、力二類、ォキアミ類、シヤコ類のいずれかに属する ものである請求項 7ないし 12いずれかの不凍活性を有する甲殻類抽出物の製造方 法。
[14] 請求項 1ないし 3いずれかの不凍活性を有するタンパク質、請求項 4ないし 6いずれ 力、の不凍活性を有する甲殻類抽出物、又は、請求項 7ないし 13いずれかの方法で 製造した不凍活性を有する甲殻類抽出物を含む食品の品質改良剤。
[15] 請求項 14の品質改良剤を添加したことを特徴とする品質改良された食品。
[16] 食品が冷凍食品である請求項 15の食品。
[17] 食品が卵、小麦粉、又は、魚肉を材料として使用する食品である請求項 15又は 16 の食品。
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