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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Induzieren der Nukleation in einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Erfindung auf ein System zum Induzieren der Nukleation in einer Probe, wobei die Nukleation automatisch durch Einbringen eines externen Elementes ausgelöst wird.
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Stand der Technik
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Durch Kryotechnik und Kryokonservierung werden Proben, insbesondere biologische Proben, wie Zellen und Gewebe, bei tiefgehaltenen Temperaturen gelagert. Dabei sollen nach dem Wiedererwärmen die Vitalität, die Funktion und die Morphologie der Proben erhalten bleiben. Insbesondere bei biologischen Proben wird angestrebt, die Vitalität und Morphologie des kryokonservierten Materials zu erhalten. Beim Kühlen dieser Proben spielt unter anderem die Temperatur der beginnenden Eiskristallbildung, die sogenannte Nukleationstemperatur, eine wichtige Rolle. So zeigten Studien, dass eine induzierte Nukleation bei hohen Nukleationstemperaturen zu hohen Überlebensraten des biologischen Materials in der Probe führen.
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Die Kryomikroskopie bietet die Möglichkeit unter kontrollierten thermischen Bedingungen eine Vielzahl von Gefrierprozessen zu untersuchen. Für die Kryokonservierung werden thermische Effekte im biologischen Material betrachtet. Die Krymikroskopie erlaubt die Untersuchung des Gefrierprozesses und damit auch die Optimierung der Kryokonservierung von Proben, insbesondere biologischen Proben.
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Zur Optimierung der genannten Eigenschaften, insbesondere zur Erhöhung der Vitalität, Funktionalität und Morphologie nach Wiedererwärmen werden den Proben z. B. Gefrierschutzmittel, sogenannte Kryoprotektiva, hinzugefügt. Allerdings haben die üblicherweise verwendeten Kryoprotektiva den Nachteil, dass sie in hohen Dosierungen zelltoxische Eigenschaften aufweisen. Entsprechend müssen Untersuchungen durchgeführt werden, um die Zellsterblichkeit durch Einfrieren und durch die Kryoprotektiva zu minimieren.
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Ein weiterer Faktor, der die Wiederverwendbarkeit der Proben beeinflusst, ist die Abkühlungsgeschwindigkeit der Probe. Ein weiterer wichtiger Parameter bei der Konservierung ist der Zeitpunkt der ersten Eiskeimbildung, die sogenannte Nukleation, die ebenfalls die Eigenschaften der Proben, insbesondere Vitalität, Funktionalität und Morphologie von biologischen Proben, beeinflusst und entsprechend jeweils einzeln bestimmt werden muss. Es ist dabei zu beachten, dass durch die Eisbildung von Wasser die Strukturen nicht zu stark zerstört werden.
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Es wurden verschiedene Methoden zur induzierten Nukleation von wasserhaltigen Proben beschrieben. Darunter fallen chemische Methoden mit Silberjodid, Cholesterin, siehe z. B.
WO 2007/149847 , aber auch Proteine,
WO 2007/105734 .
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Kryospeichereinrichtungen zur Speicherung von Probendaten und Kryokonservierungseinrichtungen zu deren Verfahren sind z. B. in der
DE 10 2007 025 091 beschrieben. Weiterhin sind Kryokonservierungsverfahren durch elektrisch induzierte Eiskeimbildung und ihre Anwendung in der Kryobiologie beschrieben.
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Problematisch bei diesen herkömmlichen manuellen Verfahren zur Induktion der Nukleation ist, dass die Nukleationstemperatur vor allem bei hohen Kühlraten nicht exakt einstellbar ist. Weiterhin sind bei manchen Ansätzen, insbesondere bei den chemischen Methoden nur durch diese Verbindungen vorgegebenen Nukleationstemperaturen möglich. Es ist nicht möglich, die Nukleation in einem größeren Bereich bei einer bestimmten Temperatur auszulösen. Aufgrund der nicht exakt einstellbaren Nukleationstemperatur kann eine hohe Abweichung von der Sollnukleationstemperatur auftreten, was zu einer Verschlechterung in der Überlebensrate der biologischen Proben führt. Gleiches gilt für nicht optimale Kühlratenverläufe, d. h. bisher mussten meist während der Nukleation die Temperaturen konstant gehalten werden, was zu nicht optimalen Gefrierverläufen führt und bedeutet, dass die Zellen in den biologischen Proben sterben. Ein weiteres Problem stellte sich dadurch, dass bei der manuellen Nukleation der Zugang zur Probe nicht möglich ist, z. B. bei Untersuchung der Gefriervorgänge mittels Kryomikroskopie. Bei der manuellen Nukleation musste bisher das Objektiv des Mikroskops von der Probe weggeschwenkt werden. Außerdem war die Zugabe nur durch Störung der Schutzgasatmosphäre möglich. Dadurch konnten aber weitere externe Faktoren (Umweltbeeinflussung) auf die Kryokonservierung einwirken.
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Ziel ist daher ein Verfahren bereitzustellen, das die oben genannten Nachteile überwindet. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf ein System, das insbesondere zum Einsatz in der Kryomikroskopie geeignet ist und die Nukleationsinduktion erleichtert.
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Beschreibung der Erfindung
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Diese Aufgaben werden durch Verfahren und Systeme mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Die vorliegende Erfindung beruht auf die Durchführung der Induktion der Nukleation bei vorbestimmten Nukleationstemperaturen durch automatische Induktion der Nukleation mit Hilfe eines externen Elementes, wobei dieses externe Element auf eine Temperatur unter 4°C, bevorzugt unter 0°C gekühlt ist.
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D. h., in einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zum Induzieren der Nukleation in einer Probe, bevorzugt einer biologischen Probe, durch ein externes Element, umfassend
- – das Bereitstellen der Probe in einer Frierkammer mit Vorrichtungen zum geregelten Kühlen der Frierkammer und einem Sensor zum Messen der Temperatur der Probe in dieser Kammer;
- – Bereitstellen eines externen Elements, das automatisch bewegt werden kann und das mit Hilfe eines Kühlsystems auf eine Temperatur unter 4°C, bevorzugt unter 0°C gekühlt ist;
- – Kühlen der Probe in der Frierkammer und Bestimmen der Temperatur der Probe in der Frierkammer,
dadurch gekennzeichnet, dass zum Induzieren der Nukleation das externe Element bei einer vorbestimmten Temperatur der Probe automatisch mit der Probe in Kontakt gebracht wird.
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Es wurde festgestellt, dass durch die automatische Auslösung der Nukleation während des Kühlens einer Probe die Nukleation bei einer vorbestimmten gewünschten Nukleationstemperatur aus einem breiten Temperaturbereich eingeleitet werden kann. Diese Nukleationstemperatur kann dabei z. B. bei Kryomikroskopen automatisch und reproduzierbar kontrolliert werden, so dass eine verbesserte Induktion der Nukleation in einer Probe, insbesondere biologischen Probe, erreicht werden kann.
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Im Gegensatz zu den Verfahren des Standes der Technik, wo die Nukleation nur zu bestimmten Temperaturen möglich ist, z. B. bei Einsatz von Silberjodid oder entsprechenden anderen chemischen Mitteln, ist es vorliegend möglich die Nukleationstemperatur über einen breiten Temperaturbereich auszuwählen und entsprechend den Nukleationsvorgang einzuleiten.
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Der Anwender definiert dabei einen Wert, im Folgenden auch Schwellenwert genannt, an dem die Nukleation erfolgen soll. Sowie der Wert in der Frierkammer erreicht wird, wird die Nukleation durch das Inkontaktbringen des externen Elements mit der Probe automatisch ausgelöst.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Element dabei ein externes Element, das auf unter 4°C, bevorzugt unter 0°C gekühlt ist. Dieses externe Element ist bevorzugt ein stabförmiges Element oder nadelförmiges Element, bevorzugt aus Metall, wie ein Metalldraht, eine Metallspitze oder Metallnadel.
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Das externe Element ist in einer bevorzugten Ausführungsform auf eine Temperatur unterhalb des gewählten Schwellenwerts zur Nukleation gekühlt.
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Bevorzugt wird dabei das externe Element automatisch mit Hilfe eines Motors, z. B. eines Schrittmotors, in Kontakt mit der Probe gebracht.
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Durch den Motor und dessen bevorzugt softwaregesteuerte Auslösung ist es möglich reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen und gute Kryoprotokolle erstellen zu können. Im Gegensatz zu bisher bekannten Verfahren lässt sich so der Nukleationsvorgang automatisch und kontrolliert auslösen. Der Anwender kann dabei die Nukleationstemperatur als Schwellenwert vorab einstellen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung ist das erfindungsgemäße Verfahren dabei eines, das weiterhin eine Kalibrierung des Systems aus externem Element und Frierkammer mit Probe umfasst. Diese Kalibrierung erfasst die Länge und Position des externen Elementes bevorzugt in Bezug auf die Probe vor dem Inkontaktbringen mit der Probe selbst. Durch Kalibrierung wird sichergestellt, dass der Kontakt zwischen dem externen Element und der Probe zum gewünschten Zeitpunkt erfolgt und somit der Nukleationsvorgang ausgelöst wird.
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Bevorzugt umfasst dieses Kalibrierungssystem dabei einen Objektsensor, der eine Bilderfassung oder Objekterfassung in anderer Art und Weise erlaubt.
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Bevorzugt wird zur Kalibrierung ein Bilderfassungssystem eingesetzt. Dieses Bilderfassungssystem wird zur Steuerung des Motors zum Einbringen des externen Elementes in die Probe verwendet. Der Objektsensor kann daher eine Kamera oder andere Einrichtungen zur Objekterfassung beinhalten.
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In einer weiteren Ausführungsform ist das Verfahren eines, wobei in einer Steuereinheit ein Schwellenwert für die bestimmte Nukleationstemperatur eingestellt wird und dieser Schwellenwert mit der tatsächlichen Temperatur der Probe in dieser Kammer verglichen wird. Bei Erreichen des Schwellenwertes wird durch die Steuereinheit automatisch das externe Element mit der Probe zur Reduktion der Nukleation in Kontakt gebracht.
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Bevorzugt ist das Verfahren eines, wobei das externe Element, insbesondere eine gekühlte Metallspitze, automatisch zur Probe mit Hilfe eines Schrittmotors, der bevorzugt vorab kalibriert wurde, mit Schlitten und einer Spindel mit der Steuereinheit bewegt wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt dabei, die Induktion der Nukleation in einem geschlossenen System, insbesondere unter Schutzgasatmosphäre. Dabei kann die Probe kontinuierlich visualisiert werden. Die Schutzgasatmosphäre in der Probe bleibt erhalten und Umwelteinflüsse aufgrund des Öffnens oder Schließens des Systems werden vermieden.
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Das Verfahren ist insbesondere dazu geeignet, die Nukleation in einem Bereich von –4°C bis –30°C auszulösen. Natürlich kann die Nukleation auch in einem noch tieferen Bereich induziert werden. Weiterhin ist bevorzugt, dass das gekühlte externe Element mit einer geeigneten Einrichtung gekühlt wird, z. B. einem Wärmetauscher. Dieser Wärmetauscher, z. B. ein Wärmetauscher für Flüssigstickstoff, erlaubt ein rasches Herunterkühlen des externen Elementes.
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Das erfindungsgemäße System zum Induzieren der Nukleation in einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe, umfasst dabei eine Frierkammer zum Aufnehmen der Probe mit einem Sensor zum Messen der Temperatur der Probe, eine Vorrichtung zum Inkontaktbringen eines auf unter 4°C, bevorzugt unter 0°C gekühlten externen Elementes mit einer Probe in der Frierkammer und eine Steuerungseinheit zur Steuerung der Bewegung des externen Elements. Bevorzugt umfasst das System weiterhin einen Objektsensor zur Erfassung und gegebenenfalls Kalibrierung des externen Elements bevorzugt in Bezug auf die Probe in der Frierkammer. Der Objektsensor kann dabei ein Sensor zur Bilderfassung oder andere geeignete Sensoren zur Erfassung der Position des externen Elementes und entsprechender Kalibrierung hiervon insbesondere in Bezug auf die in der Frierkammer vorliegenden Probe sein. Weiterhin kann das System einen Wärmetauscher zum Kühlen des externen Elementes aufweisen. dieser Wärmetauscher ist bevorzugt einer unter Verwendung von Flüssigstickstoff. Die Frierkammer ist ebenfalls bevorzugt eine Frierkammer, die zur Kühlung mit Flüssigstickstoff geeignet ist. Der Objektsensor kann dabei so angeordnet sein, dass er nach Kalibrierung wieder entfernbar angeordnet ist. D. h., der Anwender kann nach Kalibrierung des Systems den Objektsensor durch verschwenken oder durch entfernen aus dem Bewegungsbereich des externen Elements entfernen.
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Das System enthält weiterhin bevorzugt eine Abdeckung der Frierkammer. Diese Abdeckung ist dabei so ausgebildet, dass sie ein Einbringen oder Bewegen des externen Elementes unter Aufrechterhaltung der Atmosphäre unter dieser Abdeckung erlaubt. Bei dieser Atmosphäre handelt es sich bevorzugt um eine Schutzgasatmosphäre. Durch die entsprechende Ausbildung der Abdeckkammer der Frierkammer ist es möglich, externe Einflüsse auf die Nukleation durch Öffnen der Kammer und damit durch Stören der Schutzgasatmosphäre zu vermeiden. Weiterhin ist es möglich, durch die entsprechende Ausbildung der Abdeckung den Nukleationsvorgang kontinuierlich im Kryomikroskop zu beobachten.
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Das System gemäß der vorliegenden Erfindung ist weiterhin bevorzugt eines mit einer Steuereinheit. Diese Steuereinheit umfasst eine computerlesbare Speichereinheit umfassend ein Programm zur Steuerung des Inkontaktbringens des externen Elementes mit der in der Frierkammer vorliegenden Probe nach Erreichen eines vorgegebenen Schwellenwertes, der der Nukleationstemperatur entspricht.
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Das erfindungsgemäße System ist insbesondere eines, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildet ist. In einer weiteren Ausführungsform ist das System weiterhin eines, dass ein Mikroskop geeignet zur Durchführung von Kryomikroskopie umfasst.
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Schließlich richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Computerprogramm mit Programmcodemitteln eingerichtet, insbesondere auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn das Computerprogramm auf einem Rechner z. B. auf einer Steuereinheit ausgeführt wird.
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Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen und die beigefügten Zeichnungen erläutert. Es zeigen:
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1 – ein Fliesdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens;
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2 – eine Anordnung des erfindungsgemäßen Systems.
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In der 1 wird die Steuerung des Systems dargestellt. Die Sollnukleationstemperatur wird in der Steuereinheit mit der Kontrollsoftware eingestellt. Gegebenenfalls kann diese Software auch die Kühlung der Probe steuern. Die Ist-Temperatur der Probe in der Frierkammer wird mit Hilfe eines Sensors bestimmt und der Steuereinheit übermittelt. Die Steuereinheit vergleicht dann die Ist-Probentemperatur mit der Sollnukleationstemperatur und berechnet weiterhin den optimalen Zeitpunkt für das Inkontaktbringen des externen Elements, vorliegend als Nukleator bezeichnet, mit der Probe, um eine aktive Nukleation durchzuführen. Bei Erreichen der Soll-Nukleationstemperatur, dem Schwellenwert, löst die Steuereinheit ein Startsignal aus, um das externe Element mit der Probe in Kontakt zu bringen. Hierdurch findet die aktive Nukleation statt. Als Eingangsparameter werden dabei der Steuereinheit die Sollnukleationstemperatur, der Schwellenwert, eingegeben. Die Steuerungseinheit benötigt weiterhin die Ist-Probentemperatur. Gegebenenfalls kann zusätzlich die Kühlung der Probe gesteuert werden. Bei Kalibrierung des Nukleators ist die Kontrollsoftware dabei in der Lage das externe Element zum Zeitpunkt des Erreichens des Schwellenwertes mit der Probe in Kontakt zu bringen.
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In der 2 wird ein erfindungsgemäßes Systems dargestellt. Dieses System zum Induzieren der Nukleation in einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe, umfasst dabei eine Frierkammer 1 zum Aufnehmen der Probe mit einem Sensor zum Messen der Temperatur der Probe. Diese Frierkammer weist des Weiteren einen Deckel 2 auf. Dieser Deckel 2 ist derart ausgebildet 2a, dass sie die Führung des externen Elements 3 in die Frierkammer 1 erlaubt. Diese Führung des externen Elements in die Frierkammer erfolgt dabei bevorzugt derartig, dass die in der Frierkammer vorliegende Schutzgasatmosphäre nicht gestört wird. Weiterhin dargestellt ist die Vorrichtung 4 zum Inkontaktbringen eines gekühlten externen Elements 3 mit der Probe in der Frierkammer 1. Diese Vorrichtung 4 umfasst einen Schrittmotor 5 und einen Schlitten 6, der über eine Spindel 7 mit dem Schrittmotor 5 verbunden ist. Über den Schlitten 6 wird das gekühlte externe Element 3 geführt, um mit der Probe in der Frierkammer 1 in Kontakt gebracht zu werden. Die Kühlung des externen Elementes erfolgt dabei über einen Wärmetauscher 8. Dieser Wärmetauscher 8 kann z. B. mit Flüssigstickstoff arbeiten. Gleiches gilt für die Frierkammer 1.
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Weiterhin dargestellt ist der Objektsensor 9 zur Kalibrierung des Systems. Vorliegend wird eine Kamera verwendet. Mit Hilfe z. B. einer USB-Kamera ist eine Bilderkennung möglich. Diese Bilderkennung erlaubt das Erkennen der Spitze des gekühlten externen Elementes und erlaubt die Kalibrierung des Systems.
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Das externe Element 3 wird dabei mit Hilfe des Schrittmotors 5 des Schlittens 6 und einer Spindel 7 in Kontakt mit der Probe bei Erreichen des Schwellwertes gebracht. Weiterhin dargestellt sind die Anschlüsse 10 für die Kühlung der Frierkammer 1 und des Wärmetauschers 8. Die Kühlung kann z. B. durch Flüssigstickstoff erfolgen. Die Vorrichtung 4 kann dabei verschiebbar auf einer Einrichtung 11 ausgebildet sein. Diese Einrichtung 9 mit der Einrichtung 4 und der Frierkammer 1 ist dabei bevorzugt so ausgebildet, dass diese auf einem geeigneten Mikroskop montiert werden kann.
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Die Steuerung des erfindungsgemäßen Systems erfolgt bevorzugt über eine Steuereinheit. Diese kann nach Erreichen des vorbestimmten Schwellenwerts automatisch das externe Element 3 mit der Probe zur Induktion der Nukleation in Kontakt gebracht wird. Die Steuereinheit weist dabei bevorzugt eine computerlesbare Speichereinheit auf umfassend ein Programm zur Steuerung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Frierkammer
- 2
- Deckel
- 2a
- Deckelausbildung
- 3
- externes Element
- 4
- Vorrichtung
- 5
- Schrittmotor
- 6
- Schlitten
- 7
- Spindel
- 8
- Wärmetauscher
- 9
- Objektsensor
- 10
- Anschlüsse
- 11
- Einrichtung
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2007/149847 [0006]
- WO 2007/105734 [0006]
- DE 102007025091 [0007]
