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Verfahren zum automatischen Gefrieren eines insbesondere biologischen
Materials.
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum automat;-schen Gefrieren
eines in einer Schutzlösung suspendierten Gefriergutes, insbesondere eines biologischen
Materials, entsprechend dem Oberbegriff des Anspruches 1. Die Erfinddung betrifft
ferner eine Vorrichtung zum automatischen Gefrieren.
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Anwendungsgebiet: Biologisches Material (lebende Zellen) ist bei Temperaturen
unter -120°C nahezu unbegrenzt haltbar. Bei dieser sogenannten Kryokonservierung
werden die Zellen in einer Schutzlösung eingefroren und in flüssigem Stickstoff
bei -196 0C aufbewahrt. Wenn der Einfrierprozeß richtig durchgeführt wird, leben
die Zellen nach einem geeigneten Auftauvorgang ohne Schädigung weiter.
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Das Verfahren nach der Erfindung dient zum programmgesteuerten Tiefgefrieren
und Auftauen von biologischem Material wie Gewebe-, Knochenmark-, Tumor- und Blutzellen,
LymphozWten, Thrombozyten, Bakterien und Viren, Pflanzenzellen, Spermien, Eizellen
und Embryonen und ist - vor allem durch eine direkte Regelung der Temperatur des
Gefriergutes in Verbindung mit einer selbsttätigen, optisch überwachbaren und extrem
schonenden Auslösung der Kristallisation (seeding) der Schutzlösung besonders für
das vergleichsweise schwierige Tiefgefrieren von tierischen und menschlichen Embryonen
geeignet. Der Gefriervorgang ist an das jeweils vorliegende biologische Material
angepaßt. Ein das suspendierte Gefriergut enthaltender Gefriergutbehälter wird in
ein Kühlmedium enthaltendes Kühigefäß eingeführt.
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Die Kühlmedium-Temperatur in der Umgebung dieses Behälters wird auf
die gewünschte, unterhalb der Kristallisationstemperatur der Schutzlösung liegende
Temperatur abgesenkt,
wobei der Phasenübergang der verwendeten Schutzlösung
vom flüssigen in den festen Aggregatszustand (Kristallisation) besonders kritisch
ist. Durch die freiwerdende Kristallisationswärme kann nämlich eine unzulässige
Erwärmung des Gefriergutes auftreten, die zu einer erheblichen Verringerung der
Oberlebensraten der Zellen führt.
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Stand der Technik: A) Kammer-Gefrieranlagen Das Einfrieren von biologischem
Material wird bisher vornehmlich in Kammer-Gefrieranlagen mit flüssigem Stickstoff
als Kühlmittel durchyeführt. Dabei wird das Gefriergut zusammen mit einer Schutzlösung
(z.B. PBS+DMSO oder Glyzerin) in geeigneten Behältern in eine Gefrierkammer eingebracht,
die durch dosiertes Einspritzen von flüssigem Stickstoff und Heizen derart temperiert
werden kann, daß sich für die Kammer eine gewünschte (z.B. konstante) Abkühlrate
(Tempe raturänderung pro Zeit) ergibt. Nach diesem Prinzip, bei dem die Kammertemperatur
geregelt wird, arbeiten die zur Zeit auf dem markt befindlichen Geräte (z.B. Planer,
Sunbury on Thames/England; Hede Nielson, Horsens/Dänemark; Keltorr, Alkmaar/Niederlande).
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Ohne zusätzliche Maßnahmen zur Beeinflussung der Kristallisation ergibt
sich bei einem Abkühivorgang im Prinzip ein Temperaturverlauf (T) im biologischen
Material nach Fig. 1, falls die Kammertemperatur mit konstanter Steigung abgesenkt
wird. Es wird deutlich, daß hierbei eine starke Unterkühlung (super cooling) der
die biologischen Zellen enthaltenden Schutzlösung bis zu einer Temperatur(Tu)auftritt,
die wesentlich unterhalb der Temperatur (T5 liegt, bei der die Kristallisation einsetzen
könnte, falls Kristallisationskeime in der Schutzlösung vorhanden wären. Die durch
spontan einsetzende Kristallisation freiwerdende Wärme führt zu einem von der Art
der Schutzlösung abhängigen Tem-
peraturanstieg bis zu 10 0C. Um
diesen schädlichen Temperaturanstieg klein zu halten, werden verschiedene Methoden
angewendet, nämlich kurzzeitige starke Absenkung der Kammertemperatur, um die Kristallisationswärme
zu kompensieren oder "Impfen" der Schutzlösung bei bzw. kurz unterhalb der Temperatur
(T5) (seeding-point) mit einem Eiskristall oder kurzzeitige Berührung der Behälter
"im seedingpoint" mit einer in flüssigen Stickstoff getauchten Pinzette. Diese sogenannte
Kontaktauslösung der Kristallisation kann automatisiert werden (Keltorr), führt
jedoch zu schlecht reprodizierbaren Ergebnissen, da in manchen Fällen nicht genügend
Kristallisationskeinie erzeugt werden, in anderen Fällen die Kristallisation zu
heftig einsetzt.
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Eine derartige Gefriervorrichtung enthält: a) ein Kühlgefäß (geschlossene
Kammer) zum Aufnehmen eines Kühimediums (z.B. ein versprühten flüssigen Stickstoff
enthaltendes Gasgemisch), b) eine (starr mit dem Kühlgefäß verbundene) Halteeinrichtung
für mindestens einen die Schutzlösung mit dem Gefriergut enthaltenden Gefriergutbehälter
(in der Regel eine Halterung mit mehreren Behältern), und c) eine Thermostatiereinrichtung
zum Einstellen der Kühlmediumtemperatur in der Umgebung des Gefriergutbehälters
(Dosierventil für den zu versprühenden flüssigen Stickstoff, Heizung und Ventilator
sowie einen Meßfühler für die Kammertemperatur).
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- Durch entsprechende Einstellung der Thermostatiereinrichtung kann
der Temperaturverlauf in der Umgebung des Gefriergutbehälters eingestellt werden.
Die Temperatur des Gefriergutes selbst weicht dabei jedoch zumindest während der
Kristallisation von der eingestellten Temperatur ab.
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Ein grundsätzlicher Nachteil des Kammergefrierverfahrens besteht darin,
daß nicht die Temperatur des Gefriergutes selbst, sondern die Kammertemperatur geregelt
wird. Auf, Grund des relativ trägen Wärmeübergangs kommt es dadurch zu erheblichen
Abweichungen zwischen Kammer- und Gefrierguttemperatur.
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Der technische Aufwand für das Erzielen einer homogenen Temperaturverteilung
in der Kammer sowie eines "glatten" Temperaturzeitverlaufs ist groß (Flüssigstickstoffpumpe,
Sicherheitsventile, Ventilation, Heizung, Thermostat).
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Das manuelle Auslösen der Kristallisation nach einer der oben beschriebenen
Methoden ist umständlich, weil die Kammer geöffnet werden muß (Störung des Temperaturverlaufs),
und schlecht reproduzierbar, da es wesentlich vom Geschick des Experimentators abhängt.
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Bei der automatischen Kontaktauslösung innerhalb der Kammer besteht
die Unsicherheit, daß die Kristallisation ggf.
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nicht in allen Behältern mit Gefriergut ausgeiöst worden ist. Für
eine optische Oberwachung und evtl. notwendige manuelle Auslösung muß ebenfalls
die Kammer geöffnet werden.
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B) Offene Systeme: Ein anderes Kühlprinzip besteht darin, das Temperaturprofil
über flüssigem Stickstoff in einem wärmeisolierten, oben offenen Kamin zu benutzen,
indem das Gefriergut in diesen Kamin eingeführt wird (L.F. Forgrave u.a. "Cryopreservation
of Mouse Embryos in Mac Donald Freeze-Thaw Apparatus", Can.J.Anim.Sci.57 (1977),
389-394; S. Trotnow u.a. "A New Freezing Technique for Embryos", World Conference
of Instrumental Insemination, In vitro Fertilization and Embryo Transfer, Abstract:
Suppl. vol. Archives of Andrology 5: A146 (1980); A. Görlach u.a. "Die Tiefgefrierkonservierung
von Rinderembryonen im offenen System", Vortrag auf der Tagung: "Physiologie und
Patalogie der Fortplanzung",
25.-26.3.1981, Berlin). Erste Versuche
mit derartigen offenen Systemen wurden an der Universität Quebec, im Besamungsverein
Neustadt/Aisch, BRD; und in der Universitäts-Frauenklinik Erlangen, BRD, durchgeführt
und zeigten, daß dieses Verfahren prinzipiell mit Erfolg durchführbar ist.
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Ein derartiges System enthält im Vergleich zu den oben aufgeführten
Merkmalen a bis c: a) ein Kühlgefäß (oben offener Kamin) zum Aufnehmen eines Kühlmediums,
das zum Ausbilden und Aufrechterhalten eines Temperaturgefälles im Kühlgefäß ausgelegt
ist. Das Kühlgefäß ist wärmeisoliert und nimmt unten flüssigen Stickstoff auf. Der
langsam verdampfende Stickstoff erzeugt ein von unten nach oben ansteigendes zeitlich
nur langsam veränderliches Temperaturprofil; b) eine Halteeinrichtung für mindestens
einen das Gefriergut enthaltenden Gefriergutbehälter, wobei Halteeinrichtung und
Kühlgefäß relativ zueinander längs des Temperaturgefälles verschiebbar sind; c)
einen als Thermostatiereinrichtung dienenden steuerbaren Antrieb, der die Haltevorrichtung
mit dem Gefrierbehälter relativ zum Kühlgefäß verschiebt. Dabei kann ein Temperaturfühler
derart an der Haltevorrichtung befestigt sein, daß er stets mit dem Gefriergutbehälter
in einer zum Temperaturgefälle senkrechten Ebene liegt. Dadurch wird stets die Temperatur
am Ort des Gefriergutes gemessen Es entfällt der bei den Kammer-Gefrieranlagen erforderliche
Aufwand für die Thermostatierung, vielmehr verschiebt der Experimentator, um z.B.
eine niedrigere Kühlmitteltemperatur zu erhalten, lediglich durch manuelle Einstellung
am Steuergerät die Halteeinrichtung tiefer in das Kühigefäß hinunter. Auch ergeben
sich keine Schwierigkeiten bei Impfung oder Kontaktauslösung zur Einleitung der
Kristallisa-
tion, da das Kühlgefäß von oben zugänglich ist. Diese
Manipulationen sind jedoch weiterhin vom Geschick des Experimentators abhängig,
und die Temperatur des Gefriergutes kann nicht mit hinreichender Genauigkeit entsprechend
einem gewünschten Zeitverlauf eingestellt werden.
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Aufgabe und Lösung: Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den
Gefriervorgang so zu automatisieren, daß er auch von weniger erfahrenem Personal
sicher und reproduzierbar durchgeführt werden kann.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch die im Kennzeichen des Anspruchs 1
angegebenen Merkmale, die sowohl mittels einer Kammergefriervorrichtung mit den
oben aufgeführten Merkmalen a bis c wie - vorzugsweise - bei einem offenen System
(Merkmale a' bis c') anwendbar sind.
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Die Erfindung geht dabei von der Oberlegung aus, daß zwar vorrichtungsbedingt
nur die Temperatur des Kühlmediums in der Umgebung des Gefriergutbehälters einstellbar
ist, daß bei optimalem Einfrieren jedoch der Verlauf der Gefrierguttemperatur entscheidend
dafür ist, ob das Gefriergut geschädigt wird. Die Abweichungen zwischen Gefrierguttemperatur
und Umgebungstemperatur sind vor allem durch den relativ trägen Wärmeübergang an
der Behälterwand und die je nach Art der Auslösung frei werdenden Kristallisationswärme
bedingt. Wird nun ein-Gefriergutbehälter verwendet, der ein Hauptteil und ein an
einem Ende zum Hauptteil-Inneren offenes, am anderen Ende verschlossenes oder verschließbares
Röhrchen aufweist, und wird das Hauptteil-Innere mit der das Gefriergut enthaltenden
Schutzlösung gefüllt, während das Röhrchen nur mit Schutzlösung gefüllt ist, so
ist das empfindliche Gefriergut räumlich getrennt von dem Röhrcheninhalt, in dem
gefahrlos auch eine heftige Kristallisation stattfinden kann. Wird ferner beim Absenken
der Kühlmedium-Temperatur wenigstens in der Nähe der Kristallisationstemperatur>
d.h. in dem wegen der Kristallisation kritischen Temperaturbereich für das Gefriergut,
in der Umgebung des Röhrchens eine tiefere temperatur eingestellt als in der Umgebung
des Hauptteils, so setzt beim Absenken der Temperatur' im Röhrchen eine mehr oder
weniger heftige Kristallisa-
tion ein, jedoch greift die Kristallisation
- von der Mündung des Röhrchens ausgehend - erst dann auf das Hauptteil-Innere und
das Gefriergut über, wenn die Kühimitteltemper»-tur in der Umgebung des Hauptteils
unter die Kristallisationstemperatur absinkt. Durch entsprechende Einstellung der
Hauptteil-Umgebungstemperatur kann damit die Kristallisation kontrolliert werden.
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Bei einer Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens enthält daher
das Kuhlgefäß eine Zone, in die der Gefriergutbehälter mit dem an seinem Hauptteil
angeordneten Röhrchen hineinragt und die auf eine Temperatur unterhalb'der Umgebungstemperatur
des Hauptteils abkühlbar ist.
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Vorteilhaft geschieht die Einstellung der Kühimedium-Temperatur automatisch.
Dazu wird die Gefriergut-Isttemperatur im Inneren des Gefriergutbehälters gemessen
und auf eine Gefriergut-Solltemperatur mit vorgebbarer zeitlicher Xnderung eingeregelt,
indem die Kühlmedium-Temperatur in der Umgebung des Hauptteils entsprechend der
Istwert/Sollwert-Differenz der Gefriergut-Temperatur eingestellt wird. Hierfür ist
eine Eingabeeinrichtung für den Sollwert und ein Regler vorgesehen, der die Differenz
zwischen dem Sollwert und dem mittels eines in den Gefriergutbehälter hineinragenden
Meßfühlers gemessenen Istwert erfaßt und entsprechend dieser Differenz eine Steuergröße
für die Kühlmedium-Temperatur in der Umgebung des Gefriergutbehälters bildet. Mit
dieser Steuergröße wird die Thermostatiereinrichtung gesteuert. Durch die Messung
der Gefriergut-Temperatur wird jede Abweichung der Isttemperatur von der Solltemperatur
erkannt und kann durch die Regelung verringert werden.
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Die Erfindung ermöglicht somit, auch während des Phasenübergangs,die
Abweichung zwischen der vorgegebenen Solltemperatur und der gemessenen Isttemperatur
des Gefriergutes extrem klein zu halten.
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Eine besondere Ausführungsform der Erfindung geht dabei von
einem
eingangs beschriebenen offenen System aus und ermöglicht eine erhebliche Verringerung
des bei den Kammer-Gefriergeräten notwendigen technischen Aufwandes.
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Eine besonders vorteilhafte Gestaltung des Gefriergutbehälters ermöglicht
ferner die technisch einfache und extrem schonende Auslösung der Kristallisation
in den einzelnen Behältern mit Gefriergut bei gleichzeitiger optischer Oberwachungsmöglichkeit.
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Vorteilhafte WeiterbildungEnder Erfindung sind in den Unteransprüchen
gekennzeichnet und werden anhand eines Ausführungsbeispiels und 5 Figuren näher
erläutert.
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Ausführungsbeispiele: Es zeigen: Fig. 1 den Temperaturgang des Gefriergutes
bei konstanter Abkühlung des umgebenden Kühlmediums, wie er bereits eingangs erläutert
wurde; Fig. 2 eine Vorrichtung gemäß der Erfindung mit geschlossener Kammer; Fig.
3 eine Vorrichtung gemäß Erfindung mit einem offenen Kühlgefäß; Fig. 4 und 5 Gefriergutbehälter,
wie sie bevorzugt zur automatischen Einleitung der Kristallisation bei der erfindungsgemäßen
Vorrichtung verwendbar sind.
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Die Vorrichtung nach Fig. 2 weist ein Kühigefäß(1), eine nicht dargestellte
Halteeinrichtung für die Gefriergutbehälter, eine Thermostateinrichtung und einen
Meßfühler(2)auf.
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a) Die Thermostatiereinrichtung besteht aus einer Einspritzdüse(3S
mit der über ein Dosierventil(4)z.B.
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flüssiger Stickstoff aus einem Vorratsbehälter(5)in die Kammer eingespritzt
werden kann, z einer Heizung(6) und einem Ventilator(7)zur Verwirbelung des Stickstoff-Luft-Gemisches
(Kühlmedium). Dosierventil(4)und Heizung (6) sind von einem Steuergerät (8) gesteuert.
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Bei einer üblichen Kammmer-Gefriervorrichtung ist der Meßfühler an
einer Stelle innerhalb der als Kühlgefäß verwendeten geschlossenen Kammer angeordnet
und mißt die Temperatur des Kü'hlmediums in der Kammer. Gemäß der Er--findung ist
jedoch der Temperaturfühler vorteilhaft in einen der Gefriergutbehälter(9,9',9")eingeführt.
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Für biologisches Material ist dabei vorzugsweise der in das Gefriergut
eintauchbare metallische Meßteil des Tempertaurfühlers aus einem biologisch verträglichen
Metall gefertigt und/oder mit einem sterilisierbaren Mantel, z.B. Keramik,~umgeben.
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Ober eine Eingabchtung (10) ist ein Sollwert(T*) für die Gefrierguttemperatur
vorgebbar. Mit der Eingabeeinrichtung (10) und dem Temperaturfühler(2) ist ein Regler(11)
verbunden, der der Thermostatiereinrichtung vorgeschaltet ist und aus der Sollwert/Istwert-Differenz
T*-T am Ausgang (12) ein Signal für das Steuergerät(8) liefert.
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b) Führt die bei T # Ts einsetzende Kristallisation an sich zu einer
Erhöhung der vom Temperaturfühler erfaßten Gefrierguttemperatur innerhalb des Behälters,
so wirkt der Regler diesem.Anstieg der Gefriergut-Isttemperatur dadurch entgegen,
daß entsprechend der Differenz T*-T eine Steuergröße vorgegeben wird, durch die
über die Betätigung der Thermostatiereinrichtung das Kühlmedium entsprechend stärker
abgekühlt wird, bis die Isttemperatur sich entsprechend der durch den Sollwert vorgegebenen
Änderung absenkt.
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c) Die Differenz T*-T wird selbst in diesem kritischen Bereich sehr
klein, wenn bereits bei Erreichen der Kristallisationstemperatur (T=Ts) Kristallisationskeime
in der Schutzlösung vorliegen. Dies wird dadurch erreicht, daß in dem Isoliermantel
des Kühigefäßes z.B.
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ein metallischer, von der Flüssigstickstoff-Leitung (13) stark gekühlter
Block(14)eingeschäumt ist, der somit wesentlich unter die Temperatur(T3abgekühlt
ist. An den Hauptteilen (15) der Gefriergutbehälter(9,9',9") sind Röhrchen (16)
angeordnet, die in die von dem Metallblock(14) gebildete kältere Zone des Kühlgefäßes
hineinragen. Die Röhrchen sind mit Schutzlösung (ohne das zu schützende Gefriergut)
gefüllt. In ihnen setzt bereits eine Kristallisation ein, bevor die Kühlmedium-Temperatur
die Kristallisationstemperatur(Ts)erreicht. Wird nun die Kühlmedium-Temperatur unter
die Kristallisationstemperatur abgesenkt, so wachsen die Schutzlösungskristalle
aus den Röhrchen in das Innere der Hauptteile(15) hinein und.lösen
dort
eine schonende, kontrollierbare Kristallisation der das Gefriergut enthaltenden
Schutzlösung aus, sobald auch im Hauptteil-Inneren die Temperatur T5 unterschritten
ist.
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Zur Kontrolle des Kristallisationsvorgangs ist es ferner vorteilhaft,
wenn das Innere des Kühigefäßes und des Gefriergutbehälters mindestens von einer
Seite her einsehbar ist.
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In gleicher Weise arbeitet auch die in Fig. 3 dargestellte Vorrichtung,
die sich durch einen besonders geringen apparativen Aufwand auszeichnet. Mit(20)
ist das Kühigefäß bezeichnet, das zum Ausbilden und Aufrechterhalten eines zeitlich
konstanten Temperaturgefälles ausgelegt ist.
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Vorteilhaft ist das Kühigefäß ein oben offener Behälter aus Styropor
oder einem anderen Isoliermaterial und somit bis auf die Oberseite gut isoliert.
In seinem unteren Teil nimmt er ein flüssiges Gas(21), insbesondere Flüssigstickstoff,
auf, der langsam verdampft und oben aus dem Gefäß entweicht. Dadurch entsteht ein
Temperaturgefälle, in dem die Temperatur sich von dem Siedepunkt des Flüssigstickstoffs
bis zur Raumtemperatur stetig ändert, ohne daß weitere Einrichtungen erforderlich
wären. Die Halteeinrichtung(22) kann aus einer Halterung für mehrere in einer Ebene
angeordnete Gefriergutbehälter bestehen, von denen in Fig. 3 nur der vordere Behälter(23)
sichtbar ist. Im dargestellten Fall ist das Kühlgefäß (20) fest montiert, während
die Halterung(22) über eine Verschiebeeinrichtung (24> vertikal verschiebbar
ist.-Es ist jedoch prinzipiell gleichgültig, ob Kühlgefäß, Halteeinrichtung oder
beide Einrichtungen verschiebbar sind, da es lediglich auf die relative Verschiebbarkeit
längs des Temperaturgefälles ankommt.
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Als Thermostatiereinrichtung zum Erzeugen einer für die Umgebung des
Gefriergutbehälters (23) vorgebbaren Kühimedium-Temperatur dient ein steuerbarer
Antrieb(25), der die Halteeinrichtung mit dem Gefriergutbehälter jeweils in den
Teil, des Kühlmittelgefäßes verschiebt, der für die Umgebung
des
Gefriergutbehälters anzusteuernde Temperatur aufweist.
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Ein Meßfühler(29) ragt in den Hauptteil des Gefriergutbehälters (23)
hinein. Aus der gemessenen Gefriergut-Isttemperatur(T) und einer an einer Eingabeeinrichtung(26)
abgegriffenen Solltemperatur(T*) wird in einem Regler(27) die Differenz (T*-T) und
eine entsprechende Steuergröße gebildet, mit der Antrieb(25) kontinuierlich oder
wenigstens- im Falle eines Schrittmotors oder einer digitalen Steuerung- quasikontinuierlich
gesteuert wird.
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Die Eingabeeinrichtung(26)liefert einen Sollwert mit zeitlich vorgebbaren
Verlauf für die Gefriergut-Temperatur. Dieser kann beispielsweise, von einem eingegebenen
Startwert ausgehend, jeweils für feste Zeitabschnitte entsprechend einer für die
jeweiligen Zeitabschnitte vorgegebenen konstanten Steigung berechnet werden. Als
Eingabeeinrichtung kann dann insbesondere ein Mikroprozessor verwendet werden. Dabei
ist festzuhalten, daß die Temperatur des Kühlmediums in der Umgebung des Behälters(23)
nicht gemessen und auch nicht bekannt sein muß. Sollte z.B. die Gefrierguttemperatur
auf einem konstanten Wert gehalten werden, die Kühlmitteltemperatur an dem betreffenden
Ort des Behälters(2jedoch aufgrund langsamer Erwärmung ansteigen, so bewirkt der
Regler (27) und die Steuereinrichtung (25) daß die Halteeinrichtung(22) tiefer in
das Kühlgefäß(2o) abgesenkt wird, um einem Anstieg der Gefrierguttemperatur entgegenzuwirken.
Dabei ist keine genaue zeitliche Konstanz des Temveraturgefälles erforderlicht Vielmehr
wählt die Regelung selbsttätig jeweils die richtige Stellung der Halteeinrichtung
und somit die richtige Kühimediumtemperatur aus.
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Zur Kontrolle des Gefriervorganges ist es vorteilhaft, wenn das Kühlgefäß
oben nicht abgedeckt ist und der Gefriergutbehälter wenigstens teilweise aus transparentem
Material besteht. Dann ist das Innere des Kühlgefäßes und des Gefriergutbehälters
mindestens von einer Seite her einsehbar.
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In Fig. 4 und 5 sind vorteilhafte Ausbildungen des Gefriergutbehälters
und des Temperaturfühlers dargestellt.
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Der Gefriergutbehälter ist ein in größeren Stückzahlen leicht und
billig herzustellendes Ersatzteil für die erfindungsgemäße Vorrichtung. Er besteht
aus einem, an der Halteeinrichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung befestigbaren
Hauptteil (30) mit einer Uffnung (31) zum Einfüllen des Gefriergutes und gegebenfalls
zum Aufnehmen des Temperaturfühlers (32) und einem am Hauptteil angeordneten, an
seinem einen Ende (33) zum Hauptteilinneren offenen, am anderen Ende (34) verschlossenen
Röhrchen (39). Der Hauptteil (30) kann ein transparentes, leicht sterilisierbares
Zylinderchen, beispielsweise aus Kunststoff, sein. Bei der Ausbildung nach Fig.
4 ist das Röhrchen(39)mit seinem abgewinkelten oberen Ende (33) durch einen das
eine Ende des Zylinderchens(30) verschließenden Stopfen(35), beispielsweise aus
Silikon, geführt und am anderen Ende zugeschmolzen. Der Stopfen(35J ist vorteilhaft
soweit in das Zylinderchen (30)hineinschieb bar, daß er bei temperaturbedingten
Druck- und Volumenänderungen axial beweglich ist. Dadurch entsteht ein verschließbarer
Behälter mit Druckausgleich.
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Das Ende(31) des Zylinderchens(30) ist über einen konischen Verschluß,
der ebenfalls aus Kunststoff ausgeführt sein kann, oder einen keramischen Schliff,
abgeschlossen. Durch diesen konischen Verschluß(36J ragt der Meßteil (32) des Meßfühlers
in das Gefäßinnere. Am Verschluß (36) ist ein Stecker (38) für den Meßausgang des
Temperaturfühlers befestigt.
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Für- den Betrieb der Vorrichtung nach Fig. 3 ist der in Fig. 4 dargestellte
Gefriergutbehälter mit seinem Hauptteil quer zum Temperaturgefälle an der Halteeinrichtung
befestigt.
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Das Röhrchenende (34) ragt z.B. etwa 40 mm tiefer in das Innere des
Kühigefäßes hinein und ist damit einer tiefen Temperatur ausgesetzt als der Hauptteil..
Folglich setzt die Kristallisation der Schutzlösung in dem Röhrchen bereits ein,
wenn das Gefriergut im Hauptteil noch Temperaturen ausgesetzt ist,
die
über der Kristallisationstemperatur liegen. Vom Röhrchen (39) aus wachsen daher
beim weiteren Absenken des Gefriergutbehälters Kristallisationskeime in das Innere
des Hauptteils, so daß ohne jegliche weitere Manipulation auch im eigentlichen,
im Hauptteil enthaltenen Gefriergut die Kristallisation automatisch ausgelöst wird,
sobald die Gefrierguttemperatur im Hauptteil die Kristallisationstemperatur .erreicht
oder geringfügig unterschreitet.
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Der Hauptteil muß nicht zylindrisch (aligemJner:längsgestreckt)sein,
für die Verwendung nach Fig. 3 ist z.B.
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auch eine Schalenform möglich, wie in Fig. 5 an einer Petri-Schale(40)
aus PVCZdie mit einer Silikongummi-Haube (41) abgedeckt ist, dargestellt ist.
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Für die Verwendung bei einer -geschlossenen Kammer nach Fig. 2 ist
die form des Hauptteils vollkommen beliebig.
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Auch für das Röhrchen ist keine bestimmte Form erforderlich, es kann
z.B. auch schlauchähnlich mit Krümmungen und veränderlichem Durchmesser ausgeführt
sein.
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Faßt die Halteeinrichtung mehrere Gefriergutbehälter, so kann es vorkommen,
daß die Gefrierguttemperatur in den verschiedenen Behältern etwas voneinander abweicht.
Die Kristallisation kann dann zu etwas unterschiedlichen Zeiten einsetzen und mit
etwas unterschiedlichen Geschwindigkeiten ablaufen.
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Die Regelung erfaßt jedoch nur die Gefrierguttemperatur in einem Behälter.
Für diese Fälle ist es von besonderem Vorteil, daß bei offenem System das Gefriergut
einsehbar ist.
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Es ist daher möglich, die Zeitpunkte für Beginn und Ende der Kristallisation
in allen Behältern optisch zu beobachten, um die Abkühlgeschwindigkeit den jeweiligen
Verhältnissen optimal anzupassen. Insbesondere kann dann die Dauer, in der während
der Kristallisation nur eine geringe Abkühlgeschwindigkeit vorgegeben ist, so kurz
wie möglich gewählt werden.
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Mit der Erfindung werden also aufgrund der Innentemperaturregelung
exakt reproduzierbare Temperatur-Zeit-Verläufe für das Gefriergut sichergestellt.
Durch die vorgeschlagene selbsttätige Auslösung der Kristallisation in Verbindung
mit der Innentemperaturregelung ist es möglich, reproduzierbare Phasenubergänge
zu. erreichen, bei denen der unerwünschte Temperaturanstieg weniger als 0.5ob beträgt.
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Diese Eigenschaften lassen die Erfindung speziell für Forschungszwecke
und für Gefriervorhaben mit hochwertigem biologischem Material wie z.B. Embryonen
von Zuchttieren und Menschen geeignet erscheinen. Der technische Aufwand liegt'erheblich
unter dem der handelsüblichen Kammergefriergeräte; er besteht im wesentlichen aus
einem geeigneten Antrieb zur Bewegung des Gefriergutes relativ zu dem Temperaturprofil
innerhalb des Kamins.
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