DE3332739A1

DE3332739A1 - Immersions-kryofixation mit nachfolgender rotation des objekts

Info

Publication number: DE3332739A1
Application number: DE19833332739
Authority: DE
Inventors: Helmut Prof. Dr. Seefeld Sitte
Original assignee: C Reichert Optische Werke AG
Current assignee: C Reichert Optische Werke AG
Priority date: 1983-09-10
Filing date: 1983-09-10
Publication date: 1985-04-04
Also published as: DE3332739C2; GB2146418A; SE8404504D0; GB8422331D0; SE8404504L; GB2146418B; FR2551871A1; JPS6086444A

Description

C. Reichert Optische WcNu.· AG
IJernalser ifaupfslr. 21!), Λ- 1170 Wien

imniersioiis-Kryofixnlicni mit nachfolgender Rotation des Objektes

Die !Erfindung betrifft eine Vorrichtung' zur rmmcrsions-Kryofixation biologischer oder medizinischer Objekte durch rasches vertikales EinProbe binnen kürzester Zeit möglichst viel Wärme zu entziehen. Dies gilt vor allem l'ür biologische oder medizinische Objekte ohne Vorbehandlung, das heißt ohne vorangehende Fixation und/oder Gefrierschutzbehandlung, da in diesem Fall, ausschließlich die Geschwindigkeit der Abkühlung ("Abkiihlrnte") darüber entscheidet, ob eine artefizielle Entmischung der wasserreichen plasmatischen Phasen stattfindet, welche eine sinnvolle mikroskopische oder histochemische Untersuchung unmöglich macht, oder ob das Objekt lebensgetreu glasig erstarrt (" Verifikation" bei Abkülilraten ^. 1 0. 000°C/sec). Die erforderlichen hohen Abkiihlraten werden nur in einer äußerst dünnen Randzone des Objektes erreicht und bewirken dort initial sowohl eine gute StrukturerhaLluiig wie eine Abkühlung unter -80 C. Bedingt durch das schlechte Wärmeleitvermögen von Eis bleiben demgegenüber weiter innen gelegene Zonen insbesondere größererObjekte mit Durchmessern 'über 3 mm während der Injektion zumeist auf einer Temperatur, die

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bringen der an einem Injektor befestigten und mittels dieses Injektors [

auf eine Geschwindigkeit von 5 bis 15 m/sec beschleunigten Probe in eine auf eine Temperatur unter -100°C abgekühlte Kühlflüssigkeit für eine nachfolgende mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchung mit den Merkmalen nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Für zahlreiche Präparationsarbeitei\ insbesondere zum Schockgefrieren ("Kryofixation") biologischer ruler medizinischer Proben für nachfolgende mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchungen verwendet itiau Kühl flüssigkeiten mit Temperaturen zwischen -100^üC und -IfJO⁰C. Das Ziel einer derartigen Abkühlung geht dahin,

erheblich über dein kritischen Grenzwert von -80°C liegt und damit keine endgültige Stabilisierung uev Feinstrukturen und niedermolekularen Bestandteile dieser Objekte bewirkt. Desgleichen bleiben Teile des meist metallischen Injektionssysteins auf höherer Temperatur. Diesem Umstand wäre dadurch zu begegnen, daß man Kühlbäder mit einer Flüssigkeitssäule einer Höhe verwendet, welche vertikale Objektbewegungen einer Länge ermöglicht, die /.wischen 50 und 100 cm liegt. Eine Injektion mit einer Geschwindigkeit von 5 bis 15 m/sec würde hierdurch auf eine Zeitspanne von 300 msec bis 2 see verlängert, welche für eine komplette Abkühlung und Stabilisierung der.Proben in der Regel'ausreicht. Praktische Erwägungen, welche auf die Kindlichkeit sowie die risikofreie Bedienung derartiger Apparaturen abzielen, legen es jedoch nahe, die Höhe derartiger Kühlbäder auf etwa 10 cm zu beschränken. Die Injektion in ein derartiges Kühlbad ist bei einer mittleren Injektioasgeschwindigkeil bereit« nach 100 msec, abgeschlossen. Diese Zeitspanne reicht nach {.'eilender Meinung /.war zur einwandfreien Vitrifizierung einer dünnen Mandzone, nicht aber zum Durchfrieren größerer Proben aus. Der zwangsläufig nach dem Abschluß des Injekti cms Vorganges eintretende Stillstand uev Probe führt nach dieser initialen Abkühlung sehr· rasch durch Aufbau eines Temperaturgradienten in die Kühlflüssigkeit zu einer neuerlichen Erwärmung des eben auf Temperaturen nahe der ursprünglichen Kühlbadtemperatur abgekühlten Probenrandes. Hierbei tritt bei Überschreiten des Grenzwertes von -80 C augenblicklich eine sekundäre Veränderung der erstarrten Probe ein, welche den zunächst lebensgetreu stabilisierten Zustand artefiziell verändert. Soweit man Proben im amorph-vitrifizierten Zustand am Kryo-Mikrotom, insbesondere am Kryo-'Ultramikrotom schneiden möchte, darf eine Temperatur von -140 C in diesen Randzonen nicht überschritten werden, was bei dem plötzlichen Stillstand der Probe 100 msec nach Injektionsbeginn in keinem Fall"gewährleistet werden kann. Mau ist daher im Hinblick auf eine Erhaltung der primär im Zuge der raschen Injektiorixbewegung erreichten lebensgetreuen Vitrifikation gezwungen, den sekundär nach dem Stillstand der P-robe sofort beginnenden Aufbau eines Teniperaturgradienlen in der unmittelbar an die freie Probonoburfläehe angrenzenden Kühlflüssigkeit durch geeignete Maßnahmen möglichst weitgehend einzuschränken.

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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die vorstehend genannten Nachteile '/.u vermeiden,das heißt eine Vorrichtung zu schaffen, durch die auch nach dem Stillstand der Probe in der Kühlflüssigkeit nach der Injektion der Aufbau schädlicher Temperaturgradienten unterbleibt oder zumindest soweit eingeschränkt wird, daß sekundäre artefizielle Veränderungen in der Probe unterbleiben, welche die Qualität des Erhaltungszustandes mindern und dadurch den Wert der nachfolgenden mikroskopischen, insbesondere elektronenmikroskopischen Untersuchung in Krage steLlen.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung eine Ausgestaltung mit den Merkmalen nach dem Kennzeichen des Patentanspruches 1 vor.

Die Erfindung sieht also vor, daß die aus dem raschen Einbringen der Probe in die Kühlflüssigkeit zunächst resultierende Vitrifikation dadurch mil. Sicherheit erhallen wird, daß der Injektor und die daran angebrachte Probe vor dem Abschluß oder unmittelbar bei \bschluß der vertikalen Injcktionsbewegung in eine rotierende Bewegung*versetzt wird, welche den Aufbau eines Temperaturgradienten im unmittelbar an die freie Prohenoberfläche angrenzenden Bereich der Kühlflüssigkeit verhindert. Es wird dadurch auf einfache Weise gewährleistet, daß der aus der Probe in die Kühlflüssigkeit stattfindende Wärmefluß weiterhin in jenein Ausmaß erfolgt, das eine Rekristallisation der zunächst amorph oder mikro-kristallinerstarrten Randzone der Probe mit Sicherheit ausschließt.

Ein System der erfindungsgemäßen Art kann in einfachster Ausbildung darin bestehen, daß ein am Injektor angebrachter Zylinder durch die vertikale Injektionsbewegting in eine rotierende Hülse eintritt. Soweit der Luftspalt, zwischen den korrespondierenden Zylinderflächen entsprechend gering gehalten ist, bewirkt die Luftreibung zwischen den · beiden Zyliuderflächen eine Mitnahme des Injektors, soweit der Injektor in seiner Führung frei rotieren kann. Durch die Rotation des Injektorswirddie am Injektor befestigte Probenhalterung mit der Probe im Kühlbucf ebenfalls in eine rotierende Bewegung versetzt, welche an der Oberfläche der Probe sowie im gesainten Kühlbad eine Konvektion der Kühlflüssigkeit bewirkt. Hierdurch wird nicht nur eine Ausbildung von Temperalurgradienten in den Bereichen der Kühlflüssigkeit vermie-

* um seine rängsachso

** wird die KühlQüssiqkoit g^rj ORIGINAL

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den, die unmittelbar an die IVeii: Probenoberfläche angrenzen. Ea wird vielmehr im gesamten Ki.ihl.bad eine Bewegung der Kühlflüssigkeit bewirkt, welche letztlich den Wärmefluß und Temperaturausgleich zwischen dem Injektionssystem mit der Probenhalterung und den kälteren, in der Regel metallischen Wandungen des Kühlbades bewirkt.

Sinnvolle Ausgestaltungen oder Variationen der "Erfindung können darin bestehen, daß die notation entweder durch eine Platte oder eine rotier-ende Scheibe oder eine rotierende Kugelfläche erzeugt wird, die beim Abschluß.der vertikalen Injektionsbewegung mit einer korrespondierenden Fläche ties Injektors in Kontakt"tretonyaο daß durch die entstehende Reibung erfindungsgemäß eine Kupplung zwischen dem rotierenden Element und dom Injektor bewirkt und eine Rotation des Injektors realisiert wird, [n technisch ebenfalls bekannter Weise kann die Rotation des Injektors durch ein on ihm montiertes Schaufelrad- in der Art einer Gasturbine mittels eines Gasstromes erzeugt werden, der aus einer Düse austritt, welche ihrerseits so angebracht ü't, daß die Rotation des Injektors vor Abschluß der vertikalen Injektionsbewegung eingeleitet wird.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung können die gewünschte Konvektion der Kühlflüssigkeit dadurch verstärken, daß am unteren Ende des Injektors nahe der Probe Elemente, beispielsweise flügelartige Elemente aus Blech vorgesehen sind, welche in der Art einer Schiffsschraube oder eines Ventilators wirken, in gleicher Weise wirkt eine Probenhalterung, bei der ein -rotationssymetrischer Probenträger so am Injektor befestigt wird, daß seine eigene Rotationsachse nicht mit der Längsachse übereinstimmt, um die der Injektorstab rotiert. In beiden Fällen wird die schwache Konvektion der Kühlflüssigkeit, welche bei der Rotation eines rotationssyinetrischen oder annähernd rotationssymetrischen Gebildes um seine Längsachse im Kühlbad erzeugt wird, wirkungsvoll verstärkt.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung kann schließlich darin bestehen, daß derjenige Vorgang, welcher die Rotation des Injektors bewirkt, mittels einer geeigneten Wirkverbindung durch den Injektionsvorgang selbst ausgelöst wird. Dies kann beispielsweise in technisch bekannter mechanischer oder elektrischer Weise direkt durch dasjenige Element geschehen, das die Injektion auslöst. Darüber hinaus kann

eine Ausgestaltung vorsehen, daß die Rotation nach jener Zeitspanne automatisch beendet wird, welche nach den vorliegenden Erfahrungen zum endgültigen Stabilisieren der Probe im Kühlbad erforderlich ist. Schließlich kann vorgesehen werden, daß man die Laufzeit der Rotationsvorrichtung durch ein geeignetes analoges oder digitales Einstellelement innerhalb der technisch und methodisch vorgegebenen Grenzwerte vorwählen und damit unterschiedlichen Anforderungen anpassen kann.

AusführungHbeispiele tier Erfindung werden nachfolgend anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Fig.. 1 eine rein schematische Ansicht einer Injektionsvorrichtung mit Kühlbad nach dem Stand dv.r Technik im Querschnitt;

!•Mg. 2 eine sclicinatischc Schnitt-Darstellung des erfindungsgemäßen Systems im Querschnitt mit einer Mitnehmerhülse sowie einem am Injektor befesl.i/'ten Propeller zum'Erzeugen einer Konvektion dex· KiihliLÜsiigkeit in dar Art eines Rührwerks,

1-"¹Ig. Ma, \j schematische Schnittdarsteilungen eines Teils zweier

Aus! ührunqsforT.ifn mit Kupplungselementen

zwischen dem Injektorstab und einem rotierenden Element in der Form einer planen Scheibe bzw. eines Kegels sowie einer exzentrischen oder schrägen Montage des Objektträgers, die eine zusätzliche Verstärkung der Konvektion der Kühlflüssigkeit an der freien Objektoberfläche bewirten, und

Fig.4a,b eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Systems mit einem am Injektor befestigten Schaufelrad zur Realisierung einer Rotationsbewegung des Injektors mittels eines gerichteten Gasstromes in der Art einer Gasturbine in zwei Schnittdarstellungen (Seitenansicht und Aufsicht).·

Das in Fig. L rein schematisch in einem Querschnitt vereinfacht dargestellte System entspricht dem heutigen Stand der Technik. In einem mit einer Isolation 1 umgebenen Behälter 2 befindet sich flüssiger Stickstoff '.' als Kryogen zum Abkühlen des Metallzylinders 4. Im Metallzylinder 4 befindet sich/Hßf geeignete Weise verflüssigt es Kühlmedium 5 (z. 13. verflüssigter halogenierter Kohlenwasserstoff oder

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verflüssigtes Athan, Propan oder Isopentan). Die Hülst! G verhindert einen direkten Kontakt, zwischen dem flüssigen Stickstoff 3 und dem Meta ILz₁/Linder 4 , so daß eine Gegenheizung dieses Zylinders durch die Heizpatrone 7 auf eine durch den Gefrierpunkt der Kühlflüssigkeit 5 vorgegebene und durch den Temperaturfühler 8 gemessene Minimalteniperaturmögüch ist. Die Injektion des auf einem Träger 9 angebrachten biologischen oder medizinischen Objektes 10 erfolgt mittels eines vertikal im Teil 11 geführten Injektorstabes 12 , der nach Betätigen des Auslösers 13 ( ^) eine vertikale Abwärtsbewegung ausführt, weiche in dui- Kegel durch eine Druckfeder 14 oder in einer anderen technisch bekannten Weise (z. U. Gasdruck) auf jene Werte zwischen 5 und 15 m/sec beschleunigt wird, welche erfahrungsgemäß für eine zufriedenstellende Vitrifizieruug ("KryofixaLion") erforderlich sind. Nach einer Weglänge "I" kommt der injektor 12 mit dem Objekt K) auf dem Halter 9 /.um SLi i Island. Durch diesen Stillstand erlischt normalerweise auch die Relativbewegung zwischen der Kühlflüssigkeit 5 und üvv freien Oberfläche fies Objektes 10, was unmittelbar dcMi Aufbau eines Temperaturgradienten in ύον direkt angrenzenden Kühlflüssigkeit, zur Folge hat. Hierdurch tritt,insbesondere bei Objekten mit grüßerr-n Durch messern über 3 mm binnen weniger Millisekunden ein Temperaturanstieg in ciei· einwandfrei vitriliziei'ten llandschichte ein. Soweit die Temperatur in diesem Bereich über -135 C ansteigt, kristallisiert die zunächst amorph vitrifizierte wässrige plasmatische Matrix des Objektes und ist damit einer höher auflösenden Untersuchung im Elektronenmikroskop nicht mehr zugänglich. Überschreitet die Temperatur den Bereich um--80⁰C, so beginnt darüber hinaus eine Umverteilung kleiner Molekel und Ionen, die histochemische Aussagen auf der Basis einer Elementanalyse (EDX oder LAMMA) bzw. Autoradiographie unmöglich macht. Es wurde daher verschiedertlich der Versuch unternommen, die Kühlflüssigkeit durch ein Rührwerk in Bewegung zu setzen. Dies kann beispielsweise durch einen Magnetrührer g> ^hehen, der aus einem Antriebs?· motor 15, einem an die Antriebswelle 16 dieses Motors befestigten Magneten 17 sowie ein am Boden des Kühlbades liegenden Rührmagneten 18 besteht. Indessen bewirkt diese Anordnung nur geringe Strömungsgeschwindigkeiten der Kühlflüssigkeit 5 , welche für den geforderten Effekt nicht ausreichen, ist im tiefen Temperaturbereich unter

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-Ii)O C nur mit einem i-rlieb! :<·ϊη.·μ Aniu.wid .-.;. installieren und auf Dauer /.u bei reiben \i\\i\ verbinden .uiiei , .,nuere wünschenswerte Ausgestaltungen des Kiililbads.ysi.ems. \'.if der amieren Seite ist eine zufriedenstellende Kryofixation in technisch bekannter Weise dadurch zu gewährleisten, daß mau die Länge "1" des [njektioriswcees von dem üblicherweise angewandten IJereichs von rd. LOcm auf den etwa 5bis 10-fachen Uetrag steigert. Hierdurch entstehen jedoch wiederum Proble-• me beim AbkühLen und beim thermostatisehen Einstellen der Temperatur der hohen Kühlmitlelsäule und bei der Ausführung des Injektors. Abgesehen davon werden hierdurch die Herstellung derartiger Systeme verteuert, die Betriebskosten wesentlich erhöht und'die Bedienung erheblich kompliziert.

Die anhand von Kig. 1 erläuterten Unznkfimmliehkeiten aller technisch bekannten Losungen zur kryofixafion gniiierer Proben mit Durchmessern über ."! mm durch eine rasche immersion in eine Kühlflüssigkeit ("fminersioiis-Ki\yiifi.\al ion" mil einer We^lä/ige "!'·' von etwa 10 cm) lassen sich durch das in doi· Fig. Ί bis Λ dargestellte errindungsgeiuäße System am' ei iifaHie Weise aussciia i! en. \'ach Kiq. 2 wird hierfür a MK Cc; I It,- drt- in Kl·.·,. I da r'iesl.ei ilen lujeklurauorduuiig ein Injektor ! '.', ver'.vendc!, ih:r in einem I'üiiruui'seleiiieii· 1 1 ' vertikal verschiebbar angeordnet ist., wobei am Injektor koaxi.ii ein zylindrischer Körper i SJ befestigt ist, dessen .iußerer Durchmesser nur geringfügig un-

ter dem lichten Durchmesser/der Hülse 20 liegt, so daß bei einer raschen Drehung di:r Hülse im Kugellager 21 , die in technisch bekannter Weise durch einen Elektromotor 22 sowie eine Transmission 23/24 erfolgen kann, (\or Zylinder/durch die Reibung dar -zwischen den korrespondierenden l-'Iächen der Teile IiJ unil 20 eingeschlossenen Luft mitgenommen wird, d'leicir/.eitig bewirken dar Zylinder 19 und die Hülse 20 eine pneumatische Dämpfung tier lujektionsbewegung , deren Abschluß hierdurch nicht abrupt, sondern im Rahmen einer stetigen Ver/.ögeruii;.; erfolgt.

Kine itisl« 'Sondere l'üv die Injektion roi.ations-symeirisch.er Probenfialter ü und Proben IO vorteilhafte Ausgestattung des Systems besteh: nach I-'ig. 2 tiarin, daß am Moiuaiieeiemenr. 25, das unter anderem zum Anbringen des I Vobeiiha Il ers Π am Injektor I 2 ' dient, kleine Propeller- ^k von di ΊΜ Ini'-klcJi 1.'' nii ι . ι« s::r*« 'ii 'iviitf :'iii··! · r.:rr:ir^:>r ;'A^r-r.

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flügel in einer synietris'elien Anordnung befestigt sind. Es ist dabei iin Rahmen der '{< :1'indung ηitj.<:McIi_-, vier derartige I· lügel 26 {vgl. Querschnitt, Seitenansicht sowie Aufsicht) , drei derartige Flügel 27, zwei derartige Flügel 28 oder eine höhere Anzahl von Flügeln dieser Art zu montieren, welche stets symetrisch um den Tnjektor'stab 12' am Zwischenstück 25 bzw. 25 ' angeordnet sind. Die Propellerflügel 26/27/28 beAvirken in bekannter Weise einen Umlauf des Kühlmediums in der Art eines Rührwerkes, der bei ύυη angewandten Tourenzahlen (über 10 Umdrehungen/sec) eine ausreichende Konvektion an der Oberfläche der Probe gewährleistet.

Eine andersartige Ausgestaltung tier Krfinduug kann nach Fig. 3 darin bestehen, daß anstelle, eines Zylinder;-- ein Kegel 2ii oder ein Teller 'M) am injektor 112 ' befestigt sind, die in de)· Art einer Kupplungsscheibe durch die Kraft. (lc.\· Fedor I 4 auf die rotierende Gegenfläche tier Teile 32 oder '■'·'.] gepreßt werden und dadurch eine Mitnahme bewirkt;!!. Hierbei k("mnc:n in technisch hckannl r:r Weise Auflagen 3-1 vorgeschi.'¹' werden, WL-IrIiI.: die Mi ι nah m<· In.'günsl ij.¹ en und/oder die vertikale Injektiuiisbowegung elastisch ab|>ul'fern.

Weitere Ausgesta !lungen können nach Fig. '■'> darin bestehen, daß rota tions-syinetrisehe Präpa ra!.halter !J oder annähernd rotations -sy metrische Proben K) über ein Zwischenstück üo/35 ' am Injektor 1 2 ' in einer Weise montiert sind, daß das Objekt eine 'Aur Längsachse A des Injektors 12' exzentrische Postilion einnimmt, so daß aus der voi'gesehenen Rotation des Injektors hierdurch eine Relativbewegung tier Probe K) zur Kühlflüssigkeit 5 resultiert. Hierbei kann das Zwischenstück 35 bewirken, tlaß die Längsachse P des Probenträgers 9 gegen die Achse A des Injektors 12' um einen Betrag "r" versetzt ist, der dem Exzenterradius bei tier Bewegung entspricht. Auf der anderen Seite kann die Achse P des Probenträgers 9 gegen die Achse A des Injektors 12' um den Winkel ¹^. geschwenkt angeordnet sein und hierdurch die gewünschte exzentrische Lage tier Probe 10 bewirken. In beiden Fällen führt die Probe 10 auf den Halter 9 bei der Drehung des Antriebs 22/23/24 eine rotierende Bewegung in der Kühlflüssigkeit Saus.

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Eine weitere Ausgestaltung dor Erfindung kann schließlich nach Fig. 4 darin bestellen, daß diu Rotation des Injektor.slabes 1 2'nicht durch einen Motor und oinc Transmission, sondern mittels eines am Injektor-τι ab 12'befestigten Schaufelrades 3ü in der Art einer Gasturbine bewirkt wird, die durch einen über eine Jet-Düse 37 in den Führungsteil 38 eintretenden Gasstrom in eine drehende Bewegung versetzt wird, wobei die Rotation vor dem durch eine pneumatische Dämpfung von zwei korrespondierenden Zylinderflächen 39/40 bewirkten Stillstand des Injektors 12' einsetzt.

Tm Rahmen der LOrfindung können gegenüber den vorstehend beschriebenen Ausführung.sbeispielen nach Fig. 2 bis 4 Abänderungen getroffen werden, ohne daß hiervon der- erfindungsgemäße Charakter der Anordnung berührt wird. ,So ist es möglich, das erfindungsgemäße System in verschiedenen technisch vorteilhaften Varianten zu fertigen, intern man mehrere einzeln beschriebene F.lemente zusammenfaßt oder in anderer Weise kombiniert, als dies in ilen Ausführungsbeispielen dargestellt und beschrieben ist. Dies gilt beispielsweise für die Übertragung oder Erzeugung uar Drehbewegung des Injektors, die technisch in so mannigfacher Weise realisiert werden kann (z.B. durch eine Magnetkupplung, durch die Ausbildung des Injektorstabes als Motoranker bei gleichzeitiger Montage der Motorwicklung am Injektorgehäuse, durch eine Wirbelstromeinheit, über eine direkte Zahnradkoppelung usf. ), daß eine auch nur annähernd erschöpfende Darstellung aller gegebenen und technisch, realisierbaren Möglichkeiten unmöglich und daher sinnlos erscheint. Ebenso können Elemente, welche eine effiziente Konvektion der Kühlflüssigkeit 'bewirken, in äußerst unterschiedlichen und daher von den gegebenen Beispielen in.Fig. 2 bis 4 abweichenden Anordnungen realisiert werden. Entscheidend bleibt vielmehr, daß der Injektor vor oder unmittelbar bei Abschluß seiner vertikalen Injektionsbewegung in eine starke rotierende Bewegung versetzt wird, welche in geeigneter Weise erzeugt wird.und*durch geeignete, mit dem Injektor fest verbundene Konstruktionselemente gleichzeitig eine Konvektion der Kühlflüssigkeit bewirken.Es ist weiterhin unerheblich, ob die Injektion der Probe 10 durch ein Federelement 14 oder auf eine nicht näher darzustellende, weil technisch bekannte Weise durch Gasdruck pneumatisch bewirkt wird. Gleiches gilt für den Kontakt zwischen den Kupplungselementen (30,34) und (33) bzw. (29) und (32). Schließlich betrifft

*qqE. zusätzlich BAD ORIGINAL

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die spezielle Art der Wirkverbindung zwischen dem Tnjektions Vorgang und dem Start der Rotation hierbei nicht den Erfindungsgedanken, so lange der geschilderte Funktionsablauf erhalten bleibt und in der geschilderten Weise den Aufbau störender Temperaturgradienten in der Kühlflüssigkeit 5 unterbindet.

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Claims

C. Reichert Optische Werke AG IJernalser Hauptstr. 21.!), Λ- 1.170 Wien Immersions-Kryofixation mit nachfolgender Rotation des Objekts. Ansprüche

1.· ' Vorrichtung zur Immersions-Kryofixatiori biologischer oder medizinischer Objekte (10) durch rasches vertikales Einbringen des an einem Injektor (12' ) befestigten und mittels dieses Injektors auf eine vorbestimrnt'.· Geschwindigkeit von 5 bis 15 m/sec beschleunigten Objekts (10) in eine auf eine Temperatur unter -100 C abgekühlte Kühlflüssigkeit (5), dadurch gekennzeichnet, daß die Probe (10) vor dem Abschluß oder zum Zeitpunkt des Abschlusses der vertikalen Injektionsbewegung mit dem

Injektor (12') in. eine Rotation versetzt wird und daß durch die hiermit

verbundene Konvektion der Kühlflüssigkeit (5) der weitere rasche Wärmeentzug aus der Probe (10) gewährleistet wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rotation des Injektors (12' ) durch eine rotierende Hülse (20, 21, 22, 23, 24) erzeugt wird, welche konzentrisch zu einem korrespondierenden Zylinder (IU) am Injektor (12' ) angeordnet ist, wobei der lichte Durchmesser der Hülse (IU) nur geringfügig größer ist als der äußere Durchmesser des Zylinders (19), so daß die Reibung der zwischen beiden Zylinderelementen befindlichen Luft eine Mitnahme und Rotation des Injektors (12' ) bewirkt.

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3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rotation des Injektors (]2') durch eine rotierende plane Scheibe (33) oder einen rotierenden Teil mit einer kegelförmigen Vertiefung (32) erzeugt wird, gegen die ein geometrisch jeweils gleichartig.geformtes, am Injektor (12' ) befestigtes Element (29, 30/34) mittels Federkraft (14) oder Gasdruck angepreßt wird.

4. Vorrichtung nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Rotation des Injektor« (12' ) durch einen mit hinreichender Geschwindigkeit aus einer .let-Düse? (37) austretenden Gasstrahl bewirkt wird, der auf ein am Injektor (12') befindliches Schaufelrad ("Gasturbine", 36) auftrifft und hierdurch den Injektor (12') in eine drehende Bewegung versetzt.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß am Injektor (12' ) in unmittelbarer Nähe der Probe (10) Elemente (25, 25', 26, 27, 28) angebracht sind, welche bei der vorgesehenen Rotation des Injektors (12') in der Art eines Propellers auch bei rotationssynimetriseher Ausbildung des Probenträgers (9) und der Probe (10) eine Konvektion der Kühlflüssigkeit (5) erzeugen.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das auf einem rotationssymmetrischen Träger (9) aufgebrachte Objekt (10) mit diesem Träger (9) am Injektor (12' ) derart montiert ist/, daß die Achse des rotationssymmetrischen Trägers (9) nicht mit der Achse des Injektors (12') übereinstimmt, so daß durch den Proberiträger (9) bei der vorgesehenen Rotation des Injektors (12' ) eine Konvektion der Kühlflüssigkeit (5) erzeugt wird.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung, welche die vorgesehene Rotation des Injektors bewirkt (22, 23, 24, 36/37),durch eine Wirkverbindung mit dem Injektionsvorgiing automatisch in Gang gesetzt wird.

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8. Vorrichtung nach pi nein der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Laufzeit der Vorrichtung (22, 23, 24, 36/37), welche die vorgesehene Rotation des Injektors (12' ) bewirkt, durch einen Zeitschalter oder ein ähnliches Element in technisch bekannter Weise auf jene Zeitspanne begrenzt wird, die zur einwandfreien Stabilisierung der gefrorenen Probe (10) erforderlich ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch B, dadurch gekennzeichnet, daß die Laufzeit der Vorrichtung (22, 23, 24, 36/37), welche die vorgesehene Rotation des Injektors (12' ) bewirkt, mittels eines entsprechenden Elements digital oder ruinlog vorgewählt werden kann, so daß die Zeitspanne unterschiedlichen Objekten (iü) und/oder methodischen Erfordernissen angepaßt werden kann.

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