DE2809880C3 - Anordnung zur Präparation von Suspensionen für die Mikroskopie, insbesondere Elektronenmikroskopie, durch Kryofixation - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Präparation von Suspensionen für die Mikroskopie, insbesondere Elektroncnmikroskopie, durch Kryofixation auf einer hochglanzpolierten, vorzugsweise mittels eines flüssigen Kühlmediums tiefgekühlten, metallischen Kühlfläche. Die Suspensionen enthalten menschliche, tierische oder pflanzliche Zellen bzw. Organismen mit Durchmessern in einer Größenanordnung unter 1 mm oder sonstige in einem flüssigen Medium suspendierte Partikel in kolloidal oder iirobdispcrser Verteilung.

Nach dem Stande der Technik werden native, d. h. in keiner Weise vorbehandelte Suspensionen für lichtmikroskopische, insbesondere für elektronenmikroskopischc Untersuchungen immer häufiger dadurch fixiert, daß sie einer rapiden Abkühlung unterworfen werden, welche alle laufenden Lebens-, Aggregations-, Dispersions- oder sonstigen Prozesse schlagartig durch Einfrieren zum Stillstand bringt und das Objekt damit in einem Zustand stabilisiert, der dem unmittelbar vor dem Einfrieren gegebenen Zustand möglichst genau entspricht. Die Qualität dieser »Kryofixation« ist dabei primär im weiten Umfang von der Geschwindigkeit der Abkühlung (»Abkühlungsratc«) abhängig. Hei den am häufigsten verwendeten und vor allem in Biologie und Medizin interessierenden wässerigen Suspensionen gewährleisten nur Abkühlungsraten in der Größenordnung von K)OOO" C/sec oder darüber ein »glasartiges« Erstarren (»Vitrifi/ieren«) des Obiektes, welches insbeson-

dere für eine nachfolgende elektronenoptische Untersuchung sowie für eine damit gekoppelte Elektronenstrahl-Mikroanalyse hoher Auflösung eine unabdingbare Voraussetzung darstellt.

Sinkt die Abkühlungsrate erheblich unter 10000° C/sec, so tritt bei diesen Objekten beispielsweise eine Entmischung der wässerigen plasmatischen Mischphasen ein, weiche zur Bildung von störenden Eiskristallen führt, was bereits aus der Tieftemperaturkonservierung von Blut und Lebensmitteln bekannt ist und eine sinnvolle morphologische oder chemische Analyse der Ultrastrukturen nach normalem Einfrieren vollkommen ausschließt. Diese Eiskristallbildung läßt sich nur durch eine chemische Vorbehandlung der Objekte mit Gefrierschutz- und/oder Fixationsmedien verhindern, welche aber ihrerseits die Objekte in einen Zustand überführen, der vom Lebenszustand erheblich abweicht. Neuerdings ist man daher bestrebt, derartige Suspensionen ohne jede Vorbehandlung, also »nativ« einzufrieren. Für die Bildung von Eiskristallen in derartigen nativen Suspensionen ist nicht in jedem Fall eine zu niedrige Abkühlrate die Ursache. Es können sich vielmehr in einem bei einer Kühlrate über 10000° C/sec primär glasig erstarrten Objekt sekundär Eiskristalle im Wege eines Rekristallisationsprozesses bilden, z. B. wenn das eingefrorene Objekt für längere Zeit auf Temperaturen über 180° K erwärmt wird. Es müssen also beide Bedingungen, nämlich eine hohe Abkühlungsrate von rund 10000° C/sec sowie eine weitere Präparation unterhalb 180° K. strikt eingehalten werden, wenn man Eiskristallartel'akte vermeiden und damit geeignete Objekte für eine morphologische und/oder chemische Analyse hoher oder höchster Auflösung erhalten will. Ähnliches gilt sinngemäß für kolloid- oder grobdisperse Suspensionen in anderen Suspensionsmedien sowie für Suspensionen, welche nicht lebende Zellen, sondern leblose, jedoch physikochemische instabile Teilchen enthalten.

Da sich beispielsweise beim Abkühlen biologischer Objekte in wässerigen Suspensionen der Temperaturgradient zwischen der Grenzfläche der Suspension und der in die Suspension vordringenden »Kältewellen« sehr rasch verringert, können aus naturgesctzlichen Gründen nur in einer äußeren Randzone von rund 50 μίτι diejenigen hohen Abkühlungsraten in der Größenordnung von H)(K)O C see erzielt werden. welche primär für ein glasartiges Erstarren erforderlich sind. Die exakte Breite dieser gut erhaltenen Randzone ist dabei sowohl vom Objekt wie von der Kühlmethode abhängig. Methodisch entscheiden vor allem das Wärmeleitvermögen und die Wärmekapazität des Kühlmcdiums (»Kryogen«) über die /eitliehe Veränderung des Temperaturgradienten und damit über die Abkühlungsrate von Zonen, welche verschieden weit von der Objektoberfläche entfernt sind. Beim Eingießen von Suspensionen in ein verflüssigtes. in der Regel auf Siedetemperatur befindliches Gas (beispielsweise N,fl). tritt das Leidenfrostsehe Phänomen, d. i. eine Isolationswirkung durcli einen sofort . entstehenden Gasmantel, auf. Dies läßt sieh zwar durch teilweise Verfestigt rr "on N,fl im Wege einer kurzfristigen Druckminmiuug oder durch Verwenden eines Kryogens mit höherem Siedepunkt (beispielsweise tiefgekühltes Propan) ausschalten, nicht zu be- > seitigen ist jedoch das schlechte Wärmeleitvermögen, insbesondere aber die geringe Wärmekapazität aller flüssigen Kryogene. Diese Eigenschaften bewirken.

daß die dem Objekt eben entzogene Wärme zu einer Temperaturerhöhung im unmittelbar angrenzenden Kryogen führt und ihrerseits einen noch rascheren Abfall der Abkühlungsrate bzw. eine noch geringere Breite der brauchbaren, glasartig erstarrten Randschicht des Objektes zur Foige hat.

Diesem Nachteil kann nach in jüngster Zeit bekanntgewordenen Verfahren dadurch begegnet werden, daß man nicht größere Mengen der Suspension ι in das Kryogen eingießt, sondern entweder nur kleinste Tröpfchen, weiche man durch Vernebeln oder Versprühen herstellt (»Gefriersprühmethode«), oder daß man die Suspension in kleine Hohlzylinder aus Metall einschließt und diese Zylinder anschließend in ein flüssiges Kryogen einwirft oder durch einen kräftigen Kryogenstrom rasch abkühlt. Das »Gefriersprühen« gelingt beispielsweise dadurch, daß man die Suspension unter hinreichendem Druck durch eine sehr dünne Kanüle (Durchmesser unter 50 μπι) preßt, deren Öffnung sich in unmittelbarer Nähe des Kryogens befindet. Die hierbei erhaltenen kleinen Tröpfchen frieren nach dem Eintritt in das Kryogen sofort durch, nachdem ihre Wärmekapazität relativ niedrig und die Wärmeaustauschfläche relativ groß ist. Die Methode weist jedoch neben den genannten Vorteilen eine R.eihe von Nachteilen auf, welche ihren Einsatz begrenzen oder zumindest erschweren. Ein entscheidender Nachteil ist durch den verfahrensmäßig notwendigen geringen Durchmesser der Sprühkapillare bedingt: Objekte, deren Durchmesser über dem Kapillardurchmesser liegen, können nicht ohne Zerstörung ihrer Struktur versprüht werden. Bei Objekten, deren Durchmesser dem Durchmesser der Sprühkapillare nahe kommen, besteht die Gefahr einer artefiziellen Veränderung der Struktur. Viskose Suspensionen (Zellkulturen in viskosen Medien u. dgl.) können aus den verfahrensmäßig geforderten Kapillaren nicht oder nur unter Anwendung sehr hoher Drücke versprüht werden, so daß allein durch die Drucksteigerung in das Verfahren eine Komponente eingeführt wird, weiche unter Umständen zu einer artefiziellen Veränderung des Systems führen kann und in jedem Fall äußerst schwer zu kontrollieren und zu beurteilen ist. Schwer kontrollierbare Artefakte können darüber hinaus dadurch eingeführt werden, daß die Objekte vor dem Durchfrieren eine Zone bereits reduzierter Temperatur passieren und dabei einen Kälteschock erleiden. Dies ist sowohl beim Annähern der Sprühkapillare an das Kryogen als auch beim Versprühen aus größerer Entfernung beim Weg der Tröpfchen von der Kapillaröffnung bis zum Eintritt in das flüssige Kryogen nicht zu vermeiden. Schließlich ist die weitere Präparation, nämlich durch Gefrierschneiden oder Gefrierbruch der gefrorenen Mikrotropfen (»Eiskugeln«), dadurch relativ kompliziert, daß die für diese Behandlung geeigneten Kryogene flüchtig sind und die mikroskopisch kleinen Eiskugeln durch ein zusätzliches Medium zusammengekittet werden müssen.

Das Einfrieren von Suspensionen in kleinen Metallbehältern liefert zwar reproduzierbare Resultate beim Einfrieren, erfordert aber umfangreiche Vor- und Nacharbeiten, welche nun durch das erfindungsgemäß zu schaffende System vermieden werden sollen.

Den oben geschilderten Nachteilen könnte prinzipiell dadurch begegnet werden, daß man, wie in Fig. 1 der angeschlossenen Zeichnung dargestellt ist, die zu

untersuchende Suspension 1 auf eine hochglanzpolierte, durch ein flüssiges Kryogen 2 tiefgekühlte metallische Kühlfläche 3 eines Kühlkörpers 4 gießt, der gemeinsam mit der auf einem Dewargefäß S befindlichen Halterung 6 eine Kühlkammer 7 begrenzt, wel- "> ehe üblicherweise durch einen Deckel 8 (strichliert dargestellt) erschlossen ist. Derartige Kühlvorrichtungen wei oen nach dem Stand der Technik zur Kryofixation freier Oberflächen und frischer Schnittflächen nativer biologischer Organe oder Gewebe verwendet. n> Im vorliegenden Falle erhält man jedoch beim Eingießen der Suspension infolge des relativ langsamen Flusses der Suspension und der extrem niedrigen Temperatur in der Kühlkammer nur sehr kleine und nicht exakt reproduzierbare Kontaktflächen zwischen ι > Metal! und Suspension, solange die Geschwindigkeit der nachströmenden Suspension in einem Bereich unterhalb 50 cm/sec liegt. Es kommt hierbei, wie Fig. 1 erkennen läßt, zu einem Einfrieren, welches stalagmitenähnlich verläuft. Bei fortgesetztem weiteren Zufluß bilden sich in der Regel durch seitliches Abfließen der Suspension weitere Kontaktstellen der gleichen Art. Die erhaltenen Präparate sind jedoch infolge der unregelmäßigen Kontaktflächen für die weitere Präparation nicht optimal geeignet, weil nur die Kontakt- 2-5 flächen in einer Tiefe von rund 50 μηι eiskristallfrei vitrifiziert werden, alle anderen Zonen demgegenüber die bekannten Eiskristallartefakte aufweisen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung zu schaffen, die es ermöglicht, die rapide Kryofixation von Suspensionen auf tiefgekühlten, hochglanzpolierten Metallflächen so durchzuführen, daß reproduzierbar tiefgefrorene Präparate entstehen, welche bei der weiteren Präparation einfach und sicher zu handhaben sind sowie den in jedem Fall erforderlichen Kryotransfer in die nachgeschalteten Präparationssysteme (Gefrierbruch-Gefrierätz-Anlage, Kryo-Ultramikrotom) ohne Risiko einer Erwärmung auf Temperaturen über 180° K zulassen.

Die genannte Aufgabe wird durch den Gegenstand des Anspruchs 1 gelöst.

Durch das Merkmal a) gemäß dem kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 wird es ermöglicht, die Suspension durch ein Rohr mit der erforderlichen Austrittsgeschwindigkeit von über 50 cm/sec in einem dünnen Strahl auf der Kühlfläche auftreffen zu lassen, vgl. Fig. 2, entsprechend der ein Flüssigkeitsstrahl, z. B. mittels eines Injektionssystems 9 erzeugt werden kann, wobei die Suspension 1 aus einer Kanüle 10 auf die Kühlfläche 3 gespritzt wird. Hierbei friert die Flüssigkeit in der Form eines dünnen, flächigen Überzuges auf der hochglanzpolierten Metallfläche auf. Der entstandene Film kann von dieser Fläche nachträglich ohne Schwierigkeiten gelöst werden. Es ergeben sich jedoch bei der weiteren Präparation dieser dünnen Filmschicht sowohl beim Kryotransfer zur Gefrierbruch-Gefrierätz-Anlage wie zum Kryo-Ultramikrotom wie auch bei der Verarbeitung in diesen Anlagen schwer zu bewältigende Probleme. Auf der einen Seite treten bei dermaßen dünnen Schichten in- bo folge des ungünstigen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses sehr rasch Erwärmungen auf, die zu einer Rekristallisation der glasartig erstarrten wässerigen Phasen führen. Auf der anderen Seite ist es schwierig, dermaßen fragile, dünne Häutchen in der Gefrierbruchanlage oder im Kryo-Ultramikrotom für die weiteren Präprationsschritte hinreichend stabil zu haltern.

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40 Das Merkmal b) gemäß dem kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 verhindert dann, daß sich die injizierte Suspension in Form eines dünnen Filmes über eine größere Fläche, beispielsweise die gesamte Kühlllache, verteilt und dabei einen bei der nachfolgenden Präparation schwer zu handhabenden, extrem dünnen Film bildet.

Zum Aufbringen der Suspension auf die Kühlfläche ist zweckmäßig eine solche Injektionsvorrichtung (»Injektor«) vorgesehen, die nach Art einer Injektionsspritze ausgebildet ist und einen Hohlzylinder mit angeschlossener Kanüle sowie einen Kolben zum Füllen und raschen Entleeren des Hohlzylinders aufweist. Eine vorteilhafte, automatisch wirkende Injektionsvorrichtung besteht darin, daß der Hohlzylinder des Injektors mit vertikaler Achslage über der metallischen Kühlfläche in einer Halterung mit zylindrischer Aufnahmebohrung mittels eines Sperrgliedes gehaltert ist, dessen Betätigung den freien oder durch zusätzliche Elemente beschleunigten Fall des Injektors über eine begrenzte Strecke freigibt, nach der die Bewegung auf an sich bekannte Weise ruckartig gestoppt wird, wobei der mit einer entsprechenden tragen Masse gekoppelte Kolben seine Bewegung fortsetzt und den raschen Ausstoß der vorher angesaugten Suspension in Richtung auf die Kühlfläche ermöglicht.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung besteht darin, daß der Ring oder Behälter für die Aufnahme der Suspension in der Weise, z. B. durch einen aus dem Ring nach unten vorragenden Teil des gefrorenen Suspensionspräparates oder durch einen schräg verlaufenden Boden des Aufnahmebehälters für die Suspension ausgebildet ist, daß die Kontaktfläche der Suspension mit der Kühlfläche für die Kryofixation bei einer nachfolgenden Gefrierschnittpräparation gegenüber der normal vorjustierten Messerschneide einen Winkel über 5° bildet, so daß die optimal fixierte Randzone des gefrorenen Suspensionspräparates schräg angeschnitten wird.

Die erfindungsgemäße Anordnung läßt sich in verschiedener Weise verwirklichen. Dies wird nachfolgend anhand nicht beschränkender Ausführungsbeispiele erläutert, wobei eine geeignete technische Ausführungsform des Injektors sowie drei verschiedene Ausführungsformen für die Auffangvorrichtung auf der Kühlfläche im einzelnen beschrieben werden In den weiteren Zeichnungen zeigt

Fig. 3 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Anordnung, umfassend einen Injektor und eine erste Ausführungsform einer Auffangvorrichtung füi die Suspension, im Vertikalschnitt,

Fig. 4 eine zweite Ausführungsform einer Auffangvorrichtung für die Suspension, im Vertikalschnitt, und

Fig. 5 a und 5b eine dritte Ausführungsform einei Auffangvorrichtung für die Suspension, ebenfalls irr Vertikalschnitt.

Gemäß Fig. 3 ist über der Kühlfläche 3 des metal lischen Kühlkörpers 4 ein Injektor der nachstehenc beschriebenen Bauart angeordnet. In der Bohrung ei ner Halterung 11 befindet sich ein Hohlzylinder 12 welcher in der Art einer medizinischen Injektions spritze mit einer Kanüle 13 versehen ist, deren freiei Durchmesser etwa 1 mm beträgt. Ein massiver, gu dichtender Kolben 14 erlaubt, wiederum analog zui Injektionsspritze, das Ansaugen bzw. Ausspritzen voi Suspension in bzw. aus dem Hohlzylinder 12. Durcl Betätigungeines Sperrbolzens 15 wird der Injektions

Vorgang ausgelöst, bei welchem zunächst der gesamte Injektor die Strecke α im freien Fall zurücklegt. Diese Bewegung wird beim Auftreffen des Flansches 16 des Hohlzylinders 12 auf der Halterung 11 abrupt gestoppt. Lediglich der bislang durch Reibungskräfte in seiner Relativposition zum Hohlzylinder 12 gehaltene Kolben 14 setzt infolge seiner hohen Masse den Weg fort und bewirkt damit den ruckartigen Ausstoß der vorher angesaugten Suspension 17 sowie einer zum Auffüllen bei Bedarf gesondert vorgesehenen Füllflüssigkeit 18. Beide Flüssigkeiten treffen zeitlich aufeinanderfolgend auf die Kühlfläche 3 auf und füllen einen auf dieser aufgelegten Ring 19, wobei zwischen der Suspension 17 und der metallischen Kühlfläche 3 ein direkter Kontakt entsteht, der die geforderten hohen Abkühlraten über 10000° C/sec an dieser Grenzfläche gewährleistet. Demgegenüber erstarrt die nachfolgende Kühlflüssigkeit 18 unter Bedingungen, die den strengen Grenzforderungen für eine Kryofixation nicht mehr entsprechen. Die damit erhaltene eingefrorene zylindrische Probe kann aufgrund ihrer Form wie ihres Volumens und ihrer sonstigen geometrischen und stofflichen Beschaffenheit ebenso gehandhabt werden wie ein Zylinder aus einem menschlichen, tierischen und pflanzlichen Organ oder Gewebe und kann daher in der nach dem derzeitigen Stand der Technik bekannten Weise weiter präpariert werden (Kryolagerung in flüssigen Kryogen, Kryotransfer. Gefrierbruch-Gefrierätzung, Gefrieranschnitt-Gefrierätzung, Gefrierschneiden).

Die in Fig. 4 dargestellte zweite Ausführungsform der Auffangvorrichtung für die Suspension betrifft eine vorteilhafte Ausgestaltung des erfindungsgemäß auf die Kühlfläche 3 lose aufgelegten Ringes. Gemäß Fig. 4 weist die glatte Innenfläche dieses Ringes 20, anstelle der zylindrischen Form des Ringes 19, eine schwach konische Form auf. Dadurch wird es insbesondere erleichtert, das eingefrorene Suspensionspräparat 21, zweckmäßig nach Verschiebung der Kühlfläche 3, einfach aus dem Ring 20 herauszustoßen und durch eine öffnung im Kühlkörper 4 nach unten in das flüssige Kryogen abzuwerfen.

Gemäß Fig. 5a und 5b besitzt die dritte Ausführungsart der erfindungsgemäßen Auffangvorrichtung für die injizierte Suspension die Form eines Auf nahmebehälters. Zu diesem Zwecke ist vorgesehen, daß zwischen die Kühlfläche 3 des Kühlkörpers 4 und der injizierten Suspension ein metallisches Zwischenelement 22 tritt, dessen Unterseite entsprechend der Kühlfläche exakt plan ausgebildet ist und daher einen optimalen Wärme kontakt gewährleistet. Dieses auf die Kühlfläche 3 lose aufgelegte Zwischenelement ZZ, welches seinerseits eine zur Kryofixation bestimmte hochglanzpolierte Oberfläche aufweist, kann insbesondere zur orientierten Aufnahme eines Ringes 23 ausgebildet sein, der die Verteilung der aufgebrachten Suspension 21 im wesentlichen auf den Bereich über der hochglanzpolierten Kühlfläche des metallischen Zwischenelementes 22 beschränkt. Der Ring 23 ist hierbei lose auf das Zwischenelement 22 aufgesetzt bo oder in bekannter Weise mittels einer einfachen Steckverbindung od. dgl. mit dieser verbunden. Die beschriebene Auffangvorrichtung ermöglicht einen Kryotransfer, währenddessen die Relativposition zwisehen den Teilen 22 und 23, wie sie in Fig. 5 a dargestellt sind, unverändert bleibt.

Nach vollzogenem Kryotransfer wird das Zwischenelement 22, das während des Kryotransfers sowohl Wärmeschäden wie Eisniederschläge vom Objekt fernhält, entsprechend Fig. 5 b abgenommen. Danach liegt die einwandfrei gefrorene Unterseite des Suspensionspräparates 21 zur Weiterbearbeitung frei, welche beispielsweise so erfolgen kann, daß man den Ring 23 direkt in die Objekthalterung eines Kryo-Ultramikrotoms einspannt und von der Fläche KK' Schnitte abnimmt. Eine einwandfreie Halterung des Objektes 21 im Ring 23 kann dabei durch eine entsprechende Oberflächenform der Innenfläche des Ringes 23, beispielsweise ein Feingewinde, erreicht werden. Soweit man die Ebene der Messerschneide MM' xm einen Winkel α (etwa 1°) zur Fläche KK' neigt, kann man relativ große Abschnitte der etwa 50 um tiefen, optimal fixierten Randzone auf einmal im Schnitt erhalten und darstellen. Das gleiche kann erfindungsgemäß bei entsprechend vorjustiertem Messer (Messerschneide exakt senkrecht zur Längsachse der Präparathalterung) dadurch erreicht werden, daß man die Fläche KK' gegenüber einer Fläche AA', die am Präparathalter des Kryo-Ultramikrotoms zur Aufnahme des Ringes 23 mit dem tiefgefrorenen Suspensionspräparat dient, um einen entsprechenden Winkel neigt. Eine analoge Lösung ergibt sich, wenn der Aufnahmebehälter für die Suspension mit einem schräg verlaufenden Boden ausgestattet wird.

Unabhängig von den in Fig. 3 und 4 dargestellten Kombinationen kann das erfindungsgemäße System in verschiedenen, konstruktiv möglichen Formen sowie aus unterschiedlichen Materialien verwirklicht werden. Dies gilt insbesondere für Ausführung, An-Ordnung und Arbeit des Injektionssystems, welches beispielsweise elektrisch ausgelöst oder pneumatisch betätigt werden kann, wobei eine Koppelung der Auslösung mit einem Mechanismus, der den Verschlußdeckel 8 (vgl. Fig. 1) über der Kühlkammer 7 öffnet, vorteilhaft hat. Ahnliches gilt für die Anpassung der Auffangvorrichtung an bereits bekannte und vorhandene Systeme zur Kryofixation von Organen und Geweben auf einer tiefgekühlten Metallfläche sowie an bereits vorhandenen Anlagen zum Gefrierbruch, zur Gefrierätzung, zum Gefrierschneiden sowie für die Beobachtung gefrorener Objekte. Ebenso kann sowohl das injektionssystem als auch die Auffangvorrichtung aus unterschiedlichen, speziell für die Kryopräparation geeigneten Materialien gefertigt werden, welche beispielsweise eine besonders geringe Oberflächenhaftung, ein besonders niedriges oder hohes Temperaturleitvermögen, eine besonders geringe Wärmeausdehnung oder weitere, im Hinblick auf die spezielle Problemstellung bedeutsame Eigenschaften aufweisen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Anordnung zur Präparation von Suspensionen für die Mikroskopie, insbesondere Elektronenmikroskopie, durch Kryofixation auf einer hochglanzpolierten, vorzugsweise mittels eines flüssigen Kühlmediums tiefgekühlten, metallischen Kühlfläche, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein mit der Suspension füllbares Rohr (13) mit einem lichten Durchmesser von 0,5 bis 2 mm vorgesehen ist, aus dem die Suspension (17) mit Hilfe einer Ausstoßvorrichtung mit hoher, über 50 cm/sec betragender Austrittsgeschwindigkeit auf die Kühlfläche (3) aufgebracht wird, und

b) koaxial zu der Achse des Rohren ein Ring (19 bzw. 20) oder ein entsprechender ringförmiger Behälter (22, 23) angeordnet ist, dessen äußere Bodenfläche in optimalem Wärmekontakt mit der Kühlfläche (3) steht und dessen innere Bodenfläche wie die Kühlfläche (3) ausgebildet ist, um die Verteilung der Suspension auf einen abgegrenzten Bereich der Kühlfläche einzuschränken.

2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausstoßvorrichtung einen Injektor umfaßt, vorzugsweise nach Art einer Injektionsspritze, welcher einen Hohlzylinder (12) mit als Kanüle ausgebildetem angeschlossenem Rohr (13) sowie einen Kolben (14) zum Füllen und raschen Entleeren des Hohlzylinders (12) aufweist.

3. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlzylinder (12) des Injektors mit vertikaler Achslage über der metallischen Kühlfläche (3) in einer Halterung (11) mit zylindrischer Aufnahmebohrung mittels eines Sperrgliedes (15) gehalten ist, dessen Betätigung den freien oder durch zusätzliche Elemente beschleunigten Fall des Injektors über eine begrenzte Strecke (β) freigibt, nach der die Bewegung ruckartig gestoppt wird, wobei der mit einer entsprechenden tragen Masse gekoppelte Kolben (14) seine Bewegung fortsetzt und den raschen Ausstoß der vorher angesaugten Suspension (17) in Richtung auf die Kühlfläche (3) ermöglicht.

4. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis

3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bewegung des dem Ausstoß der Suspension (17) dienenden Rohres (13) und/odcrder Ausstoß der Suspension selbst direkt oder über Zwischenglieder mit dem Öffnen einer Abdeckung über der metallischen Kühlfläche (3) dermaßen gekoppelt ist, daß das Öffnen der Abdeckung zwecks Vermeidung von Eisniederschlägen auf der Kühlfläche erst unmittelbar vor dem Aufbringen der Suspension (17) auf die Kühlfläche (3) stattfindet.

5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis

4, dadurch gekennzeichnet, daß der Ring (19 bzw. 20) auf die hochglanzpolierte metallische Kühlflache (3) lose aufgelegt ist und daß die Innenfläche des Ringes glatt sowie zylindrisch (19) oder leicht konisch (20) ausgebildet ist, wodurch das beim Tiefkühlen gebildete gefrorene Suspensionspriiparat (21) auf einfache Weise aus dem Ring (19 bzw. 20) ausstoßbar ist.

6. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß auf die, vorzugsweise durch direkten Kontakt mit einem flüssigen Kühlmedium gekühlte, metallische Kühlfläche (3) ein metallisches Zwischenelement (22) lose aufgelegt ist, welches seinerseits eine zur Kryofixation bestimmte hochglanzpolierte Oberfläche aufweist und zur orientierten Aufnahme eines Ringes (23) ausgebildet ist, der die Verteilung der aufgebrachten Suspension (21) im wesentlichen auf den Bereich über der hochglanzpolierten Kühlfläche des metallischen Zwischenelementes (22) beschränkt.

7. Anordnung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Innenfläche des Ringes (23) ein die Relativposition des gefrorenen Suspensionspräparates (21) zum Ring fixierendes Profil aufweist, das seinerseits zur Fixierung an anderen Apparaturen oder Halterungen ausgebildet ist.

8. Anordnung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Ring (19 bzw. 20) bzw. der Behälter (22, 23) für die Aufnahme der Suspension in der Weise, z. B. durch einen aus dem Ring nach unten vorragenden Teil des gefrorenen Suspensionspräparates (21) oder durch einen schräg verlaufenden Boden des Aufnahmebehälters (22, 23) für die Suspension, ausgebildet ist, daß die Kontaktfläche der Suspension mit der Kühlfläche für die Kryofixation bei einer nachfolgenden Gefrierschnittpräparation gegenüber einer normal vorjustierten Messerschneide einen ein schräges Anschneiden der Randzone des gefrorenen Suspensionspräparates (21) ermöglichenden Winkel unter 5°, vorzugsweise von etwa 1 ",bildet.