DE3610748A1 - Einrichtung zur kryofixation ruhender objekte durch eine tiefgekuehlte hochglanzpolierte festkoerperflaeche, insbesondere einen metallspiegel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Kryofixation biologisch-medizinischer oder ähnlicher Objekte mit den Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Zum raschen Einfrieren (Kryofixation) von Objekten oder Proben mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt, z.B. von biologisch-medizinischen Objekten oder in ihrer physiko­ chemischen Beschaffenheit entsprechender technischer Objekte wie Gallerten oder Suspensionen, werden heute für lichtmikroskopische, insbesondere aber für elektronen­ mikroskopische Untersuchungen vor allem zwei bei Atmos­ phärendruck ausgeführte Verfahren angewendet: Die Kryo­ fixation durch Eintauchen des Objekts in ein Kühlbad (Immersions-Kryofixation) sowie die Kryofixation durch Aufbringen des Objekts auf eine hochglanzpolierte Fest­ körper-Oberfläche (Metallspiegel- bzw. Impakt-Kryofixation oder "slamming". Das Objekt wird bei diesen Kryofixations­ prozessen zumindest oberflächlich so rasch abgekühlt, daß eine Entmischung der wässrigen bzw. flüssigen Mischphasen entweder vollständig unterbleibt (Vitrifikation) oder zumindest auf ein tragbares Ausmaß eingeschränkt wird.

Bei der Anwendung der Impakt-Kryofixation wird das Objekt zumeist auf einem Injektor befestigt und mit diesem auf eine ortsfeste Spiegelfläche eines tiefgekühlten Metall­ körpers abgesenkt, die in einer Kühlkammer angeordnet ist. Die Kühlkammer wird während dieses Vorgehens mit einem kalten Gas gefüllt oder gespült, das sich bei der einge­ stellten Temperatur nicht auf der Spiegelfläche nieder­ schlägt. Dieser Umstand wird beispielsweise bei einem mit flüssigem Stickstoff (N₂fl) gekühlten Spiegel (ca. -190°C) in einem kalten Stickstoffgas (N₂g), bei einem mit flüssigem Helium (He_fl) gekühlten Spiegel (ca. -260°C) in kaltem Heliumgas (He_g) ausgenützt.

Ein wesentlicher Nachteil bei dieser Vorgangsweise ergibt sich daraus, daß man das interessierende Objekt in aller Regel aus dem natürlichen Zusammenhang, z.B. aus dem Organismus eines Versuchstieres, heraustrennen und in eine für die Injektion geeignete Form bringen muß. Es gibt zahlreiche Fälle, in denen eine solche Exzision im Objekt so starke Veränderungen hervorruft, daß hierdurch jede weitere Arbeit ihren Sinn verliert. So kontrahieren beispielsweise Muskelzellen bei einer durch Schnitte hervorgerufenen Reizung; andererseits besteht häufig die Notwendigkeit, an einem Objekt komplizierte Eingriffe vorzunehmen, beispielsweise Nerven oder andere interessierende Strukturen freizulegen und/mit Mikroelektroden für elektro­ physiologische Experimente zu versehen. Gerade derartige elektrophysiologische Experimente erfordern aber eine rapide Fixation, wenn man bestimmte, durch Reize ("Stimuli") hervorgerufene kurzdauernde oder sehr schnell ablaufende Prozesse morphologisch darstellen will. Die Präparation des Objekts hierfür erfordert häufig einen erheblichen experimentellen Aufwand, so etwa eine thermostatische Regelung der Temperatur (z.B. auf 37°C, d.h. Warmblüter- Körpertemperatur) und/oder eine sog. "feuchte Kammer" mit annähernd 100% relativer Luftfeuchtigkeit, um Objektschäden durch Hypothermie oder Wasserverluste zu minimieren.

In diesen beispielhaft angeführten Fällen versagen die Kryofixationssysteme, bei denen das Objekt zunächst an einem Injektor befestigt und danach abwärts auf einen ortsfest in einer Kühlkammer angeordneten Metallspiegel abgesenkt wird. Andererseits haben sich hierbei auch zangenförmige Vorrichtungen zur Metallspiegel-Kryofixation, bei denen das Objekt zwischen zwei tiefgekühlten Metall­ spiegeln eingequetscht wird, nur in wenigen besonders geeigneten Fällen bewährt. Auch bei diesen spezifisch geeigneten Objekten erfordert aber die Handhabung einer derartigen "Kühlzange" eine grosse Geschicklichkeit, da Frostniederschläge auf den Spiegelflächen die Abkühl­ rate negativ beeinflussen und das Resultat der Kryo­ fixation zudem von der Geschwindigkeit des Quetschprozesses abhängt. Gute Ergebnisse können daher mit diesen einfachen Kryofixationssystemen nicht regelmässig erzielt werden.

Man hat deshalb auch schon Einrichtungen der eingangs ge­ nannten Art vorgeschlagen, bei denen eine tiefgekühlte Spiegelfläche gegen das ruhende Objekt bewegt wird. Bisher ist es jedoch noch nicht in zufriedenstellendem Maß gelungen, diese Spiegelfläche bis zum Auftreffen auf dem Objekt frei von Niederschlägen zu halten, durch die der Wärmeübergang beeinträchtigt wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Kryofixations-Einrichtung der eingangs geschilderten Gattung zu realisieren, mit der empfindliche Objekte in ruhendem Zustand mit einem beweglich angeordneten Festkörperspiegel rapide in Kontakt gebracht und abgekühlt werden können, ohne daß hierbei die Gefahr zusätzlicher präparations­ bedingter Veränderungen des Objektes (Artefakte) besteht, welche das Ergebnis entwerten, oder sich Frost (H₂O) oder Flüssigkeitsfilme (verflüssigter Sauerstoff) in störendem Umfang auf der Spiegelfläche niederschlagen, bevor der Festkörperspiegel das Objekt berührt.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die im Kennzeichenteil des Patentanspruches 1 angegebene Ausge­ staltung.

Erfindungsgemäß ist somit die Kryofixationseinrichtung so ausgebildet, daß die zunächst zum Schutz gegen Frost­ bildung oder Flüssigkeitsniederschläge durch eine Ab­ deckung bedeckte Spiegelfläche zum ruhenden Objekt hin bewegt wird. Während dieser Bewegung durch die Raum­ atmosphäre besteht keine Gefahr, daß die Qualität der Spiegelfläche durch Niederschläge beeinträchtigt wird. Durch eine spezielle Vorrichtung wird bewirkt, daß sich die Abdeckung erst knapp vor dem Kontakt zwischen der Spiegelfläche und dem Objekt automatisch von der Spiegel­ fläche löst, so daß die Spiegelfläche nur während einer extrem kurzen Zeitspanne der feuchten Raumluft ausge­ setzt wird. Diese Zeitspanne ist jedoch zu kurz, um Niederschläge an der Spiegelfläche zur Entstehung gelangen zu lassen.

Durch die erfindungsgemässe Ausgestaltung der Einrichtung ist es möglich, die Vorbereitung des Objekts in schonender Weise vorzunehmen, ohne daß aber auf ein hinreichend rasches und stets reproduzierbares Einfrieren der ober­ flächlichen Objektpartien verzichtet werden müsste.

Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist die Spiegelfläche an der Unterseite eines thermisch isolierten Behälters ausgebildet, der zum Abkühlen bei­ spielsweise mit N₂fl gefüllt wird und nach vollzogener Abkühlung abwärts auf das darunter befindliche Objekt abgesenkt werden kann. Dabei ist es möglich, den Behälter durch Federsysteme zu beschleunigen, um die optimale Geschwindigkeit auch bei einer relativ kurzen Fallstrecke, d.h. ohne ausgedehnte Fallbewegung, zu erhalten.

Nach einer anderen zweckmässigen Weiterbildung ist vorge­ sehen, daß mechanische oder magnetische Sperrvorrichtungen den bei einer elastischen Auflage des Objekts unvermeid­ lichen Rückprall des Spiegels ("bouncing") und einen hier­ durch unterbrochenen Abkühlvorgang am Objekt verhindern.

Die Abkühlung der Spiegelfläche kann dadurch erfolgen, daß in einen Metallkörper, der von dem die Spiegelfläche bildenden Körper getrennt ist, Kryogen eingefüllt und der Metallkörper mit dem die Spiegelfläche bildenden Körper während der Vorbereitungszeit in wärmeübertragendem Kontakt gehalten wird. Auf diese Weise muß lediglich die geringere Masse des die Spiegelfläche bildenden Festkörpers bewegt werden.

Die die Spiegelfläche bedeckende Abdeckung kann bei einem vorgegebenen und ggf. vorwählbaren Abstand zwischen der Spiegelfläche und der Objektoberfläche gesteuert mechanisch von der Spiegelfläche entfernt werden, wobei die Fall- oder Bewegungsenergie des die Spiegelfläche bildenden Körpers und der damit verbundenen bewegten Einrichtungsteile aus­ genützt werden kann. Es ist aber auch eine Steuerung der Art möglich, daß die Annäherung der Spiegelfläche an das Objekt elektrisch oder elektronisch abgetastet wird und bei Erreichen des vorgegebenen Abstandes die Abdeckung elektromotorisch entfernt wird.

Zweckmässigerweise besteht die Abdeckung aus einem spezifisch leichten Werkstoff, um ihre Masse möglichst gering zu halten und dadurch eine höchstmögliche Be­ schleunigung bei der Verschwenkung oder Verschiebung der Abdeckung kurz vor dem Auftreffen der Spiegelfläche auf das Objekt zu erzielen. Da die Abdeckung auch die Aufgabe hat, einen Wärmeaustausch zwischen der Umgebung und der Spiegelfläche soweit wie möglich zu verhindern, kommen hierfür thermisch isolierende Werkstoffe, z.B. aufge­ schäumte Kunststoffe, in Betracht, die ein sehr niedriges spezifisches Gewicht aufweisen.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung können darin bestehen, daß die Temperatur der Spiegelfläche durch einen Thermofühler gemessen und mittels dieses Thermofühlers das Erreichen einer optimalen Temperatur angezeigt und/oder die Temperatur auf einem Wert gehalten wird, der die Abscheidung von Filmen flüssigen Sauer­ stoffes auf der Spiegelfläche mit Sicherheit ausschließt.

Das Objekt kann sich während der Präparation in einer ebenfalls ortsfest angeordneten "feuchten Kammer" befinden, die lediglich die für die Präparation sowie für den Eintritt der Spiegelfläche erforderliche Öffnung aufweist. Die "feuchte Kammer" kann außerdem mit den für evtl. elektrophysiologische Experimente erforderlichen elektrischen Anschlüssen versehen sein und auch ein vergrösserndes optisches Beobachtungssystem aufweisen.

Nach einer besonderen Ausgestaltung kann die "feuchte Kammer" auch so ausgebildet sein, daß der gesamte Kammerraum mit Objekt und Spiegelfläche sofort nach der initialen Kryo­ fixation mit N₂Fl gefüllt und hierdurch abgekühlt werden kann, um dadurch eine möglichst rasche Wiederholung der einzelnen Kühlvorgänge zu ermöglichen und ein nach­ trägliches Aufwärmen der initial mit hoher Geschwindig­ keit eingefrorenen Lagen des Objekts über die für eine Rekristallisation kritische Temperatur zu unterbinden. Dabei kann das Einfüllen des N₂fl durch eine gesteuerte Koppelung nach dem Kontakt zwischen der Spiegelfläche und der Objektoberfläche automatisch gesteuert sein.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen.:

Fig. 1 eine schematische Darstellung, teilweise geschnitten, einer Einrichtung zur Metallspiegel-Kryofixation mit ruhendem Metallspiegel und bewegtem Objekt nach dem Stand der Technik;

Fig. 2a, 2b eine schematische Darstellung einer Kühlzange zur Kryofixation ruhender, insbesondere faseriger oder flächiger Objekte zwischen zwei tiefgekühlten Metallspiegelflächen nach dem Stand der Technik im geöffneten bzw. geschlossenen Zustand der Kühlzange;

Fig. 3 eine schematische Seitenansicht, teilweise geschnitten, einer ersten Ausführungsform der Einrichtung nach der Erfindung mit einem vertikal abwärts bewegbaren Metall­ spiegel und mit ruhendem Objekt;

Fig. 4 eine schematische Seitenansicht, teilweise geschnitten, einer zweiten Ausführungsform der Einrichtung nach der Erfindung mit einem auf einer Kreisbahn zum ruhenden Objekt hin bewegten Spiegel geringer Wärme­ kapazität und einem gesonderten Kühlsystem zur Kühlung des Spiegels in dessen angehobenem Zustand vor der Kryofixation;

Fig. 5 eine schematische Seitenansicht, teilweise geschnitten, einer der Ausführungsform gemäß Fig. 4 ähnlichen dritten Ausführungsform der Einrichtung nach der Erfindung mit einem gesonderten System zur Kühlung mit N₂fl oder N₂fl/He_fl mittels eines Durchfluß- Wärmetauschers mit Vakuum-Mantelisolation bei abge­ senktem Spiegel, wobei eine automatische Bedeckung der Kontaktflächen zwischen dem Kühlsystem und dem die Spiegelfläche bildenden Körper vorgesehen ist;

Fig. 6 in vergrösserter Darstellung eine schematische Teil­ ansicht des Durchfluß-Wärmeaustauschers gemäß Fig. 5 im Längsschnitt;

Fig. 7 ein Blockdiagramm einer Anordnung zur sukzessiven N₂fl-Vorkühlung sowie He_fl-Nachkühlung mittels eines Durchfluß-Wärmetauschers gemäß den Fig. 5 und 6, und

Fig. 8 eine schematische Seitenansicht einer der ersten Aus­ führungsform ähnlichen erfindungsgemäßen Einrichtung mit einem vergrössernden optischen System sowie mit einer in der Einrichtung angeordneten "feuchten Kammer".

Die in Fig. 1 rein schematisch im Querschnitt dargestellte Einrichtung zur Metallspiegel-Kryofixation entspricht dem Stand der Technik. Der als Kühlmedium (Kryogen) verwendete N₂fl 1 befindet sich in einem Dewargefäß 2 und kühlt einen Metallblock 3, der eine Spiegelfläche 4 bildet, auf eine Temperatur von etwa -190°C ab. Bei Verwendung von He_fl als Kryogen wird eine Temperatur von etwa -260°C erreicht. Der Metallblock 3 ist in einer Halterung 5 befestigt, die eine beispielsweise zylindrische Kühlkammer 6 bildet. Die Kühlkammer 6 wird durch das laufend aus dem N₂fl 1 ab­ siedende Stickstoffgas 7 kontinuierlich gefüllt und durch diesen Strom frostfrei, d.h. frei von Eisniederschlägen aus der Raumluft gehalten. Ein Objekt 8 ist auf einer elastischen Unterlage 9 auf einem Teller 10 eines Injektor­ stabes 11, der in einer Hülse 12 gleitend verschiebbar geführt ist, befestigt. Durch Herausziehen einer Auslöser­ klinke 13 aus einer Ringnut des Injektorstabes 11 bewegt sich der Injektorstab 11 und mit ihm das Objekt 8 unter Schwerkraft in Pfeilrichtung nach unten, bis das Objekt 8 die Spiegelfläche 4 berührt und auf dieser einfriert. Durch eine vorgespannte Druckfeder 14 kann der freie Fall des Injektorstabes 11 zusätzlich beschleunigt werden; durch einen Abstandring 15 (spacer) wird ein zu starkes Quetschen des Objektes 8 vermieden.

Die beschriebene Einrichtung hat sich in vielen Fällen ausgezeichnet bewährt, ermöglicht aber nur die Kryo­ fixation kleiner Objekte, welche keine komplizierten Präparationsarbeiten zur Darstellung bestimmter Strukturen oder zur Ausführung elektrophysiologischer Experimente erfordern, weil derartige Präparationsarbeiten in dem an der Unterseite des Injektorstabes 11 befestigten Zustand des Objekts nicht möglich sind bzw. ein Übertragen von Präparaten von einem Präparationsplatz auf den in seinen Abmessungen zwangsläufig kleinen Teller 10 bzw. die damit verbundene Unterlage 9 technisch unmöglich ist. Grössere Objekte können auch wegen ihres Gewichts nur mittels zu­ sätzlicher Spann- oder Haltevorrichtungen an der Unter­ seite des Tellers 10 befestigt werden.

Es ist deshalb schon eine Einrichtung gemäß Fig. 2 bekannt geworden, mit der länglich-fadenförmige Objekte 16 oder flächige Objekte 17 eingefroren werden können. Diese Ein­ richtung weist ein zangenartiges Werkzeug (Kühlzange) auf, deren beide Backen 26, 27 mit Metallteilen 18, 19 ausge­ stattet sind, welche zueinandergewendete Spiegelflächen 20, 21 bilden. Die Backen 25, 26 sind mittels thermisch iso­ lierter Handgriffe 23, 24 um eine Achse 22 relativ zueinander verschwenkbar, so daß ein Objekt 16 oder 17 zwischen den Spiegelflächen 20 und 21 eingeklemmt werden kann. Für die Kryofixation wird die Kühlzange zunächst gemäß Fig. 2b in flüssigen Stickstoff 1 eingetaucht, der sich in einem Behälter 27 befindet, und dadurch die Temperatur der Spiegel­ flächen 20, 21 auf den gewünschten Wert abgesenkt.

Diese bekannte Einrichtung ermöglicht zwar die Kryofixation eines ruhenden Objekts nach einer entsprechenden Vor­ präparation, hat aber eine Reihe störender Nachteile: Zunächst ist sie nur für Objekte geeignet, die eine faden­ förmige oder flächige Form aufweisen, so daß der Angriff der beiden Spiegelflächen 20, 21 von zwei Seiten aus er­ folgen kann. Die meisten Objekte sind jedoch weder faden­ förmig noch flächig geformt (z.B. Hirn, Leber, Niere, grössere Muskeln) und können daher mit dieser primitiven Einrichtung nicht eingefroren werden. Aber selbst bei be­ sonders geeigneten Objekten erweisen sich zwei Umstände als äußerst störend: Einerseits ist es praktisch unmöglich, die beiden Spiegelflächen 20, 21 nach dem Öffnen und beim Heranführen der Zange an das Objekt frei von Frostnieder­ schlägen zu halten, da die Kryofixation in der normalen feuchten Raumluft erfolgt, die oftmals noch zusätzlich zur Vermeidung von Austrocknungs-Artefakten an den feuchten Objektflächen bei der Arbeit in der "feuchten Kammer" mit Wasserdampf bis zur Sättigung (100% relative Luft­ feuchtigkeit) angereichert sein muß. Andererseits ist eine eindeutige Reproduzierbarkeit der Quetschvorgänge unmöglich, weil der jeweils angewendete Druck, der mittels der Spiegelflächen 20, 21 auf das Objekt 16 oder 17 aus­ geübt wird, in aller Regel entweder zu schwach oder zu stark und in jedem Fall unreproduzierbar ist. Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Nachteilen führt dies zu ständig wechselnden, zumeist auch unbefriedigenden Resultaten. Das ist um so ärgerlicher, als sich an die Kryofixation normalerweise komplizierte weitere Präparationen (Kryo-Ultramikrotomie, Gefriertrocknung oder Kryosubstitution mit nachfolgender Einbettung bei reduzierter Temperatur) anschließen und erst nach deren Abschluß, d.h. also sehr spät, die Qualität der Kryofixation im Elektronenmikroskop beurteilt werden kann.

Die bei den bekannten Einrichtungen gemäß den Fig. 1 und 2 auftretenden Nachteile lassen sich durch die erfindungs­ gemässe Einrichtung auf vergleichsweise einfache Art ver­ meiden. Die in Fig. 3 gezeigte erste Ausführungsform besteht im wesentlichen aus einer Grundplatte 101, an der zwei vertikale Säulen 102 in vertikaler Ausrichtung und parallel zueinander auf nicht näher gezeigte Weise starr befestigt sind. Der gleichbleibende Abstand zwischen den beiden Säulen 102 ist durch ein die oberen Säulenenden miteinander verbindendes Joch 103 gewährleistet. Ein Trägerarm 104 weist in der Nähe seines einen (in Fig. 3 linken) Endes zwei Bohrungen 105 auf, deren Abstand voneinander dem Abstand der Säulen 102 entspricht und mittels derer der Trägerarm 104 längs den Säulen 102 vertikal verschiebbar gelagert ist. Zwischen dem Joch 103 und dem Trägerarm 104 ist an jeder Säule 102 eine diese umgebende Schrauben­ druckfeder 106 vorgesehen, die in der oberen, in Fig. 3 dargestellten Stellung des Trägerarmes 104 auf einen vor­ gegebenen Wert vorgespannt sind. In der oberen Stellung wird der Trägerarm 104 durch einen das äußere Ende des Trägerarmes 104 untergreifenden Auslöserbolzen 107 gehalten, der in einer Hülse 108 gleitend verschiebbar geführt und aus der in Fig. 3 dargestellten Lage in Pfeilrichtung zurück­ gezogen werden kann. Die Hülse 108 ist in nicht näher dargestellter Weise an einer Strukturkomponente der Einrichtung selbst oder an einer der Einrichtung benach­ barten Wand befestigt. Der Auslöserbolzen 107 weist einen nicht gezeigten Handgriff auf, mittels dessen er betätigt werden kann, oder ist mit einer beispielsweise elektro­ mechanisch wirkenden Einrichtung verbunden, die durch Einschalten betätigt werden kann und den Auslöserbolzen 107 zurückzieht.

An dem (in Fig. 3 rechten) Ende des Trägerarmes 104 ist ein thermisch isolierender Mantel 109 auf nicht näher gezeigte Weise befestigt, in welchem ein teilweise hohl­ zylindrischer Metallblock 110 formschlüssig so festge­ halten ist, daß seine plane Unterfläche 111, die eine hochglanzpolierte Spiegelfläche bildet, in einer Ebene mit der unteren Begrenzungsfläche des Mantels 109 liegt. An der Oberseite des Mantels 109 ist ein Federgehäuse 112 befestigt, in dem eine Schraubenfeder 113 gelagert ist. Ein Ende der Schraubenfeder 113 durchsetzt eine Bohrung in der Gehäusewand des Federgehäuses 112 und ist dadurch fixiert, während das andere Ende der Schraubenfeder 113 in eine Bohrung einer Drehwelle 114 eingreift, die in einer zu der Längsachse des Metallblockes 110 parallel ver­ laufenden Bohrung 116 des Mantels 109 drehbar gelagert ist. Am unteren Ende der Drehwelle 114 ist eine Abdeckung 117 aus einem thermisch gut isolierenden Material starr befestigt, die an ihrem der Befestigung mit der Drehwelle 114 gegen­ überliegenden Ende eine Einkerbung 118 in ihrem Rand auf­ weist. Der Mantel 109 besitzt diametral gegenüber der Bohrung 116 eine weitere Bohrung 119, in der ein feder­ belasteter Auslösestift 120 mit einem senkrecht davon abragenden Auslösefinger 121 gleitend verschiebbar ange­ ordnet ist. Der Auslösefinger 121 durchsetzt ein Langloch 122 in dem Mantel 109. In dem in Fig. 3 gezeigten Zustand wird der Auslösestift 120 durch die zugehörige vorge­ spannte Feder nach unten bis zum Anschlag des Auslöse­ fingers 121 an dem Ende des Langloches 122 gedrückt und greift mit seinem aus der unteren Begrenzungsfläche des Mantels 109 hervorstehenden Ende in die Kerbe 118 der Abdeckung 117 ein. Weiterhin ist in dem in Fig. 3 gezeigten Zustand die Schraubenfeder 113 derart vorge­ spannt, daß sie auf die Drehwelle 114 ein kräftiges Drehmoment ausübt, das jedoch von dem Auslösestift 120 aufgenommen wird, so daß eine Drehbewegung der Abdeckung 117 nicht möglich ist.

Auf einer Unterlage 125 aus Filz oder Schaumstoff, die direkt oder über eine dazwischen befindliche, nicht gezeigte Unterlage auf der Grundplatte 101 aufliegt, ist ein Objekt 126 angeordnet und mittels Nadeln 127 darauf fixiert. Neben der Unterlage 125 und in der Be­ wegungsbahn des Auslösefingers 121 ist ein Anschlagstift 128 in die Grundplatte 101 höhenverstellbar eingeschraubt, so daß hierdurch das Auftreffen des Auslösefingers 121 bei der Abwärtsbewegung des Trägerarmes 104 exakt vorbe­ stimmt werden kann.

In einer horizontalen Bohrung einer Konsole 129, die in der Nähe der Säulen 102 an der Grundplatte 101 befestigt ist, ist gleitend verschiebbar eine federbelastete Sperr­ klinke 130 gelagert, deren freies Stirnende zu einer Schräg­ fläche geformt ist. Die Sperrklinke 130 weist einen nach oben ausragenden Finger 131 auf, der in den Grenzen eines Langloches 132 bewegbar ist. Die Schrägfläche der Sperr­ klinke 130 liegt in der Bewegungsbahn derjenigen Kante des Trägerarmes 104 bei dessen Bewegung längs der Säulen 102, die in der in Fig. 3 gezeigten Stellung des Träger­ armes 104 von dem Auslösebolzen 107 untergriffen ist. Die über dieser Kante befindliche obere Kante des Trägerarmes 104 erstreckt sich genausoweit nach außen wie diese untere Kante.

An den Säulen 102 ist weiterhin ein Endanschlag 133 mittels Schrauben festgeklemmt, der einen Permanent- oder Elektro­ magnet 134 aufweist, welcher mit der Oberfläche des End­ anschlages 133 bündig liegt. Die Sperrklinke 130 und der Endanschlag 133 mit dem darin befindlichen Magnet 134 dienen demselben Zweck, nämlich der Verhinderung eines Rückprallens (bouncing) des Trägerarmes 104 und der davon getragenen Komponenten beim Aufprall auf dem Objekt 126. Dabei genügt zu einer derartigen Verhinderung auch die Anordnung nur einer der beiden Vorrichtungen, nämlich der Sperrklinke 130 oder des Endanschlages 133.

Die Wirkungsweise der Einrichtung gemäß Fig. 3 ist folgende: Während der Präparation des Objekts 126 auf der Unterlage 125, auf der das Objekt gut zugänglich ist, wird der topf­ förmige Metallblock 110 mit flüssigem Stickstoff 135 (oder auch mit flüssigem Helium) abgekühlt, indem das Kryogen in den Innenraum des Metallblockes 110 eingefüllt wird. Zu diesem Zeitpunkt ist die Spiegelfläche 111 des Metall­ blockes 110 durch die Abdeckung 117 vor dem Zutritt feuchter Raumluft geschützt, so daß Frostniederschläge auf der Spiegelfläche 110 verhindert werden. Die Abdeckung 117 übt eine Doppelfunktion aus, weil sie zusätzlich zu der Verhinderung von Frostniederschlägen auf der Spiegelfläche 111 auch die Ausbildung grösserer Temperaturgradienten zwischen dem direkt gekühlten Inneren des Metallblockes 110 und der Spiegelfläche 111 verhindert. Nach dem Ab­ schluß der Präparationsarbeiten an dem Objekt 126 wird ent­ weder manuell oder über elektromechanische Betätigung der Auslösebolzen 107 in Pfeilrichtung zurückgezogen. Daraufhin bewegt sich der Trägerarm 104 mit dem daran befestigten Mantel 109 einschließlich der davon gehaltenen Komponenten unter der Schwerkraftwirkung und aufgrund der Entspannung der Schraubendruckfedern 106 zusätzlich beschleunigt nach unten gegen das ruhende Objekt 126. Während dieser Be­ wegung trifft der Auslösefinger 121 auf das obere Ende des Anschlagstiftes 128 auf und wird dadurch gegen die Federbelastung in Richtung des eingezeichneten Pfeiles nach oben verschoben. Als weitere Folge davon tritt das untere Ende des Auslösestiftes 120 aus der Kerbe 118 der Abdeckung 117 aus, so daß diese nunmehr freigegeben ist und aufgrund des an der Drehwelle 114 wirkenden Drehmoments der Schraubenfeder 113 schlagartig zur Seite geschwenkt wird. Diese Verschwenkung erfolgt unmittelbar vor dem Auftreffen der Abdeckung 117 auf dem Objekt 126, d.h. zu einem Zeit­ punkt, zu dem noch ausreichend Zeit für das Wegschwenken der Abdeckung 117 zur Verfügung steht und eine Berührung des Objekts 126 durch die Abdeckung 117 vermieden werden kann. Bei der üblicherweise praktizierten Auftreffgeschwindigkeit in einer Grössenordnung von 1 m/sec. bewirkt ein Abschwenken der Abdeckung 117 von der Spiegelfläche 111, das etwa in einem Abstand von 2 cm zwischen der Spiegelfläche 111 und der Oberfläche des Objektes 126 erfolgt, eine Rest-Verweil­ dauer der ungeschützten Spiegelfläche 111 in der Raum­ atmosphäre von < 20 msec. In dieser kurzen Zeitspanne kann weder eine störende Frostbildung auf der Spiegel­ fläche 111 noch eine spürbare Erwärmung der Spiegelfläche 111 durch die warme Raumluft beobachtet werden. Im Vergleich zu der Dauer der Exposition der Spiegelflächen 20, 21 bei der Kühlzange gemäß Fig. 2 ist jedenfalls die Expositions­ dauer der Spiegelfläche 111 bei der Einrichtung gemäß Fig. 3 vernachlässigbar kurz. Diese Zeitdauer kann, wie bereits erwähnt, durch Höhenverstellung des Anschlagstiftes 128 (durch heraus- oder hineinschrauben aus bzw. in die Grundplatte 101) festgelegt werden.

Am Ende der Absenkbewegung trifft die Spiegelfläche 111 auf dem Objekt 126 auf und kühlt zumindest dessen äußere, mit der Spiegelfläche 111 in Kontakt kommende Randzone rapide in der von der Metallspiegel-Kryofixation her bekannten Weise ab. In Fig. 3 ist die Stellung des Trägerarmes 104 und der daran befindlichen Komponenten, insbesondere die ausgeschwenkte Lage der Abdeckung 117 gestrichelt angegeben.

Nach der vollzogenen Kryofixation muß zur raschen Fort­ setzung der Arbeit die inzwischen vereiste Spiegelfläche 111 an dem Metallblock 110 rasch auf eine Temperatur erwärmt werden, bei der das niedergeschlagene Eis auf­ taut und das Wasser verdampft, um auf diese Weise die Einrichtung möglichst rasch für den nächsten Einfrier­ vorgang vorzubereiten. Zum Aufheizen des Metallblockes 110 ist ein vorgewärmter Metallkörper 136 von grosser Wärmekapazität vorgesehen, der in seinen Außenabmessungen den Abmessungen des Innenraumes des Metallblockes 110 weitgehend entspricht, so daß er in diesen eingeführt werden kann und dabei in innigem wärmeübertragenden Kontakt mit dem Metallkörper 110 steht. Alternativ oder zusätzlich kann in dem Metallblock 110 ein Heizwiderstand 137 angeordnet sein, der durch einen Thermofühler 138 und/oder durch einen nicht gezeigten Übertemperatur- Schutzschalter gesteuert ist. Der Thermofühler 138 bzw. der genannte Übertemperatur-Schutzschalter schalten den Heizwiderstand 137 beim Erreichen der gewünschten Maximal­ temperatur des Metallblockes 110 aus oder halten die Temperatur durch einen nicht gezeigten Regelkreis bekannter Art auf dem jeweils gewünschten und ggf. vorwählbaren Wert, der einerseits eine rasche Trocknung gewährleistet, anderer­ seits aber Schäden an der Einrichtung ausschließt. Die beschriebene Heizeinrichtung 137, 138 kann darüber hinaus mit Vorteil dazu genützt werden, die Minimaltemperatur der Spiegelfläche 111 auf einen Wert zu begrenzen, der über dem Siedepunkt des Sauerstoffes liegt. Die Abscheidung störender Sauerstoff-Filme auf der Spiegelfläche 111 wird durch diese Maßnahme mit Sicherheit ausgeschlossen. Schließlich kann der Thermofühler 138 in Verbindung mit einer nicht gezeigten elektrischen Schaltung, deren Bauweise auf dem einschlägigen Gebiet bekannt ist, vorteilhaft dazu eingesetzt werden, zusätzlich eine Temperaturanzeige, ein optisches und/oder akustisches Signal auszulösen, durch die der Benutzer der Einrichtung darauf aufmerksam wird, daß der Metallblock 110 im Zuge des beschriebenen Abkühlprozesses seine Betriebs­ temperatur (z.B. -180°C) erreicht hat und nunmehr einge­ setzt werden kann.

Die Sperrklinkenanordnung 130, 131, 132 sowie der Endanschlag 133 mit dem Magnet 134 verhindern beim Aufprall der Spiegel­ fläche 111 auf dem Objekt 126 eine elastische Rückfederung (bouncing). Dies geschieht dadurch, daß beim Auftreffen der (in Fig. 3) linken Kante des Trägerarmes 104 auf der als Schrägfläche ausgebildeten Stirnseite der Sperrklinke 130 diese gegen die Federwirkung in Pfeilrichtung zurückgeschoben wird, so daß ihre untere Kante bei der weiteren Bewegung des Trägerarmes 104 nach unten an dessen Stirnfläche entlang­ gleitet. Sobald jedoch die obere Kante des Trägerarmes 104 die untere Kante der Sperrklinke 130 passiert hat, springt letztere unter der Federwirkung augenblicklich über die Oberkante des Trägerarmes 104 ein und fixiert diesen gegenüber einer Rückbewegung. In gleichem Sinn wirkt der Magnet 134, der den aus ferromagnetischem Material bestehenden Trägerarm 104 anzieht und festhält.

Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 4 ist an einer Grundplatte 201 eine Konsole 202 befestigt, an der mittels eines Paares von Lenkerhebeln 203, 204 ein Montageelement 205 mit einem L-förmigen Querschnitt über Achsbolzen 206, 207 an dem Montageelement 205 bzw. Achsbolzen 208, 209 an der Konsole 202 nach Art einer Parallelogrammführung schwenkbar befestigt ist. Die beiden Lenkerhebel 203, 204 beschreiben an den Achsbolzen 206, 207 eine Kreisbahn mit dem Radius R. Ins­ gesamt wird das Montageelement 205 dadurch auf einer durch den gekrümmten Pfeil in Fig. 4 angedeuteten Kreisbahn bewegt.

In dem horizontalen L-Schenkel des Montageelements 205 ist ein pilzförmiger Metallkörper 210 von geringer Wärme­ kapazität und aus gut wärmeleitendem Material gelagert, der eine Auflage 211 aus einem Metall oder einem Mineral aufweist, dessen thermische Eigenschaften für die Kryofixation besonders gut entsprechen (vgl. hierzu beispielsweise W.B. BALD "Optimizing the cooling block for the quick freeze method" - Journal of Microscopy, Oxford 1983, Vol. 131, pp. 11- 23). In dem pilzförmigen Metallkörper 210 befindet sich wiederum ein Heizwiderstand 212 mit einem zugehörigen Thermofühler 213 zur Durchführung der bereits vorstehend in Zusammenhang mit Fig. 3 erläuterten Aufheiz- und Temperatursteuervorgänge. Die tellerförmige Verbreiterung 214 des Metallkörpers 210 weist eine gegenüber dem "Stiel" des pilzförmigen Metall­ körpers 210 verhältnismässig grosse kreisförmige und plane Kontaktfläche 215 auf, die mit der Oberseite des horizontalen L-Schenkels des Montageelements 205 bündig oder geringfügig darüber liegt. Die Unter­ fläche der Auflage 211 verläuft bündig mit der Unterseite des horizontalen L-Schenkels und ist bedeckt von einer Ab­ deckung 216 aus thermoisolierendem Werkstoff - die ebenso wie die Abdeckung 117 bei der Ausführungsform gemäß Fig. 3 - als flache Scheibe ausgebildet und in Kontakt mit der Unter­ seite des L-Schenkels in einer Horizontalebene verschwenkbar ist. Hierzu dient eine nicht näher bezeichnete Drehwelle, die durch eine elektrische Drehspulanordnung 217 verdrehbar ist. Zum Zweck der Wärmeisolierung ist der Metallkörper 210 in einem vakuumdicht mit dem Metallkörper verbundenen Hohlzylinder 218 aufgenommen, in dem für die Tieftemperaturarbeit mit flüssigem Stick­ stoff oder flüssigem Helium ein Molekularsieb 219 ent­ halten ist. Zum Schutz vor Wärmeverlusten ist zusätzlich der ganze horizontale L-Schenkel des Montageelements 205 aus einem thermoisolierenden Material gefertigt.

Bei dieser Ausführungsform erfolgt die Abkühlung des die Spiegelfläche an der Unterseite der Auflage 211 bildenden Metallkörpers 210 durch einen separat ange­ ordneten Metallblock 220, der in der Abkühlphase (entsprechend der Darstellung in Fig. 4) mit der Oberfläche 215 des Metall­ körpers 210 in innigem Kontakt steht und damit einen maximalen Wärmefluß von dem Metallblock 220 in den Metallkörper 210 gewährleistet. Der Metallblock 220 ist von zylindrischer Gestalt und in seinem oberen Bereich zur Aufnahme von flüssigem Kryogen 221 topfförmig ausgebildet. Er ist in nicht näher gezeigter Weise in einem Mantel 222 aus thermisch isolierendem Material und unter einer Abdeckung 223 dieses Mantels befestigt. Der Mantel 222 ist seinerseits über einen Tragarm 225 an einer Säule 226, die nach oben aus der Konsole 202 herausragt, auf- und abverstellbar angeordnet. Zu diesem Zweck weist der Tragarm 225 eine auf den Durch­ messer der Säule 226 abgestimmte Bohrung 227 auf, in deren Bereich ein Reibrad 228 gelagert ist, das aufgrund seiner elastischen Materialeigenschaft mit einer gewissen Vor­ spannung an dem Umfang der Säule 226 anliegt und durch ein Handrad 229 verdreht werden kann. Durch Verdrehung in der einen oder anderen Richtung des Handrades 229 (siehe Doppelpfeil) kann der Mantel 222 und mit ihm der Metall­ block 220 in oder außer Kontakt mit der Oberseite des horizontalen L-Schenkels des Montageelements 205 gebracht werden. Das Reibrad 228 ist selbsthemmend und kann durch Reibung den Tragarm 225 in einer eingestellten Lage halten. Die Lenkerhebel 203, 204 weisen Arme 203′, 204′ auf, von denen der obere Arm 203′ in der in Fig. 4 gezeigten oberen Stellung des Montageelements 205 durch einen Auslöserbolzen 230 übergriffen ist, so daß dadurch das Montageelement 205 in der genannten Stellung fixiert ist. Der Auslösebolzen 230 hat eine Funktion, wie sie in Zusammenhang mit dem Auslösebolzen 107 bei der Ausführungsform gemäß Fig. 3 bereits erläutert ist, und ist von einem entsprechenden Aufbau. Der untere Arm 204′ wird hingegen von einer Sperrklinke 231 erst dann untergriffen, wenn das Montageelement 205 nach der Aus­ lösung seine unterste Lage erreicht hat. Die Sperrklinke 231 hat die Funktion, einen Rückprall zu verhindern und ist analog aufgebaut wie die Sperrklinke 130 bei der Ausführungsform gemäß Fig. 3 mit dem Unterschied, daß die Schrägfläche an ihrer Stirnseite im Hinblick auf die Bewegung des Armes 204′ von unten nach oben in umgekehrtem Sinn verläuft.

In der Konsole 202 ist eine Lichtquelle 235 einer Licht­ schranke 236 angeordnet, die zur elektrischen Steuerung der Drehspulanordnung 217 für die Betätigung der Ab­ deckung 216 in einer noch zu beschreibenden Weise dient. Auf der Grundplatte 201 ist wieder eine Filzunterlage 237 für ein mit Nadeln 238 befestigbares Objekt 239 angeordnet und in der Bewegungsbahn des Montageelements 205 befindet sich auch ein in seiner Höhe justierbarer Anschlagstift 240, der eine reproduzierbare und vorwähl­ bare Endstellung der Spiegelfläche 211′ an der Unter­ seite der Auflage 211 gewährleistet.

Die Wirkungsweise der Ausführungsform gemäß Fig. 4, die ein äußerst rasches Arbeiten bei einem minimalen Kryogen­ verbrauch ermöglicht und auch die Möglichkeit eröffnet, flüssiges Helium einzusetzen, ohne hierfür unvertretbar grosse Mengen dieses teuren Kryogens zu verbrauchen, ist folgende: Während der Präparation des Objekts 239 wird der Metallkörper 210 durch den zu diesem Zweck mittels des Handrades 229 abgesenkten Metallblock 220 gekühlt, wobei die Oberfläche 215 des Metallkörpers 210 in innigem Kontakt mit der Unterfläche des Metallblockes 220 steht. Infolge der geringen Masse des Metallkörpers 210 erreicht die Spiegelfläche 211′ binnen Minutenfrist eine Temperatur nahe -190°C, die über den Thermofühler 213 meßbar und überwachbar ist. Ist die Betriebstemperatur der Spiegel­ fläche 211 erreicht und sind die Präparationsarbeiten an dem Objekt 239 beendet, so kann der Auslösebolzen 230 ausgelöst werden, woraufhin unter dem Einfluß der Schwer­ kraft sowie unter der Beschleunigungswirkung einer zu­ sätzlichen Zugfeder 241 die Lenkerhebel 203, 204 nach unten verschwenken. Unterbricht die untere Kante des Montage­ elements 205 während der Abwärtsbewegung die Lichtschranke 235, 236, so gibt diese über eine nicht gezeigte Schaltung ein Signal an die Drehspulanordnung 217, so daß diese augenblicklich betätigt und die Abdeckung 216 von der Spiegelfläche 211′ weggeschwenkt wird. Unmittelbar nach dem Freilegen der Spiegelfläche 211′, d.h. innerhalb eines Zeitraumes von < 20 msec., tritt der Kontakt der Spiegel­ fläche 211′ mit dem Objekt 239 ein.

Bei Erreichen des Objekts 239, d.h. der unteren Endstellung des Montageelements 205 schnappt die Sperrklinke 231 unter den Arm 204′ ein und fixiert damit das Montageelement 205 gegenüber einem Rückprallen.

Während des Aufheizens des Metallkörpers 210 aus den bereits in Zusammenhang mit Fig. 3 erläuterten Gründen wird durch Betätigung des Handrades 229 der Metallblock 220 in der Ebene E-E von dem Metallkörper 210 getrennt. Die freiliegende untere Kontaktfläche des Metallblockes 220 kann zu diesem Zeitpunkt mit einer thermisch isolierenden Abdeckung, die nicht dargestellt ist, abgedeckt werden. Diese kann beispielsweise mittels eines Haftmagneten oder durch einen Bajonettverschluß auf einfache Weise befestig­ bar sein und dient dazu, den Aufbau störender Frostschichten an der Kontaktfläche zu verhindern. Eine entsprechende Ab­ deckung, die in Fig. 4 ebenfalls nicht gezeigt ist, kann für die Oberfläche 215 des Metallkörpers 210 vorgesehen sein (vgl. hierzu die Ausführungsform gemäß Fig. 5).

Die Ausführungsform gemäß Fig. 5 ähnelt in ihrem prinzipiellen Aufbau sehr derjenigen nach Fig. 4 und wird nachfolgend deshalb lediglich im Hinblick auf die abweichenden Merkmale näher erläutert. So ist bei dieser anstelle des Metall­ blockes 220 bei der Ausführungsform gemäß Fig. 4 ein Kühl­ system in Gestalt eines Durchflußkühlers vorgesehen, der sowohl für flüssigen Stickstoff als auch für flüssiges Helium als Kryogen geeignet ist. Dieser Durchflußkühler besteht beispielsweise aus einem Metallkörper 301 von geringer Wärmekapazität und guter Wärmeleiteigenschaft (z.B. aus Aluminium), dessen Unterfläche 302 mit der planen Fläche 303 des pilzförmigen Metallkörpers 304 korrespondiert und während der Kühlphase mit dieser in innigem Kontakt steht. Der Metallkörper 301 weist eine Bohrung auf, die Kühlrippen 305 als Elemente zur Ver­ grösserung der Oberfläche und damit des Wärmeaustausches aufweist (vgl. Fig. 6). An die Bohrung schließen sich beidseitig Anschlüsse 306, 306′ zum Einleiten bzw. Ab­ leiten von flüssigem Kryogen an, die im dargestellten Ausführungsbeispiel (Fig. 5, 6) als Vakuum-Mantelrohre ausgebildet sind, die sich von einem Vakuum-Mantelsystem 307 fortsetzen und zu dessen Anschlüssen konzentrisch liegen. Der Durchflußkühler 301 bzw. das Vakuum-System 307 sind nach oben hin durch eine deckelförmige Thermo­ isolation 308 abgeschlossen, die zugleich zur Montage des Durchflußkühlers 301 an dem Tragarm 309 dient. Die Kühlfläche 302 kann z.B. mittels eines thermisch iso­ lierenden Deckels 310, der durch einen Drehbolzen 311 und mittels einer Drehfeder 312 verschwenkbar ist, abgedeckt und dadurch im Dauerbetrieb praktisch frostfrei gehalten werden. Durch eine nicht gezeigte Einrichtung kann dafür gesorgt sein, daß der Deckel 310 automatisch beim Absenken des Tragarmes 309 betätigt wird. Eine analoge Anordnung kann für die Kontaktfläche 303 an dem Metallkörper 304 vorgesehen sein, die sofort nach dem Trennen der Kühlfläche 302 von der Kontaktfläche 303 in der Trennebene E-E wirksam wird. Das automatische Schließen der hierzu vorgesehenen Abdeckung 313 kann in ähnlicher Weise, wie das in Zusammenhang mit der Abdeckung 216 bei der Aus­ führungsform gemäß Fig. 4 beschrieben worden ist, mittels eines elektromotorischen Elements 314 über eine elektrische Triggerung gesteuert werden.

Der Durchflußkühler 301 kann entweder ausschließlich mit flüssigem Stickstoff oder flüssigem Helium betrieben werden oder gemäß dem Blockschema in Fig. 7 im Zuge einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sukzessive zunächst mit flüssigem Stickstoff aus einem Dewargefäß 320 vorgekühlt werden und nach der Erreichung einer Temperatur von etwa -190°C auf He_fl-Kühlung aus dem Dewar­ gefäß 321 umgestellt werden. Gleiches gilt für die Ableitung des Kryogens nach dem Durchtritt durch den Durchflußkühler 301, wobei mehrere Magnetventile 322 N, 322 He den Lauf der Kryogene steuern und das eingesetzte flüssige Helium bzw. das daraus entstehende gasförmige Helium beispielsweise in einen Recycling-Kreislauf 323, 324 einbringen. Diese Steuerung kann im Rahmen der dargestellten Zweistufen-Kühlung gemäß Fig. 7 mittels eines Thermofühlers 325 (vgl. Fig. 6) in der unmittelbaren Nähe der Kontakt­ fläche 302 vollautomatisch, beispielsweise über eine Mikro­ prozessor-Anordnung, in einer Weise gesteuert werden, daß die Abkühlzeit und/oder der Kryogenverbrauch minimiert werden. Der sukzessive Betrieb des Durchflußkühlers 301 wird dabei in der Weise gesteuert, daß zunächst die Magnetventile 322 He geschlossen bleiben, während die Magnetventile 322 N offen stehen, so daß der Durchflußkühler 301 von flüssigem Stick­ stoff durchströmt ist. Bei Erreichen der erwähnten Tempera­ tur von etwa -190°C schaltet dann die Mikroprozessor-Anord­ nung die Magnetventile um, so daß nunmehr die Magnetventile 322 N schließen und die Magnetventile 322 He öffnen, um den Heliumdurchfluß in Gang zu setzen. In dem Recycling-Kreislauf 323, 324 wird das den Durchflußkühler 301 verlassende Helium wieder auf den Zustand abgekühlt, der auch in dem Dewargefäß 321 herrscht.

Fig. 8 zeigt eine weitere Ausgestaltung, bei der eine Ausfüh­ rungsform der erfindungsgemäßen Einrichtung Anwendung findet, wie sie in Fig. 3 erläutert ist. Folglich werden in Zusammen­ hang mit Fig. 8 nur noch diejenigen Einrichtungskomponenten beschrieben, durch die die grundsätzliche Einrichtung weiter ausgestaltet ist:

Auf der Grundplatte 101 ist eine sogenannte "feuchte Kammer" montiert, deren Boden- und Wandflächen 401 bzw. 402 eine (bspw. zylindrische) Schachtel bilden, die teilweise durch einen durchsichtigen Deckel 403 verschlossen ist. Der Deckel 403 weist eine kreisrunde Öffnung 403′ auf, die so groß ist, daß einerseits beim eigentlichen Kryofixationsvorgang der Eintritt der Spiegelfläche 111 und des diese umgebenden Man­ tels 109 in das Innere der "feuchten Kammer" möglich ist, andererseits das in der "feuchten Kammer" angeordnete Objekt für die Präparation noch zugänglich ist.

Im Inneren der "feuchten Kammer" ist eine mit Wasser getränkte Filzauflage 404 angeordnet, die durch ihre rauhe und dadurch sehr große feuchte Oberfläche eine starke Verdunstung und damit eine hohe relative Luftfeuchtigkeit im Inneren der "feuchten Kammer" erzeugt. Dadurch wird ein Austrocknen der feuchten Oberfläche des darauf befindlichen Objekts unter­ bunden oder zumindest auf ein nicht störendes Maß eingeschränkt. Unter der Filzauflage 404 ist eine Heizplatte 405 aus Aluminium angeordnet, die einen Heizwiderstand 406 und einen Thermofüh­ ler 407 enthält und durch diese thermostatisch auf eine vor­ gewählte Temperatur eingesteuert werden kann. Hierdurch wird eine störende Hypothermie der noch lebenden Zellverbände des Objekts während der Präparationsarbeiten verhindert.

Zur Erleichterung der Präparationsarbeit ist an der Grundplatte 101 ein Stativ 408 b eines Stereomikroskops 408 befestigt, das durch eine Schwenkachse 408 a seitlich verschwenkbar ist. Durch einen nicht näher bezeichneten Drehknopf kann das Ste­ reomikroskop 408 in Richtung des geraden Doppelpfeiles ver­ stellt werden. Weiterhin ist der "feuchten Kammer" eine Be­ leuchtung zugeordnet, die durch eine leistungsstarke Glüh­ birne 409, einen zugehörigen Reflektor 410, einen Kollektor 411, einen Faserlichtleiter 412 und eine Austrittspupille mit Sammellinse 413 gebildet ist. Die Beleuchtungskomponenten 409, 410 und 411 sind in einem Gehäuse aufgenommen, das am oberen Ende der Säulen 102 befestigt ist. Sowohl das Stereo­ mikroskop 408 als auch der Faserlichtleiter 412 können auf einfache Weise aus dem Arbeitsfeld in der näheren Objektum­ gebung bei Bedarf durch seitliches Wegschwenken entfernt wer­ den.

In Fig. 8 ist weiterhin angedeutet, daß zur Durchführung elek­ trophysiologischer Experimente an der Kammerwand 402 der "feuchten Kammer" zwei Elektroanschlüsse 420 angeordnet sind, von denen aus Leitungen 421 zu Elektroden 422 am Objekt führen. Die Elektroden 422 werden unter mikroskopischer Kontrolle am Objekt angebracht und dienen bspw. zur elektrischen Rei­ zung von Muskeln oder Nerven in dem Objekt. Um zu erreichen, daß diese Reizung beim Kryofixations-Vorgang eintritt und der Reizzustand auch festgehalten wird, können die Elektro­ den 422 über eine nicht gezeigte Schaltung kurz vor dem Auf­ treffen der Spiegelfläche 111 auf dem Objekt erregt werden. Hierzu dient eine steuerungsmäßige Koppelung mit der Abwärts­ bewegung des Tragarmes 104, die durch eine höhenmäßig in Rich­ tung des Doppelpfeiles justierbare Reflexionslichtschranke 424 und eine von dieser abzutastende Markierung 425 an dem Tragarm 104 gebildet ist. Die Reflexionslichtschranke 424 stellt beim Absenken des Tragarmes 104 und beim Durchlaufen der Markierung 425 eine Änderung der Lichtreflexion fest, die als Signal an die erwähnte, nicht dargestellte Schaltung zur Erregung der Elektroden 422 gegeben wird, so daß diese dadurch erregt werden und die Nerven bzw. Muskeln des Objekts stimulieren. Die Stimulation erfolgt dabei in einem mittels der Reflexionslichtschranke 424 wählbaren zeitlichen Abstand im Millisekunden-Bereich vor dem Kontakt zwischen der Spie­ gelfläche 111 und dem Objekt. Da die anschließende Kryofixation ebenfalls in einem Zeitintervall im Millisekunden-Bereich abläuft, kann man die Stimulation im Objekt "einfrieren" und dadurch wertvolle Rückschlüsse im Rahmen physiologischer bzw. biochemischer Studien ziehen.

Fig. 8 zeigt weiterhin die Zuordnung eines mit flüssigem Stick­ stoff 426 gefüllten Dewargefäßes 427 zu der Einrichtung, aus dem über ein Tauchrohr 428, ein Magnetventil 429 und ein Zu­ leitungsrohr 430, das unmittelbar in das Innere der "feuch­ ten Kammer" mündet, im geöffneten Zustand des Magnetventils 429 flüssiger Stickstoff in das Innere der "feuchten Kammer" eingeleitet werden kann. Die Förderung des flüssigen Stick­ stoffes erfolgt durch den im Inneren des Dewargefäßes 427 aufgrund des laufend absiedenden Stickstoffes herrschenden Druck, der durch ein Überdruckventil 431 einstellbar ist. An der Innenwand 402 der "feuchten Kammer" ist ein Niveau­ sensor 432 angebracht, der auf die Standhöhe des flüssigen Stickstoffes im Inneren der "feuchten Kammer" anspricht. Es versteht sich, daß der Boden 401 und die Wände 402 der "feuch­ ten Kammer" aus einem Material bestehen, das gegenüber flüs­ sigem Stickstoff beständig ist und die Kammer im übrigen ge­ genüber einem Austreten des flüssigen Stickstoffes dicht ist.

Sind die Präparationsarbeiten an dem Objekt in der "feuchten Kammer" beendet und steht die Spiegelfläche 111 nach dem Ab­ senken des Trägerarmes 104 in Kontakt mit dem Objekt, so kann unmittelbar nach der Herstellung dieses Kontakts die "feuchte Kammer" mit flüssigem Stickstoff gefüllt werden. Die Stick­ stoffüllung bewirkt nicht nur eine wesentliche Beschleuni­ gung des Einfrierprozesses des Objekts, sondern verhindert auch eine sekundäre Aufwärmung des die Spiegelfläche 111 bil­ denden Körpers sowie der Randzone des Objekts durch einen Einstrom von Wärme aus der Umgebung in die Kontaktzone zwi­ schen der Spiegelfläche 111 und der Oberfläche des Objekts. Besonders bedeutsam ist dies bei Anwendung von Spiegelsyste­ men mit geringer Wärmekapazität, wie dies z.B. für die An­ ordnung gemäß Fig. 4 gilt. Das Füllen der "feuchten Kammer" mit dem flüssigen Stickstoff wird wiederum durch eine nicht gezeigte Schaltung gesteuert, die von der Betätigung des Aus­ löserbolzens 107 abhängig sein kann und zweckmäßigerweise ei­ ne Verzögerungsschaltung enthält, die das Ausfließen von flüs­ sigem Stickstoff aus dem Zuleitungsrohr 430 vor dem Kontakt zwischen Spiegelfläche 111 und Objekt verhindert. Die Schal­ tung steuert das Magnetventil 429, d.h. öffnet dieses nach Ablauf der Verzögerungszeit, so daß aufgrund des im Dewargefäß 427 herrschenden Druckes flüssiger Stickstoff gefördert wird. Auf die erwähnte Schaltung wirkt auch der Niveausensor 432, dessen Signal das Magnetventil 429 wieder schließt, sobald die Standhöhe an flüssigem Stickstoff im Inneren der "feuch­ ten Kammer" der Position des Niveausensors 432 entspricht. Der Niveausensor kann bspw. eine thermosensible Diode sein.

Die erwähnten, nicht dargestellten Schaltungen, die die Erre­ gung der Elektroden 422 bzw. die Zufuhr von flüssigem Stick­ stoff aus dem Dewargefäß 427 steuern, sind für den Steuerungs­ techniker ihrer Art nach bekannt und bedürfen an dieser Stelle keiner besonderen Erläuterung. Es versteht sich, daß diese Schaltungen und die zugehörigen Komponenten, z.B. die Reflexions­ lichtschranke 424, im Bereich der Einrichtung und z.B. unmit­ telbar an dieser, d.h. an der Grundplatte 101 mittels nicht dargestellter Konsolen, angeordnet bzw. befestigt sind, um die funktionsgerechte Zuordnung zu bewirken. Diese Zuordnung ist in Fig. 8 nur schematisch wiedergegeben.

Im Rahmen der Erfindung können gegenüber den vorstehend be­ schriebenen Ausführungsbeispielen gemäß den Fig. 3 bis 8 Ab­ änderungen getroffen werden, ohne daß hierdurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird. So können anstelle der konkret gezeigten Abdeckung der Spiegelfläche und deren Betätigung andere Einrichtungen vorgesehen werden, die ein schlagarti­ ges Entfernen der Abdeckung unmittelbar vor dem Kontakt der Spiegelfläche mit dem Objekt bewirken. Bspw. kann die Abdek­ kung auch durch eine Klapp- oder Schwenkbewegung um eine ho­ rizontal verlaufende Achse (anstelle - wie geschildert - der Schwenkbewegung um eine Vertikalachse) von der Spiegelfläche entfernt werden. Anstelle der durchgehenden Ausbildung der Abdeckung aus einem thermo-isolierenden Material kann die Ab­ deckung auch eine Sandwich-Isolation nach Art einer Isolier­ verglasung mit einer zwischengeschalteten Gasschicht oder ei­ nem evakuierten schichtartigen Raum beinhalten. Schließlich kann die Abdeckung anstelle der gezeigten mechanischen bzw. elektromotorischen Betätigung durch eine Lichtschranke auch durch andere Trigger-Einrichtung betätigt werden, die auf die Annäherung der Spiegelfläche an das Objekt in irgendeiner Form ansprechen und ein Signal zur Entfernung der Abdeckung von der Spiegelfläche geben können.

Claims (18)

1. Einrichtung zur Kryofixation biologisch-medizinischer oder ähnlicher Objekte, mit einem in der Raumatmosphäre gegen ein ruhendes Objekt bewegten tiefgekühlten Festkörperspie­ gel, insbesondere Metallspiegel, dadurch gekennzeichnet, daß die Spiegelfläche (111, 211′) des Festkörperspiegels (110; 210, 211) zur Vermeidung von Niederschlägen aus der Raum­ atmosphäre auf der Spiegelfläche und von Wärmeverlusten durch eine Abdeckung (117, 216) bedeckt ist, die auf ihrer Bewegungsbahn zum ruhenden Objekt (126, 239) hin erst kurz vor dem Kontakt der Spiegelfläche mit dem Objekt automa­ tisch gesteuert von der Spiegelfläche entfernbar ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abdeckung durch Ausnutzung der Bewegungsenergie des Festkörperspiegels beim Auftreffen auf ein feststehendes Element von der Spiegelfläche entfernbar ist.

3. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die als Scheibe ausgebildete Abdeckung (117, 216) mit einer Drehwelle (114) drehfest verbunden ist und daß die Dreh­ welle von einem Betätigungselement (113, 217) im Sinne ei­ ner Schwenkbewegung der Abdeckung beaufschlagt ist.

4. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Drehwelle (114) senkrecht zur Scheibenebene der Ab­ deckung (117) steht, daß das Betätigungselement eine vor­ gespannte Drehfeder (113) ist, wobei die Abdeckung in der Abdecklage lösbar fixiert ist, und daß die Abdeckung durch eine mechanisch betätigbare Auslöseanordnung (120, 121, 128) auslösbar ist.

5. Einrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Auslöseanordnung einen in eine Ausnehmung (118) der Abdeckung eingreifenden Auslösestift (120) aufweist, der durch Anschlag an einem Anschlagstift (128) im Bereich des Objekts (126) aus der Ausnehmung (118) aushebbar ist.

6. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Drehwelle senkrecht zur Scheibenebene der Abdeckung (216) steht und daß das Betätigungselement ein elektri­ sches Drehspulelement (217) ist, das durch eine elektro­ nische Schrankenschaltung (235, 236) gesteuert betätigbar ist.

7. Einrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Anschlagstift (128) bzw. die Schrankenschaltung (235, 236) in ihrer Höhenlage relativ zum Objekt (126, 239) justierbar ist.

8. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Abdeckung mit einer Drehwelle verbunden ist, die durch eine Kurve betätigbar ist, und daß im Bereich des Objekts ein Anschlag angeordnet ist, durch den die Kurve der Dreh­ welle mechanisch im Sinne einer Verschwenkung der Abdec­ kung betätigbar ist.

9. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Spiegelfläche (111) durch die Unterseite eines thermisch isolierten, mit einem flüs­ sigen Kryogen gefüllten topfförmigen Metallblockes (110) gebildet ist.

10. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Spiegelfläche (211′) durch die Unterseite eines Metallkörpers (210, 304) gebildet ist, der durch Kontakt mit einem über dem Metallkörper (210, 304) höhenverstellbar angeordneten Kühlelement (220, 301) auf die erforderliche Temperatur abkühlbar ist.

11. Einrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Kühlelement ein mit einem Kryogen gefüllter topf­ förmiger Metallblock (220) oder ein von Kryogen durch­ strömter Durchflußkühler (301) ist, und daß die Unter­ fläche des Metallblockes (220) bzw. des Durchflußkühlers (301) als Kontaktfläche zum Kontakt mit der Oberfläche (215 bzw. 304) des Metallkörpers ausgebildet ist.

12. Einrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Unterfläche des Kühlelements (220, 301) und der Kontaktfläche (215, 303) des Metallkörpers je ein Abdeck­ element (310 bzw. 313) zugeordnet ist, das automatisch nach der Trennung des Metallkörpers von dem Kühlelement bei der Abwärtsbewegung über die Unterfläche bzw. die Kontaktfläche verstellbar ist.

13. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Festkörperspiegel an einem Trä­ gerarm (104) bzw. einem Montageelement (205) gehalten ist und auf einer geradlinigen bzw. gekrümmten Bewegungs­ bahn zum Objekt hin verschiebbar bzw. verschwenkbar ist.

14. Einrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verhinderung eines Rückpralls des Festkörperspie­ gels nach dem ersten Kontakt mit dem Objekt eine magne­ tisch und/oder mechanisch den Trägerarm (104) bzw. das Montageelement (205) fixierende Haltevorrichtung (134, 130; 231) vorgesehen ist.

15. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Temperaturregeleinrichtung (137, 138, 212, 213) vorgesehen ist, die eine Abkühlung der Spie­ gelfläche (111, 211′) unter die Siedetemperatur von Sauer­ stoff verhindert.

16. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Objekt in einer Kammer (401, 402) angeordnet ist, deren Innenraum durch ein Verdampferele­ ment (404) und durch eine Heizeinrichtung (405) einen hohen Wasserdampfgehalt und eine Temperatur aufweist, die einer natürlichen Objekttemperatur entspricht, daß die Kammer durch einen eine Öffnung (403′) aufweisenden Deckel (403) bedeckt ist und daß die Flächenausdehnung des Kammerinneren die Fläche der Öffnung (403′) erheblich übertrifft.

17. Einrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kammer (401, 402) unmittelbar nach dem Kontakt des Objekts mit der Spiegelfläche gesteuert mit flüssigem Stickstoff auffüllbar ist.

18. Einrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeich­ net, daß an der Kammer (401, 402) Elektroanschlüsse (420) mit an dem Objekt anzusetzenden Elektroden (422) vorge­ sehen sind, und daß die Elektroden in Abhängigkeit von der Position des Festkörperspiegels bei dessen Abwärts­ bewegung durch eine Schrankenschaltung (424, 425) erreg­ bar sind.