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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Vorbereitung von Proben
für ein
Kryo-Elektronenmikroskop, mit einer Klimakammer, einem Halter für eine Probe
oder einem Träger
und mindestens einem Blotting-Element, an welchem ein Medium zum
Absorbieren von Flüssigkeit
angebracht ist oder angebracht werden kann, wobei sowohl der Halter
als auch das oder die Blotting-Element(e)
in der Klimakammer angeordnet sind, sowie einem Kühlmedium, vorzugsweise
ein Behälter
für ein
Fluid, zum Abkühlen
der Probe.
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Neben
dem Rasterelektronenmikroskop (SEM), in welchem ein abtastender
Elektronenstrahl hauptsächlich
zur Untersuchung von Oberflächen verwendet
wird, werden verschiedene Typen von Transmissionselektronenmikroskopen
(TEM) verwendet. Mit manchen dieser Mikroskope werden Proben, zum
Beispiel ein Biopt oder eine Zellsuspension, durch Fixieren und
Dehydrieren vorbereitet. Nach Einbetten einer Probe in ein Harz
kann ein ultradünner
Schnitt (zum Beispiel 50nm) geschnitten werden, der anschließend angefärbt wird
und einem Elektronenstrahl ausgesetzt wird.
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In
der Kryo-Elektronenmikroskopie ist allgemein bevorzugt, ein sogenanntes "Grid" (Trägernetzchen)
zu verwenden. Beispielsweise wird ein Grid, das sechseckige Öffnungen
eines Durchmessers von einigen Dutzend Mikrometer aufweist, in eine
Suspension von zu untersuchenden Partikeln, beispielsweise Proteinmoleküle oder
Zellen, getaucht. Anschließend
wird durch "Blotten" (Abtupfen), d.h. durch
Pressen von Blotting-Papier (Fließpapier) oder eines anderen
Mediums, das leicht Wasser absorbiert, gegen eine Seite oder beide
Seiten des Grids, überschüssige Suspension
entfernt. Als Folge des Blottens ist die Dicke der Schicht, die
in den Öffnungen
des Grids vorhanden ist, zum Beispiel von 3–4 μm auf 100 nm verringert. In
einer Schicht einer solchen minimalen Dicke, entwickelt sich in
dem Zentrum der Schicht unter dem Einfluß von London/van der Waals-Anziehung der Luft/Fluid-Grenzschichten ein
Bereich, der sogar dünner
ist, wobei sich der Bereich langsam in Auswärtsrichtung erweitert, das heißt, in Richtung
der Kante der jeweiligen Öffnung
in dem Grid. Während
dieses Vorgangs, der auch als Draining (Drainage) bezeichnet wird,
werden die suspendierten Partikel zwischen den Fluidoberflächen eingeschlossen.
Als nächster
Schritt wird die Probe sehr schnell abgekühlt, so daß das Fluid vitrifiziert bzw.
verglast wird. Die so vorbereitete Probe kann in einem Kryo-Elektronenmikroskop
bei einer tiefen Temperatur (zum Beispiel minus 170°C) untersucht werden
und kann photographiert werden, ohne daß zusätzliche Arbeitsschritte erforderlich
sind.
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Eine
Vorrichtung zur Vorbereitung von Proben für ein Kryo-Elektronenmikroskop ist bekannt, zum
Beispiel aus S. Trachtenberg "A
Fast-Freezing Device with a Retractable Environmental Chamber, Suitable
for Kinetic Cryo-Electron Microscopy Studies", Journal of Structural Biology 123,
45-55 (1998). Diese Veröffentlichung
beschreibt eine Vorrichtung, die eine Klimakammer mit transparenten Polycarbonatwänden aufweist.
Unterhalb der Kammer ist ein Bad aus flüssigem Ethan angeordnet. Die Temperatur
und die (hohe) Luftfeuchtigkeit in der Kammer werden mit Hilfe von
Heizelementen und eines Ultraschall-Luftbefeuchters gesteuert. Nachdem ein
Grid mit einer Probe versehen worden ist, wird entweder manuell
oder automatisch mittels einer unabhängigen Einheit ein Blotten
bzw. Abtupfen durchgeführt.
Dann wird ein in dem Boden der Kammer vorhandenes Ventil geöffnet und
das Grid fällt
mit hoher Geschwindigkeit in das Ethan, so daß die Probe sehr schnell abkühlt, d.h.
verglast bzw. vitrifiziert wird. Anschließend wird die Kammer aufwärts bewegt,
und die Probe ist fertig.
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Eine ähnliche
Vorrichtung ist aus der Dissertation von J. Bednar, "Cryo-Electron Microscopy
of DNA and Chromatin",
Lausanne 1995 bekannt. Diese Dissertation beschreibt (insbesondere
in Kapitel 7 in Verbindung mit 7.1)
einen "Kolben...(,
der) aus einem Gestell, einer feuchten Kammer, einem Pinzetten halter
und einem Blotting- Polster als Hauptteile besteht". Das Blotting- bzw.
Abtupf-Polster ist über einen
Photoverschluß-Fernauslösungsdraht
mit einem Antriebsmagneten verbunden.
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Solche
Anordnungen und ein solches Verfahren passen zur Wahrnehmung, daß die Probe
bis zum Zeitpunkt des Einfrierens empfindlich in bezug auf Änderungen
der Temperatur- und Luftfeuchtigkeitspegel ist. Es hat sich jedoch
deutlich gezeigt, daß die
derzeit vorhandene Ausstattung nicht genügend fähig ist, eine große Anzahl
von Proben auf eine reproduzierbare Weise vorzubereiten.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine verbesserte Vorrichtung
des in dem ersten Paragraphen beschriebenen Typs bereitzustellen,
mit Hilfe derer Proben auf eine leichter reproduzierbare Weise vorbereitet
werden können.
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Um
diese Aufgabe zu erfüllen,
ist die Vorrichtung gemäß der Erfindung
nach Anspruch 1 gekennzeichnet.
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Es
hat sich herausgestellt, daß die
Reproduzierbarkeit des Probenvorbereitungsprozesses viel stärker von
dem Blotten bzw. Abtupfen abhängt
als bislang angenommen worden ist. Überdies kann die Vorbereitung
von Proben auf eine (relativ) einfache und weitgehend automatisierte
Weise erfolgen, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet wird.
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Demgemäß ist bevorzugt,
daß das
oder die Abtupf- bzw. Blotting-Element(e) funktionell mit einer Ansteuerungseinrichtung,
wie zum Beispiel einem Personal Computer (PC), verbunden sind, die
eingerichtet ist, die Bewegungen des oder der Blotting-Elemente zu steuern,
um die Probe oder den Träger
ein oder mehrere Male bei einem vorgegebenen Druck zu blotten, und
vorzugsweise auch die Geschwindigkeit mindestens einiger der Bewegungen
des oder der Blotting-Elemente zu steuern.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Vorbereitung einer Probe
mit Hilfe der hier beschriebenen Vorrichtung, in welchem die Probe
oder der Träger
gleichzeitig von beiden Seiten der Probe oder des Trägers aus
abgetupft bzw. geblottet wird. Somit sind die von den Blotting-Elementen
auf die Probe oder auf den Träger
ausgeübten
Kräfte
besser ausbalanciert und folglich besser steuerbar.
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Im
Rahmen der Erfindung weist der Begriff "Träger" eine beliebige Vorrichtung
auf, die zum Halten einer Probe geeignet ist. Beispiele für solche
Vorrichtungen sind relativ einfache Metallstifte, an welchen eine
Probe oder eine Suspension, die eine Probe enthält, haftet, Quantifoils-Folien
und die oben erwähnten
Grids. Grids können
mit verschiedenartig gestalteten Löchern, z.B. sechseckigen, runden, quadratischen
oder dergleichen, bereitgestellt sein und/oder können an einer oder an beiden
Seiten mit einer mit solchen Löchern
versehenen Trägerschicht bereitgestellt
sein.
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Der
Ausdruck "auf gesteuerte
Weise" bedeutet,
daß vor
und/oder während
des Blottens mindestens einige der Blotting-Parameter, zumindest der von den Blotting-Elementen
ausgeübte
Druck, eingestellt und/oder geregelt werden können.
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Die
Erfindung wird nun detaillierter mit Bezug auf die beiliegenden
Figuren erklärt,
die schematisch eine beispielhafte Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigen.
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1 und 2 sind
eine Ansicht von vorn bzw. von der Seite auf eine Vorrichtung zur
Vorbereitung von Proben für
ein Kryo-Elektronenmikroskop.
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3 ist
eine Perspektivansicht eines Teils des Inneren der Klimakammer der
Vorrichtung gemäß 1 und 2.
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4 ist
eine hintere Perspektivansicht des Blotting-Mechanismus in 3.
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1 und 2 zeigen
eine Vorrichtung 1 zur Vorbereitung von Proben für ein Kryo-Elektronenmikroskop,
mit einer Klimakammer 2, einem vorderen Raum 3,
in welchem die Aktuatoren für
Komponenten in der Klimakammer 2, die noch zu diskutieren
sind, untergebracht sind, und einem hinteren Raum 4, in welchem
eine elektronische und/oder pneumatische Steuereinheit für die oben
genannten Aktuatoren oder Einrichtungen zur Kommunikation mit einer
externen Steuerung vorhanden sein können.
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Unterhalb
der Klimakammer 2 ist ein Behälter 5 angeordnet,
der an sich bekannt ist und einen zentralen Hohlraum zur Aufnahme
eines Kühlmediums
aufweist, mit welchem eine Probe verglast bzw. vitrifiziert werden
kann, zum Beispiel flüssiges
Ethan. Der Behälter 5 kann
außerdem
zum Beispiel einen den zent ralen Hohlraum umgebenden ringförmigen Kanal
aufweisen, in welchen ein zweites Kühlmedium, beispielsweise flüssiger Stickstoff,
hineingegeben werden kann. Dieses Medium kann zum Kühlen des
Ethans und/oder zum zwischenzeitlichen Aufbewahren der fertig vorbereiteten
Proben verwendet werden. Der Behälter 5 kann
mit Hilfe eines Tisches 6 und eines dazugehörigen Aktuators
(nicht gezeigt) aufwärts
und abwärts
bewegt werden. Das Innere der Klimakammer 2 ist über eine
Tür 8 zugänglich,
die mit einem Fenster ausgestattet ist.
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Das
Innere der Klimakammer 2 ist in 3 und 4 gezeigt,
da die Seitenwände
und die Tür 8 in
diesen Figuren weggelassen worden sind. Die Klimakammer 2 weist
zwei parallele Rohre 9 auf, die dazu dienen, einen Teil
der anderen Komponenten in der Klimakammer 2 zu halten.
Mit den Rohren 9 ist ein Querbalken 10 und ein
Hilfsrahmen 10A verbunden, die ihrerseits zwei drehbare
Arme 11, 11' halten. Kreisförmige Abtupf-
bzw. Blotting-Elemente 12, 12' sind drehbar
und schräg
an den Enden der Arme 11, 11' angebracht. Jedes der Blotting-Elemente 12, 12' weist ein Polster
oder Kissen 13, 13' auf,
an welchem ein Blotting-Papier
bzw. Löschpapier
oder ein anderes flüssigkeitsabsorbierendes
Medium angebracht werden kann. Jedes der Blotting-Elemente 12, 12' ist zentral
mit einer Öffnung
versehen, und zum Zwecke, die Position des Blotting-Papiers zu stabilisieren, können zusätzlich die
Kissen 13, 13' mit
sich radial erstreckenden (von dem Blotting-Papier bedeckten) Kanälen versehen
sein. Die Öffnung
ist über
die Arme 11, 11' und
die Rohre 9 mit einem Vakuumkanal verbunden, der mit einer
Vakuumpumpe (nicht gezeigt) in dem hinteren Raum 4 der
Vorrichtung 1 verbunden ist.
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Die
vorderen Abschnitte der Arme 11, 11' und somit die Blotting-Elemente 12, 12' können gegen
die Wirkung einer einstellbaren Feder 11A voneinander weg
bewegt werden, die zwischen den hinteren Abschnitten der Arme 11, 11' angeordnet
ist und diese hinteren Abschnitte voneinander weg zwingt. Die Bewegung
wird von einem an dem (rechten) hinteren Abschnitt des (rechten)
Arms 11' anliegenden
Aktuator bewirkt, z.B. einem pneumatischen Aktuator 11B,
der an sich bekannt ist und der mit einem in 3 gezeigten
Pneumatikrohr 14 verbunden ist. Die Feder 11A kann
mit Hilfe einer Einstellschraube 11C in dem (linken) hinteren
Abschnitt des (linken) Arms 11 eingestellt werden. Ferner
werden mittels eines zweiarmigen Hebels 11D, der drehbar mit
dem Querbalken 10 und mit den beiden Armen 11, 11' verbunden ist,
alle Bewegungen des rechten Arms 11' sofort und symmetrisch auf den
linken Arm 11 übertragen.
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Dadurch,
daß man
Luft über
ein einstellbares Luftloch (ex Festo) aus dem Aktuator 11B entweichen
läßt, können die
Blotting-Elemente 12, 12' auf eine gesteuerte Weise unter
der Wirkung der Feder wieder zusammen bewegt werden. Der Druck,
bei welchem das Abtupfen bzw. Blotten erfolgt, kann mit Hilfe der
Feder eingestellt werden, während
die Geschwindigkeit der Blotting-Elemente mit Hilfe sowohl der Feder
als auch des Luftlochs eingestellt werden kann.
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In
dem vorderen Teil der Klimakammer 2 ist ein sich parallel
zu den Rohren 9 erstreckendes Rohr 15 vorhanden,
das z.B. mit Hilfe eines pneumatischen Aktuators mit einer großen Geschwindigkeit nach
unten geschossen werden kann und das anschließend mit Hilfe eines Schrittmotors
(relativ langsam) wieder nach oben bewegt werden kann. An dem Ende
dieses Rohrs 15 ist ein (indirekter) Halter für ein Grid
angebracht, der in dieser Ausführungsform
aus einer Klemmvorrichtung 15' für eine Pinzette 16 besteht.
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Ferner
ist ein dreieckiges Element 17 mit den Rohren 9 verbunden,
das an seiner Spitze eine ringförmige
Führung 18 zum
Führen
der Pinzette 16, der Klemmvorrichtung 15' und des Rohrs 15 aufweist.
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Neben
und unterhalb der Pinzette 16 ist ein Halter für ein Gefäß oder eine
Phiole 20 für
eine Suspension von zu untersuchenden Partikeln angeordnet. Ferner
ist unterhalb der Klimakammer 2 ein Reservoir (ohne seine
Außenwände gezeigt)
angeordnet, in welchem ein Ultraschall-Luftbefeuchter 21 vorhanden
ist, der sich durch die Bodenplatte der Klimakammer 2 erstreckt.
An der oberen Seite des Reservoirs ist ein Deckel 22 vorhanden,
der (übermäßig) große Tropfen
aus dem Luftbefeuchter 21 auffängt. Die Klimakammer 2 enthält ferner
Heiz- und/oder Kühlelemente
(nicht gezeigt), wie jeweils beispielsweise Wider standsheizelemente
und/oder Peltier-Elemente, mittels welchen die Temperatur gesteuert
werden kann.
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Die
gesamte Vorbereitung einer Probe für ein Kryo-Elektronenmikroskop kann auf eine automatisierte
Weise, zum Beispiel unter PC-Steuerung, erfolgen. Nach dem Anordnen
der Phiole 20, in welcher eine Suspension von zu untersuchenden
und auf eine bekannte Weise vorbereiteten Partikeln vorhanden ist,
und einer Ruhezeit von zum Beispiel 20–30 Minuten, während derer
sich die Phiole 20 und die Suspension akklimatisieren können, wird
die Pinzette 16, in der Unterseite der Backen derer ein
Grid (ex Stork Veco; nicht gezeigt) eingespannt ist, nach unten
bewegt und in die oben genannte Suspension eingetaucht. Anstatt
eines Eintauchens ist es auch möglich,
z.B. mit Hilfe einer Pipette oder einer Sprühvorrichtung eine kleine Menge
Suspension auf eine Seite aufzubringen. Zu diesem Zweck kann eine
Seitenwand der Klimakammer 2 mit einer Luftschleuse 25 (1)
versehen sein.
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Nachdem
die Suspension aufgebracht worden ist, wird die Pinzette 16 aufwärts in eine
Position bewegt, in welcher die Blotting-Elemente 12, 12' gegen das Ende
der Pinzette 16 und somit gegen das Grid gepreßt werden
können.
Abhängig
von den Bedingungen, wie beispielsweise den Eigenschaften des speziellen
Grids, der Viskosität
der verwendeten Suspension und der Temperatur, kann der Blottingvorgang
ein oder mehrere Male wiederholt werden, während es außerdem möglich ist, den Druck anzupassen,
bei welchem das Blotten erfolgt. Zusätzlich ist es möglich, auf
diese Weise die Dicke der Schicht in den Gridöffnungen einzustellen.
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Jedes
der Blotting-Elemente 12, 12' hat an seiner Rückseite
eine kreisförmige
aufrechte Kante 23, die mit dem Rest des Blotting-Elements 12 konzentrisch
ist und die mit Zähnen,
zum Beispiel sechzehn Zähnen,
versehen ist. Die oben genannten Arme 11, 11' weisen jeweils
einen plattenförmigen Körper 24 auf,
an dessen Ende ein elastischer Nocken vorhanden ist, der bei einer
Zurückbewegung des
jeweiligen Arms 11 gegen einen der oben genannten Zähne drückt, infolgedessen
das Blotting-Element 12 um 1/16tel einer Umdrehung bewegt wird.
Der Momentarm 11 bewegt sich wieder einwärts, der
Nocken fällt
hinter den nächsten Zahn,
so daß sichergestellt
ist, daß jedes
Mal, wenn ein Blotten erfolgt, das Blotting-Element 13 eine
vorgegebene Strecke gedreht wird und somit mit einem unbenutzten
Stück Blotting-Papier in der Nähe des Grids bereitgestellt
wird. Nachdem das Blotten in einem ausreichenden Maß durchgeführt worden
ist, kann sich eine Wartezeit anschließen, um den oben beschriebenen
Drainageprozeß in
dem Grid vonstatten gehen zu lassen.
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Im
Prinzip ist die Probe nun fertig und kann in das Ethan unterhalb
der Klimakammer 2 fallen gelassen werden oder hinein geschossen
werden, oder alternativ auf einen gekühlten massiven Gegenstand, beispielsweise
auf einen Kupferblock, der in einem flüssigen Kühlmittel, beispielsweise in
flüssigem Stickstoff
oder Helium angeordnet ist (sogenanntes "Slam"gefrieren).
Zu diesem Zweck wird der Behälter 5 aufwärts in eine
Position nahe an der Bodenplatte der Klimakammer 2 bewegt.
Dann wird der Halter 19 für die Phiole 20, der
auch als ein Ventil dient, mit Hilfe z.B. eines pneumatischen Aktuators,
von welchem in 3 nur ein Pneumatikrohr 14' gezeigt ist,
beiseite geschwungen, so daß eine
darunter angeordnete Öffnung
freigelegt wird, und die Pinzette 16 mit dem Rohr 15 werden
nach unten geschossen. Die auf dem Grid vorhandene Probe wird fast
sofort vitrifiziert, wonach sie zu dem oben erwähnten ringförmigen Kanal in dem Behälter 5 bewegt
werden kann oder auf eine andere Weise aufbewahrt werden kann. Dann
wird ein anderes, vorzugsweise steriles Grid in der Pinzette 16 angeordnet
und wird die Pinzette 16 mit Hilfe eines Schrittmotors
nach oben bewegt, woraufhin die nächste Probe hergestellt werden
kann.
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Die
Erfindung und die oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen
erlauben die Vorbereitung einer großen Anzahl von Proben für ein Kryo-Elektronenmikroskop
auf eine reproduzierbare Weise und innerhalb einer (relativ) kurzen
Zeit. Da die Hauptparameter für
das Blotten, wie beispielsweise Druck, Geschwindigkeit, Dauer, Blotting-Medium und/oder
die Anzahl der Blotting-Zyklen, steuerbar sind und das Blotten zu
keiner Störung
des Klimas in der Klimakammer 2 führt, ist die Belastung für die Probe,
die während
des Blottens und der anschließenden
Drainage in ihrem verwundbarsten Zustand ist, minimiert. Ferner können die
Parameter für
eine spezielle Probe (einen speziellen Typ von Probe) jeweils einzeln
optimiert werden.
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Die
Verwendung eines Luftfeuchtigkeitspegels von mehr als 97%, vorzugsweise
von 100%, verstärkt
diesen Effekt weiter. Obwohl derzeit vorhandene Vorrichtungen zur
Vorbereitung von Proben hohe Luftfeuchtigkeitspegel verwenden, hat
es sich deutlich gezeigt, daß es
möglich
ist, durch Verwenden von Sensoren, die einen Luftfeuchtigkeitspegel
von 97% oder höher
detektieren können,
und/oder durch Überprüfen der
Wände der
Klimakammer auf das Vorhandensein von Nebel und/oder Kondensation
einen Luftfeuchtigkeitspegel von 100% einzustellen, ohne daß große Tropfen
gebildet werden, die den Probenvorbereitungsprozeß beeinträchtigen
könnten.
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Beispiele
für die
oben erwähnten
Aktuatoren zur Betätigung
der Komponenten in der Klimakammer sind unter anderem pneumatische
Aktuatoren, Schrittmotoren und lineare Motoren.
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Die
Erfindung ist selbstverständlich
nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, die
auf verschiedene Weise variiert werden können, ohne von dem Bereich
der Erfindung abzuweichen, wie er in den Ansprüchen definiert ist. Beispielsweise
kann die Klimakammer anstatt mit Luft oder zusätzlich dazu mit anderen Gasen
gefüllt
sein. Wenn außerdem
ein anderes Medium als Wasser verwendet wird, um die zu untersuchenden
Partikel zu suspendieren, wird das Gas in der Klimakammer vorzugsweise
nicht mit Wasser, sondern mit diesem Medium gesättigt sein.