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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Betreiben einer eine Rastersondenmikroskopeinrichtung aufweisenden Meßanordnung sowie eine Meßanordnung mit einer Rastersondenmikroskopeinrichtung.
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Hintergrund der Erfindung
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Die Rastersondenmikroskopie (SPM – „scanning probe microscopy”) ist eine Meß- und Analysetechnik, bei der eine Meßsonde über eine Probe eines zu untersuchenden Meßmediums gerastert wird und bei der über eine abstandsabhängige Wechselwirkung zwischen der Meßsonde und der Probe eine ”Topographie der Probe ermittelt wird. Es können aber auch Materialkonstanten oder andere Probeninformationen gewonnen werden. Die prominentesten Vertreter dieser Technik sind das Rasterkraftmikroskop (AFM – „atomic force microscope”) und das Rastertunnelmikroskop (STM – „scanning tunneling microscope”). Weitere Vertreter dieser Technologie sind insbesondere das Rasternahfeldmikroskop (SNOM – „scanning near field microscope”) und das Rasterphotonenmikroskop (SPhM – „scanning photone force microscope”).
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Zum Messen der abstandsabhängigen Wechselwirkung zwischen Meßsonde und Probe wird bei der Abstandsspektroskopie die Meßsonde relativ zur Oberfläche der Probe verlagert, beispielsweise in einer zur Probenoberfläche vertikalen Richtung, und die Wechselwirkung zwischen Meßsonde und Probe wird gemessen. Alternativ kann auch die Probe bewegt werden. Es kann auch eine Relativbewegung zwischen Meßsonde und Probe vorgesehen sein, bei der sowohl die Meßsonde als auch die Probe bewegt werden. Bei der Rastersondenmikroskopie wird diese Abstandsspektroskopie zum Messen der Wechselwirkung zwischen Meßsonde; und Probe beispielsweise dazu genutzt, Kräfte zwischen Molekülen zu messen, indem ein Molekül an die Meßsonde bindet und ein weiteres Molekül an die Probe.
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Es kann dann die Wechselwirkung zwischen den beiden gebundenen Molekülen gemessen werden. Es können aber auch intramolekulare Kräfte gemessen werden, indem beispielsweise die Meßsonde auf die Probe abgesenkt und hierbei auf eine Bindung gewartet wird. Danach kann die Meßsonde wieder von der Probe entfernt werden, wobei hierbei auf die Meßsonde wirkende Kräfte aufgezeichnet werden. Darüber hinaus sind weitere Messungen möglich, bei denen eine Wechselwirkung gemessen wird, die mit einem zugeordneten Abstand zu zwei oder mehreren Orten korreliert.
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Als Meßsonde wird bei der Rasterkraftmikroskopie üblicherweise ein Bauteil verwendet, welches auch als Cantilever bezeichnet wird. Ohne Einschränkung der Allgemeinheit, wird in den nachfolgenden Erläuterungen auf einen Cantilever Bezug genommen. Die Ausführungen gelten entsprechend für andere Formen von Meßsonden in der Rastersondenmikroskopie.
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Es ist bekannt, für die Abstandsspektroskopie sowohl unbehandelte als auch vorbehandelte Cantilever zu verwenden. Im Fall eines unbehandelten Cantilevers ist eine Bindung der Probe bei der Messung unspezifisch. Beispielsweise geht es hierbei darum, Moleküle mittels Bindung an den Cantilever aus ihrem Umgebungsmedium zu ziehen, um die Wechselwirkung der Moleküle mit dem Umgebungsmedium zu messen. Hierbei können aber auch die Moleküle genauer charakterisiert werden, an denen gezogen wird. So zeigen zum Beispiel DNA-Moleküle eine spezifische Spektroskopiekurve aufgrund einer internen Konformationsumwandlung.
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Mit einem vorbehandelten Cantilever können insbesondere spezifische Bindungen untersucht werden. Ein solche Untersuchung kann vorteilhaft sein, wenn das Ausbilden von ungewünschten Bindungen, die danach unter Umständen kaum noch voneinander getrennt werden können, bei der Messung verhindert werden soll. So ist es gängige Praxis, ein oder mehrere Moleküle an die als Cantilever ausgeführte Meßsonde zu binden, welche dann mit dem oder den gebundenen Molekül(en) ein Rezeptor-Ligand-System bildet. Es ist auch bekannt, ganze Zellen an eine als Cantilever gebildete Meßsonde zu binden und dieses System in Wechselwirkung mit einer Probe, beispielsweise einem Biomaterial, oder mit anderen Zellen zu bringen. Vorbehandlungen von Meßsonden, insbesondere von Cantilevern, sind in verschiedenen Ausführungsformen bekannt, beispielsweise in Form des Hydrophobisierens der Meßsonde.
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Bekannte Möglichkeiten zur Vorbehandlung des Cantilevers führen allgemein zu einer Beschichtung der Meßsonde, zumindest in Teilbereichen. So beschichtet eine an dem Cantilever angebrachte Zelle einen Teilbereich der Oberfläche des Cantilevers. Es kann hierbei vorgesehen sein, den Cantilever im Rahmen der Vorbehandlung zunächst mit einer Beschichtung zu versehen, insbesondere einer haftvermittelnden Beschichtung, auf der dann eine zu messende Substanz aufgebracht wird. Allgemein wird im folgenden das im Rahmen der Vorbehandlung auf die Meßsonde, insbesondere den Cantilever, aufgebrachte Material als Sondensubstanz bezeichnet, sei es ein einzelnes Material oder eine Kombination von mehreren Materialien, die beispielsweise eine haftvermittelnde Basis und eine hierauf angeordnete und zu untersuchende Substanz umfaßt. Eine im Rahmen der Vorbehandlung aufgebrachte und von der Sondensubstanz umfaßte (Basis-)Beschichtung wird auch als Sondenbeschichtung bezeichnet.
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Wird ein vorbehandelter Cantilever bei der Abstandsspektroskopie verwendet, so ergeben sich in der Praxis mehrere Handhabungsprobleme. Durch jeden mechanischen Kontakt mit der Probe wird die auf der Meßsonde aufgebrachte Sondensubstanz üblicherweise belastet, sodaß nach einem oder mehreren Einzelexperimenten eine Alterung der Sondensubstanz auftritt. Der Begriff „Alterung” wird in der vorliegenden Anmeldung ganz allgemein für eine Veränderung eines gewünschten Zustandes der Sondensubstanz verwendet, welcher zu Beginn der abstandsspektroskopischen Messungen zum Zwecke der Messung herbeigeführt wurde. Eine Alterung kann aber nicht nur aufgrund der Ausführung von Messungen stattfinden, sondern auch ohne eine solche Messung, beispielsweise dadurch, daß bei einer als Zelle ausgebildeten Sondensubstanz vor oder auch während der Messung keine für die Zelle ausreichend eingestellten physiologischen Bedingungen gegeben sind.
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Die Alterung der Sondensubstanz kann dazu führen, daß bei der Durchführung der abstandsspektroskopischen Messung immer weniger spezifische Bindungen stattfinden, wodurch die Anzahl der Einzelexperimente wesentlich erhöht werden muß. Bei einer weniger spezifisch ausgeführten Einzelmessung muß sehr darauf beachtet werden, daß die Meßsonde in jedem Experiment die Sondensubstanz noch in der geforderten Art und Weise aufweist. So wäre es beispielsweise für eine als hydrophobe Beschichtung ausgeführte Sondensubstanz möglich, daß sich diese langsam in eine hydrophile umwandelt, wodurch die Meßergebnisse stark verfälscht würden. Bei der Ausführung der Sondensubstanz als Zellenbeschichtung, wobei häufig nur eine Zelle auf den Cantilever paßt, kann es dazu kommen, daß die Zelle abstirbt und sich bereits vor Durchführung des Meßexperimentes sehr stark verändert, so daß die eigentliche Messung nicht mehr durchgeführt werden kann. Auch hier kann es zu falschen Meßergebnissen kommen, wenn dieser Vorgang unbemerkt vonstatten geht. Bei einem unbehandelten Cantilever kann es dazu kommen, daß durch den Kontakt mit der Probe ein Adsorbat gebildet wird, so daß selbst unspezifische Bindungen nicht mehr möglich sind.
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Ist eine die Messung störende oder sogar verhindernde Alterung der Meßsonde, sei sie vorbehandelt oder unbehandelt, eingetreten, so wird die Meßsonde üblicherweise ausgewechselt. Dieses Wechseln der Meßsonde kann aber durchaus mit Problemen verbunden sein. Die Meßsonde ist in der Regel in eine Meßsondenaufnahme integriert, die in dem Rastersondenmikroskop gehalten wird. Zu den verschiedenen Implementierungen hierfür gehören zum Beispiel eine Halterung mit einer Feder oder eine Halterung mittels Vakuum. Diese Halterung muß beim Wechseln der Meßsonde nun gelöst werden, um eine neue Meßsonde einbauen zu können. Üblicherweise erfolgt das Auswechseln manuell. Nach einem Wechsel der Meßsonde muß eine neue Kalibrierung durchgeführt werden. Im Fall einer durchzuführenden Kraftmessung mit dem Cantilever muß beispielsweise die Federkonstante des neuen Cantilevers bestimmt werden. Die hierfür zur Verfügung stehenden Verfahren sind allerdings nur in ungenügender Art und Weise genau, so sind Abweichungen von bis zu 20% oder mehr möglich. Ein gängiges Verfahren ist die Methode des thermischen Rauschens. Hierbei wird eine Kraft-Abstandskurve auf einer harten Unterlage aufgenommen und anschließend eine Messung der Bewegung des Cantilevers durchgeführt. Die tatsächlich zu untersuchende Probe stellt in der Regel aber keine harte Unterlage dar, sodaß neben dem Wechsel der Meßsonde bei dieser Methode auch noch die Probe zwischenzeitlich gewechselt werden muß. Neben der eher komplizierten Handhabung besteht ein großer Nachteil darin, daß die Federkonstante nicht exakt bekannt ist. In Abhängigkeit von der verwendeten Meßsonde werden also von Experiment zu Experiment andere Abweichungen erhalten, die eine Interpretation der Meßdaten erheblich erschweren, insbesondere wenn beispielsweise eine statistische Auswertung vorgenommen werden soll.
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Es wurde alternativ vorgeschlagen, den Cantilever nach dem Herausnehmen aus dem Rastersondenmikroskop nicht wegzuwerfen, sondern zu reinigen und neu mit einer Sondensubstanz zu beschichten. Dieses soll zum Beispiel dadurch erreicht werden, daß die Cantilever in einem Plasma gereinigt wird. Hierdurch wird der Cantilever zwar gereinigt, ist anschließend aber völlig unpräpariert. Dies bedeutet, daß eine im Rahmen des Aufbringens der Sondensubstanz vorgesehene Basisbeschichtung auch wiederholt werden muß. Auch dieses kann schon die Federkonstante beeinflussen, so daß zur Sicherheit in jedem Fall neu kalibriert werden muß. Darüber hinaus ist der Zeitbedarf für diese Methode beträchtlich.
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Das Dokument
US 6 353 221 B1 beschreibt ein Verfahren für ein Rasterkraftmikroskop. Das Rasterkraftmikroskop kann in einem Reinigungsmodus betrieben werden, bei dem Kontaminationen von der Sondenspitze entfernt werden können.
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In dem Dokument
JP 09-145 726 A wird ein Reinigungsverfahren für eine Sondenspitze eines Rasterkraftmikroskops beschrieben. Hierbei wird die Sondenspitze in ein Ultraschallbad getaucht.
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Das Dokument
JP 07-229 906 A betrifft ein Verfahren zum Reinigen eines Cantilevers. Hierbei wird die Spitze des Cantilevers in eine Ätzlösung (KOH-Lösung) getaucht.
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Das Dokument M Fujihira et al., Ultramicroscopy 82, pp. 181–191 (2000), beschreibt ein Reinigungsverfahren für eine goldbeschichtete Sondenspitze eines Rasterkraftmikroskops.
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Das Dokument P.-H. Puech et al., Ultramicroscopy 106, pp. 637–644 (2006), beschreibt einen experimentellen Ansatz für das Messen von Zell-Zell Anhaftungen in einem Rasterkraftmikroskop.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ausgehend von dem Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Betreiben einer eine Rastersondenmikroskopeinrichtung aufweisenden Meßanordnung sowie eine Meßanordnung mit einer Rastersondenmikroskopeinrichtung zu schaffen, bei denen die Mehrfachnutzung einer Meßsonde unter Beibehaltung einer möglichst hohen Genauigkeit der Messungen ermöglicht ist, auch wenn eine Alterung der Meßsonde mit einer hierauf angeordneten Sondensubstanz auftritt.
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Nach einem Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Betreiben einer eine Rastersondenmikroskopeinrichtung aufweisenden Meßanordnung geschaffen, wobei bei dem Verfahren mit einer Verlagerungseinrichtung eine in einem Meßsondenabschnitt mit mindestens einer Sondensubstanz beladene Meßsonde der Rastersondenmikroskopeinrichtung und eine Aufnahme für eine Probe, mit der die mindestens eine Sondensubstanz bei einer rastersondenmikroskopischen Messung in Wechselwirkung tritt, innerhalb eines von mehreren, mit Hilfe der Verlagerungseinrichtung einnehmbaren Relativpositionen von Meßsonde und Aufnahme aufgespannten Verlagerungsbereiches relativ zueinander bewegt werden und die Meßsonde nach Gebrauch bei der rastersondenmikroskopischen Messung in dem Verlagerungsbereich verbleibend gereinigt wird.
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Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Meßanordnung mit einer eine Verlagerungseinrichtung aufweisenden Rastersondenmikroskopeinrichtung geschaffen, wobei die Verlagerungseinrichtung konfiguriert ist, um eine in einem Meßsondenabschnitt mit mindestens einer Sondensubstanz beladene Meßsonde und eine Aufnahme für eine Probe, mit der die mindestens eine Sondensubstanz bei einer rastersondenmikroskopischen Messung in Wechselwirkung tritt, innerhalb eines von mehreren, mit Hilfe der Verlagerungseinrichtung einnehmbaren Relativpositionen von Meßsonde und Aufnahme für die Probe aufgespannten Verlagerungsbereiches relativ zueinander zu bewegen, und wobei eine Meßsondenreinigungseinrichtung gebildet ist, die konfiguriert ist, um nach der rastersondenmikroskopischen Messung die Meßsonde in dem Verlagerungsbereich verbleibend zu reinigen.
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Die Erfindung umfaßt den Gedanken, die für eine rastersondenmikroskopische Messung genutzte Meßsonde, die ihrerseits mit mindestens einer Sondensubstanz beladen ist, nach der rastersondenmikroskopischen Messung in einer Meßumgebung verbleibend zu reinigen, nämlich in einem Verlagerungsbereich, welcher von mehreren Verlagerungspositionen, die für die Meßsonde und die Probenaufnahme relativ zueinander mit Hilfe der Verlagerungseinrichtung erreichbar sind, aufgespannt wird. Auf diese Weise ist eine Art „in situ”-Reinigung ermöglicht. Der Eingriff in die für die rastersondenmikroskopische Untersuchung genutzte Anordnung wird so möglichst gering gehalten. Demgegenüber sieht der Stand der Technik einen vollständigen Austausch der Meßsonde oder das Verbringen der Meßsonde in eine von der Meßanordnung separierte Reinigungsvorrichtung vor. Mit dem hier vorgeschlagenen Verbleib der Meßsonde in dem Verlagerungsbereich beim Reinigen können nachteilige Auswirkungen hinsichtlich der anschließenden Wiederverwendung der Meßsonde, insbesondere betreffend die Genauigkeit und Vergleichbarkeit der Messung, möglichst gering gehalten oder sogar vollständig ausgeschlossen werden. Die mit Hilfe der Verlagerungseinrichtung zur Verfügung stehenden Verlagerungsoptionen ermöglichen vorzugsweise eine relative Verlagerung von Meßsonde und Probenaufnahme im dreidimensionalen Raum, aber auch eine Verlagerung nur in einer Ebene oder nur entlang einer Dimension kann vorgesehen sein.
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Beim Reinigen der Meßsonde wird ein nach der rastersondenmikroskopischen Messung an der Meßsonde verbleibender Teil der mindestens einen Sondensubstanz gereinigt. Hierdurch ist es ermöglicht, die Reinigung unter Erhalt mindestens eines Teils der Sondensubstanz auszuführen.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß beim Reinigen der nach der rastersondenmikroskopischen Messung an der Meßsonde verbleibende Teil der mindestens einen Sondensubstanz im wesentlichen vollständig an der Meßsonde verbleibt.
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Bevorzugt sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, daß beim Reinigen Meßrückstände entfernt werden.
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Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß nach dem Reinigen und wahlweise schon während des Reinigens die Meßsonde mit neuer Sondensubstanzbeladen wird.
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Eine Weiterbildung der Erfindung kann vorsehen, daß wenigstens der Meßsondenabschnitt beim Reinigen in einer für die rastersondenmikroskopische Messung genutzten Meßkammer der Rastersondenmikroskopeinrichtung angeordnet wird, wahlweise indem wenigstens der Meßsondenabschnitt in der Meßkammer verbleibt.
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Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß wenigstens der Meßsondenabschnitt beim Reinigen der Meßsonde in einem für die rastersondenmikroskopische Messung genutzten Meßfluid angeordnet wird, wahlweise indem wenigstens der Meßsondenabschnitt nach der rastersondenmikroskopischen Messung in dem Meßfluid verbleibt. Alternativ zu dieser Ausgestaltung kann vorgesehen sein, daß zumindest der Meßsondenabschnitt zum Reinigen das Meßfluid verläßt, wodurch aufgrund von Oberflächenspannungen die verbleibende Sondensubstanz zumindest teilweise gelöst werden kann. Sollte die Sondensubstanz durch das Herausziehen aus dem Meßfluid nicht gelöst werden, so kann diese Verfahrensgestaltung dadurch ergänzt werden, daß die Meßsonde nun in ein anderes Fluid eingetaucht wird, in welchem ein chemischer Prozeß zum Reinigen genutzt wird. Dieses kann dann ohne Rücksichtnahme auf die zu untersuchende Probe erfolgen. So kann beispielsweise eine Verdauung der Sondensubstanz durchgeführt werden, wenn es sich hierbei um eine Zelle handelt. Dieses kann dann ausgeführt werden, auch wenn die Probe selbst ebenfalls eine Zelle ist.
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Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß die Meßsonde und die Aufnahme für die Probe mit von der Verlagerungseinrichtung umfaßten Grobverlagerungselementen in Grobabstufungen und mit von der Verlagerungseinrichtung umfaßten Feinverlagerungselementen in Feinabstufungen relativ zueinander bewegt werden. Als Grobverlagerungselemente sind beispielsweise Schrittmotoren nutzbar, wohingegen als Feinverlagerungselemente beispielsweise piezoelektrisch betriebene Stellglieder zur Verfügung stehen.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß beim Beladen der Meßsonde mit der mindestens einen Sondensubstanz die mindestens eine Sondensubstanz als Substanzverbund aufgebracht wird, der eine haftvermittelnde Basis und eine hierauf gebildete Substanz umfaßt. Hierbei kann vorgesehen sein, daß beim Reinigen die Substanz im wesentlichen vollständig entfernt wird, sodaß nur die haftvermittelnde Basis an der Meßsonde verbleibt, die dann neu beladen werden kann.
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Bevorzugt sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, daß beim Reinigen die Meßsonde in Kontakt mit einer Abfallfläche gebracht wird. Die Abfallfläche weist beispielsweise eine Abfallschicht auf, die aus einem Material ist, auf dem die Sondensubstanz sich gerne niederläßt. Wird nun die Meßsonde nach der rastersondenmikroskopischen Messung, insbesondere die auf der Meßsonde verbleibende Sondensubstanz mit der Abfallschicht in Kontakt gebracht, kann eine Bindung zwischen der Abfallschicht und der verbleibenden Sondensubstanz sich ausbilden, sodaß die Sondensubstanz an der Abfallschicht verbleibt, wenn die Meßsonde wieder von der Abfallfläche entfernt wird. Die Bindung beruht üblicherweise auf Adhäsionskräften zwischen Sondensubstanz und Abfallschicht, wobei mittels Einstellen von bevorzugten Umgebungsparametern, beispielsweise Druck oder Temperatur, das Entstehen und die Stärke der Bindung unterstützt werden können. Die Sondensubstanz verbleibt dann zumindest teilweise auf der Abfallschicht. Die Abfallschicht kann an einem Zusatzbauteil gebildet sein. welches wahlweise selbst relativ zur Meßsonde bewegt werden kann. Auf diese Weise kann das Zusatzbauteil mit der Abfallschicht auch in einen Bereich zwischen Meßsonde und Probe verfahren werden, um dann in die Reinigung der Meßsonde einbezogen zu werden. In einer einfachen Ausgestaltung kann die Abfallfläche aber auch einfach auf einem Probenträger zur Verfügung gestellt werden, bevorzugt dem Probenträger, auf dem auch die mittels der rastersondenmikroskopischen Messung untersuchte Probe aufgebracht ist. Es kann vorgesehen sein, daß sich ein Teil der Sondensubstanz auf der Abfallschicht niederläßt und eigenständig von der Sonde löst. Eine Zelle wird beispielsweise auf die Abfallfläche wandern, wenn es dort anziehendere Lebensbedingungen gibt. Die Meßsonde steht dann ohne weitere Krafteinwirkungen dem nächsten Experiment zur Verfügung. Die Gefahr einer möglichen Beschädigung einer Sondenbeschichtung ist hierbei sehr gering. Eine weitere Ausgestaltung kann vorsehen, die Abfallschicht durch eine Änderung physikalischer oder chemischer Parameter effektiver zu gestalten. Die Abfallschicht kann auch aggressiv ausgebildet sein und die Sondensubstanz zumindest teilweise zerstören und absorbieren.
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Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß die Meßsonde lind die Abfallfläche relativ zueinander bewegt werden, wenn der Kontakt der Meßsonde mit der Abfallfläche gebildet ist.
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Eine Weiterbildung der Erfindung kann vorsehen, daß beim Reinigen die Meßsonde umströmt wird mit einem Fluid ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Fluiden: Reinigungsfluid und Meßfluid der rastersondenmikroskopischen Messung. Die Sondensubstanz oder Teile hiervon werden bei dieser Ausgestaltung mit Hilfe einer auf die Meßsonde gerichteten Strömung entfernt. Eine solche Strömung kann beispielsweise mit Hilfe einer Pipette erzeugt werden, die eine kleine Öffnung aufweist und an die Meßsonde herangebracht wird, zum Beispiel von der Seite. Das ausgestoßene Fluid reißt die Sondensubstanz zumindest teilweise von der Meßsonde los und trägt sie von der Meßsonde fort. Nicht nur bei dieser Art der Reinigung, sondern auch bei den weiteren wahlweise vorgesehenen Möglichkeiten zum Reinigen der Meßsonde. kann vorgesehen sein, die Meßsonde für den Verlauf der Reinigung in eine Position zu verlagern, die beabstandet von später noch zu untersuchenden Probenabschnitten ist, so daß insbesondere verhindert ist, daß von der Meßsonde beim Reinigen gelöste Sondensubstanzteile auf die noch zu untersuchende Probenfläche fallen.
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Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß beim Reinigen Lichtstrahlen auf die Meßsonde eingestrahlt werden. Beispielweise kann Laserlicht verwendet werden, bevorzugt in Form kurzer Laserimpulse mit einer ausreichend hoch gewählten Energie. Eine zweckmäßige Weiterbildung kann darin bestehen, Laserlicht von der Seite auf die Meßsonde einzustrahlen.
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Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß beim Reinigen eine Meßsondenoberfläche der Meßsonde zumindest in Teilbereichen abgesaugt wird. Zum Absaugen kann in einer möglichen Ausführungsform eine Pipette wie in der Patch-Clamp-Technik verwendet werden, indem die Pipette beispielsweise seitlich oder von unten an die Meßsonde herangeführt wird und über einen Unterdruck an die Sondensubstanz andockt. Die hierdurch ausgeübte Kraft ist in der Regel größer als die Bindungskraft zwischen Sondensubstanz und Meßsonde oder zwischen unterschiedlichen Teilen der Sondensubstanz, so daß es zum wenigstens teilweisen Lösen der Sondensubstanz von der Meßsonde kommt. Das Absaugen kann sich auf einen Oberflächenbereich der Sondensubstanz beschränken.
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Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß beim Reinigen für die Meßsonde ein Umgebungsparameter ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Umgebungsparametern geändert wird: Temperatur, pH-Wert und Umgebungsfluidzusammensetzung. Mittels Änderung eines oder mehrerer Umgebungsparameter kann dafür gesorgt werden, daß die Sondensubstanz zumindest teilweise nicht länger an der Meßsonde haftet oder zumindest leichter lösbar ist. Hierbei ist zu berücksichtigen, daß bei der Änderung des oder der Umgebungsparameter möglichst ein Lösen der Probe oder deren Beschädigung vermieden werden. Dieses wird erreicht, durch sondensubstanzspezifische Lösungsparameter. Für den Fall, daß die Sondensubstanz eine Zelle auf einer haftvermittelnden Schicht umfaßt, kann beispielsweise die Zugabe von Molekülen vorgesehen sein, die eine höhere oder zumindest vergleichbare Affinität zu den an der Zellbindung beteiligten Molekülen in der Sondensubstanz haben wie die an der Bindung beteiligten Moleküle in der Zelle. Die Zelle wird sich lösen und es kann mittels anschließendem Spülen mit einem Fluid der Ausgangszustand der Sondensubstanz wiederhergestellt werden. Für den Fall, daß die Sondensubstanz eine Zelle auf einer haftvermittelnden Schicht umfaßt, deren physikalische Eigenschaften temperaturabhängig sind. kann eine Temperatursenkung dazu führen, daß die haftvermittelnde Schicht flüssiger wird und die unbrauchbare Zelle in die Lösung abgegeben wird. Durch eine anschließende Temperaturänderung wird die haftvermittelnde Schicht wieder fester.
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Nachfolgend werden bevorzugte Ausgestaltungen der Meßanordnung mit der Rastersondenmikroskopeinrichtung näher erläutert.
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Bevorzugt sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, daß die Meßsondenreinigungseinrichtung konfiguriert ist, um beim Reinigen einen nach der rastersondenmikroskopischen Messung an der Meßsonde verbleibenden Teil der mindestens einen Sondensubstanz zu reinigen.
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Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß die Meßsondenreinigungseinrichtung konfiguriert ist, um beim Reinigen Meßrückstände zu entfernen.
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Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß die mindestens eine Sondensubstanz als Substanzverbund aufgebracht ist, der eine haftvermittelnde Basis und eine hierauf gebildete Substanz umfaßt.
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Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann eine Abfallfläche vorgesehen sein. Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß die Abfallfläche in einer für die rastersondenmikroskopischen Messung nutzbaren Meßkammer gebildet ist. Bevorzugt sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, daß die Meßsondenreinigungseinrichtung konfiguriert ist, um beim Reinigen die Meßsonde und die Abfallfläche relativ zueinander zu bewegen, wenn ein Kontakt der Meßsonde mit der Abfallfläche gebildet ist.
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Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß die Meßsondenreinigungseinrichtung eine Strömungseinrichtung aufweist, die konfiguriert ist, um beim Reinigen die Meßsonde mit einem Fluid ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Fluiden zu umströmen: Reinigungsfluid und Meßfluid der rastersondenmikroskopischen Messung.
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Eine Weiterbildung der Erfindung kann vorsehen, daß die Meßsondenreinigungseinrichtung eine Lichtquelle aufweist, die konfiguriert ist, um beim Reinigen Lichtstrahlen auf die Meßsonde einzustrahlen.
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Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß die Meßsondenreinigungseinrichtung eine Saugeinrichtung aufweist, die konfiguriert ist, um beim Reinigen eine Meßsondenoberfläche der Meßsonde, wahlweise beschränkt auf einen Oberflächenbereich der Sondensubstanz, zumindest in Teilbereichen abzusaugen.
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Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, daß die Meßsondenreinigungseinrichtung eine Einstelleinrichtung aufweist, die konfiguriert ist, um beim Reinigen für die Meßsonde einen Umgebungsparameter ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Umgebungsparametern zu ändern: Temperatur, pH-Wert und Umgebungsfluidzusammensetzung. Hierfür können beispielsweise Temperaturregelungen verwendet werden wie Peltierelemente. Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß die Vorlagerungseinrichtung Grobverlagerungselemente und Feinverlagerungselemente aufweist.
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Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen der Erfindung
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Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf Figuren einer Zeichnung näher erläutert. Hierbei zeigen:
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1a und b eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einer Meßsonde, auf der eine Sondensubstanz immobilisiert ist;
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2a, b und c eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einer Meßsonde, wobei die Meßsonde mittels Kontakt mit einer Abfallfläche gereinigt wird;
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3a, b und c eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einer Meßsonde, wobei die Meßsonde mittels einer auf die Meßsonde gerichteten Strömung gereinigt wird; und
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4a und b eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einer Meßsonde, wobei die Meßsonde mittels einer Saugeinrichtung gereinigt wird.
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1a zeigt eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einer als Cantilever ausgeführten Meßsonde 1, wie sie in Rasterkraftmikroskopen genutzt wird. Die Meßsonde 1 ist an einem freien Ende 2 auf einer Unterseite 3 mit einer Sondensubstanz beladen, die bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel von einer Schicht 10 und einer Zelle 20 gebildet ist. Die Schicht 10 dient als Haftvermittler für die Zelle 20. Die Schicht 10 und die Zelle 20 sind im Rahmen einer Vorbehandlung auf die Meßsonde aufgebracht. Die Schicht 10 ist an dem freien Ende 2 der Meßsonde 1 aufgebracht, da dort die Empfindlichkeit der Meßsonde 1 am größten ist. Auch ist hier ein Auswandern der Zelle 20 an einen Ort verhindert, an dem die Zelle 20 bei der rastersondenmikroskopischen Messung nicht in Wechselwirkung mit einer zu untersuchenden Probe 30 treten kann. Die Meßsonde 1 ist zur einfacheren Handhabung an einer Sondenbasis 5 befestigt.
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Die Meßsonde 1 ist zusammen mit der Sondenbasis 5 über eine Sondenhalterung 7 an eine der Meßsonde 1 zugeordnete Verlagerungseinrichtung 50 gekoppelt, die in 1a schematisch als ein Block dargestellt ist und in einer tatsächlichen Meßanordnung ein oder mehrere Verlagerungselemente umfaßt, mit denen die Meßsonde 1 in verschiedene Verlagerungspositionen innerhalb der Meßanordnung gebracht werden kann. Hierbei handelt es sich nicht nur um Positionen, die die Meßsonde 1 bei der Ausführung der rastersondenmikroskopischen Messung einnimmt, sondern auch um Verlagerungspositionen im Bereich der Meßanordnung, in die die Meßsonde 1 mittels der Verlagerungseinrichtung 50 für verschiedene Zwecke gebracht werden kann. Hierzu gehört auch das Verbringen der Meßsonde 1 in eine Position zum Reinigen der Meßsonde 1 nach der rastersondenmikroskopischen Messung. Die Verlagerungselemente ermöglichen üblicherweise eine Verlagerung im dreidimensionalen Raum, aber auch eine Verlagerung nur in einer Ebene oder nur entlang einer Dimension kann vorgesehen sein. Manuell oder elektrisch betreibbare Verlagerungselemente, beispielsweise unter Verwendung von Schrittmotoren (Grobverlagerung), können genutzt werden. Verlagerungselemente sind als solche dem Fachmann in verschiedenen Ausführungen bekannt und bedürfen hier deshalb keiner weiteren Detailbeschreibung. Es kann vorgesehen sein, mehrere verschachtelte Verlagerungselemente in einem Aufbau zu nutzen, beispielsweise ein Verlagerungselement zum feinstufigen Verfahren der Meßsonde 1, für eine rastersondenmikroskopische Messung, beispielsweise bei einer Abstandsspektroskopie, und ein anderes, über Schrittmotoren angesteuertes Grobverlagerungselement, um die Meßsonde 1 in eine Reinigungsposition zu bringen.
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Die von der Sondensubstanz umfaßte Schicht 10 kann in einer anderen Ausgestaltung über die gesamte Unterseite 3 der Meßsonde und auch über eine Unterseite 6 der Sondenbasis 5 verteilt sein.
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In 1b ist zum besseren Verständnis eine Anordnung gezeigt, bei der sowohl die Meßsonde 1 als auch die Probe 30 verlagert werden können. Die der Meßsonde 1 zugeordnete Verlagerungseinrichtung 50 ist so konfiguriert, daß ein Punkt 25 auf der Zelle 20 lediglich eine vertikale Bewegung mit einer bestimmten Auslenkung 51 durchführen kann. Eine weitere, der Probe 30 zugeordnete Verlagerungseinrichtung 52 ist so konfiguriert, daß ein Punkt 35 auf der Probe 30, eine laterale Bewegung in der Ebene 53 durchführen kann, die hier lediglich im Schnitt gezeigt ist. Aus der Sicht des Punktes 35 kann der Punkt 25 der Zelle 20 nun an alle Orte des Quaders 54 gelangen. Dieser Raum ist der schon oben erwähnte, mittels der Verlagerungseinrichtungen geschaffene Verlagerungsbereich. Basen beider Verlagerungseinrichtungen sind am Gestell befestigt. Dies ist in 1b schematisch mittels des Bezugszeichens 70 angedeutet.
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2a, b und c zeigen eine schematische Darstellung einer Meßanordnung mit einer Meßsonde zum Erläutern eines Verfahrens zum Reinigen der Meßsonde, bei dem die Meßsonde in Kontakt mit einer Abfallfläche gebracht wird. Für gleiche Merkmale werden in den 2a, b und c die gleichen Bezugszeichen wie in 1 verwendet. Die Verlagerungseinrichtungen sind zur Vereinfachung der Darstellung weggelassen.
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Gemäß 2a ist die Meßsonde 1 mit der hieran im Rahmen einer Vorbehandlung immobilisierten Sondensubstanz mit der Schicht 10 und der Zelle 20 in einem Behälter 40 angeordnet, der mit einem Meßfluid 41 gefüllt ist. Zunächst wird eine rastersondenmikroskopische Messung ausgeführt, bei der die Zelle 20 mit einer Probe 30 wechselwirkt. Der Behälter 40 ist als Teil der Rastersondenmikroskopeinrichtung ausgeführt. Das Meßfluid 41 dient dazu, für die Zelle 20 eine Meßumgebung zu bilden, in welcher die Zelle 20 mindestens für die Dauer eines Experimentes überlebt. Hierzu wird beispielsweise eine Pufferlösung verwendet. Die Füllhöhe des Meßfluids 41 in dem Behälter 40 ist zweckmäßig so gewählt, daß die Meßsonde 1 inklusive der Sondenbasis 5 vollständig eingetaucht ist. Die Sondenhalterung 7 taucht hingegen nur teilweise in das Meßfluid 41 ein. Ein Eintauchen der Verlagerungseinrichtung 50 (s. 1b) wäre prinzipiell möglich, ist aus technischer Sicht aber weniger geeignet, da die Verlagerungseinrichtung wegen nötiger Abdichtungen aufwändiger in ihrer Konstruktion wäre.
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Gemäß 2b wird die Zelle 20, nachdem sie insbesondere wegen der rastersondenmikroskopischen Messung gealtert und hierdurch unbrauchbar geworden ist, in Kontakt mit einer Abfallschicht 31 gebracht, um die Meßsonde 1 zu reinigen. Eine solche Reinigung kann auch dann vorgesehen sein, wenn nach einer bestimmten Anzahl von rastersondenmikroskopischen Messungen aus statistischen Gründen eine alterungsbedingte Reinigung notwendig ist.
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Die notwendige Relativbewegung zwischen der Meßsonde 1 und der Probe 30 sowie der Abfallfläche 31 kann dadurch ausgeführt werden, daß die Meßsonde mit Hilfe der ihr zugeordneten Verlagerungseinrichtung 50 bewegt wird. Alternativ oder in Ergänzung hierzu kann auch eine Bewegung des Behälters 40 mittels der Verlagerungseinrichtung 52 ausgeführt werden. Bei dem Überführen der Meßsonde 1 aus dem Bereich oberhalb der Probe 30 in den Bereich oberhalb der Abfallschicht 31 wird die Zelle 20 fortdauernd in dem Meßfluid 41 gehalten. Der dann gemäß 2b ausgebildete Kontakt zwischen der Zelle 20 und der Abfallschicht 31 kann mit Hilfe verschiedener Methoden überwacht werden. Zum einen bietet sich eine Kraftaufzeichnung an. Es kann auch vorgesehen sein, ein Fluoreszenzsignal zur Überwachung zu nutzen. Je nach Zellsorte oder Sondensubstanz können verschiedene Methoden genutzt werden.
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Gemäß 2c verbleibt die Zelle 20 auf der Abfallfläche 31, wenn die Meßsonde 1 wieder von der Abfallfläche 31 wegbewegt wird. Auch hier ist es selbstverständlich möglich, dieses mit einer beliebigen Relativbewegung von Abfallfläche 31 und Meßsonde 1 zueinander auszuführen. Die auf der Meßsonde 1 verbleibende Schicht 10 steht nun für weitere rasterson denmikroskopische Messungen zur Verfügung.
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3a, b und c zeigen eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einer Meßsonde, wobei die Meßsonde mittels einer auf die Meßsonde gerichteten Strömung gereinigt wird. Für gleiche Merkmale werden in den 3a, b und c die gleichen Bezugszeichen wie in den vorangehenden 1 und 2 verwendet.
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Nach 3a ist eine Pipette 80 in der Nähe der Meßsonde 1 angeordnet. Mit der Pipette 80 wird eine Strömung 81 erzeugt, die auf die Zelle 20 gerichtet ist. Gemäß 3b wird mit der Strömung 81 dann die Zelle 20 von der Schicht 10 gelöst.
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Nach den Darstellungen in den 3a und 3b ist der Bereich der Sondensubstanz mit der Zelle 20 direkt innerhalb der Strömung 81 angeordnet. Dieses kann unter Umständen zu einer Beschädigung auch der Schicht 10 führen. Gemäß 3c ist einer anderen Ausführungsform deshalb vorgesehen, daß die Strömung 81 unterhalb der Zelle 20 verläuft, so daß die von der Strömung ausgehenden Kräfte auf die Zelle 20 bei deren Ablösung dosiert werden können.
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Die Pipette 80 ist in den dargestellten Ausführungsformen unterhalb der Zelle 20 angeordnet. Alternativ kann die Pipette 80 auch in anderen Positionen relativ zu der Sondensubstanz positioniert werden, beispielsweise direkt von der Seite oder von oben.
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4a und 4b zeigen eine schematische Darstellung einer Anordnung mit einer Meßsonde, wobei die Meßsonde mittels einer Saugeinrichtung gereinigt wird. In 4a und 4b werden für gleiche Merkmale die gleichen Bezugszeichen wie in den vorangehenden 1 bis 3 verwendet.
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Es sind eine Pumpe 60 und eine hieran angeschlossene, flexible Leitung 61 vorgesehen, die an eine Saugeinrichtung 62 gekoppelt ist, sodaß ein von der Pumpe 60 erzeugter Unterdruck über die Saugeinrichtung 62 auf die Zelle 20 gegebenen wird. Gemäß 4b wird ein Teil der Zelle 21 so mit Hilfe der Saugeinrichtung 62 angesaugt und die gesamte Zelle 20 kann von der Schicht 10 gelöst werden. Die Schicht 10 verbleibt an der Meßsonde 1 und kann genutzt werden, um eine neue Zelle für weitere rastersondenmikroskopische Untersuchungen zu binden. Um den Prozeß des Ablösens mit Hilfe der Saugeinrichtung 62 überwachen zu können, ist mit einem Meßgerät 63 eine Patch-Clamp-Messung vorgesehen. Hiermit kann dann beispielsweise nach dem in 4a gezeigten Andocken an die Zelle 20 auch getestet werden, ob die Zelle 20 noch vital ist. Es ist hierdurch eine Möglichkeit gegebenen, eine von der Abstandsspektroskopie unabhängige Messung durchzuführen, ob die Sondensubstanz, nämlich die Zelle 20, tatsächlich ausgetauscht werden muß.
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Eine weitere Ausführungsform kann vorsehen, daß die Saugeinrichtung 62 mit einer eigenständige Verlagerungseinrichtung 64 (vgl. 4b) ausgestattet ist, die es ermöglicht, die Saugeinrichtung 62 unabhängig zu bewegen. Somit wäre auch ein Austausch oder eine externe Reinigung der Saugeinrichtung 62 möglich, ohne in die rastersondenmikroskopische Messung einzugreifen. Die Anordnung befindet sich wie schon in den 2 und 3 in einem Behälter mit einem Meßfluid, daß hier der Übersichtlichkeit halber in der schematischen Zeichnung nicht mitgezeichnet wurde. Technisch können die Pumpe 60, die flexible Leitung 61, das Meßgerät 63 und die eigenständige Verlagerungseinrichtung 64 bevorzugt auch außerhalb des Behälters 40 angeordnet werden.
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Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung sein.
