NL1017669C2 - Inrichting voor het vervaardigen van preparaten voor een cryo-elektronenmicroscoop. - Google Patents

Description

Inrichting voor het vervaardigen van preparaten voor een cryo-elektronenmicroscoop

De uitvinding heeft betrekking op een inrichting voor voor het vervaardigen van preparaten voor een cryo-elektronenmicroscoop, omvattende een klimaatkamer, waarin zich een houder voor een grid voor het opnemen van een monster be-5 vindt, middelen voor het blotten van het grid en een daarin opgenomen monster en een houder voor een vloeistof waarmee genoemd monster afgekoeld kan worden.

Naast de scanning elektronenmicroscoop (SEM), waarbij met een scannende elektronenbundel vooral oppervlakken worden 10 bestudeerd, wordt gebruik gemaakt van verschillende typen transmissie elektronenmicroscopen (TEM). Bij veel van dergelijke microscopen worden monsters, bijvoorbeeld een biopt of celsuspensie, geprepareerd door te fixeren en te ontwateren.

Na inbedding in een hars kan een ultradunne coupe (bijvoor-15 beeld 50 nm) gesneden worden die vervolgens wordt gekleurd en wordt doorschenen met een elektronenbundel.

In cryo-elektronenmicroscopie wordt een zogenaamde grid, e.g. een raster met hexagonale openingen met een diameter van enkele tientallen microns, in een suspensie van te on-20 derzoeken deeltjes, zoals bijvoorbeeld eiwitmoleculen of cellen, gedompeld. Daarna wordt overtollige suspensie verwijderd door te 'blotten', i.e. aan één of beide zijden vloeipapier of een ander medium dat gemakkelijk vocht opneemt tegen het grid te drukken.

25 Bij dit blotten neemt de dikte van de film in de ope ningen van het grid af van bijvoorbeeld 3 a 4 μτα tot 100 nm.

In een film met een dergelijk geringe dikte ontstaat onder invloed van de London/van der Waals attractie van de lucht/vloeistof grenslagen in het midden van de film een ge-30 bied dat nog dunner is en dat zich langzaam naar buiten toe, dat wil zeggen in de richting van de rand van de betreffende opening in het grid, uitbreidt. Tijdens dit proces, dat wel wordt aangeduid als draineren, raken de gesuspendeerde deel- , ' . / .1 ; . ; · ;».· 2 tjes opgesloten tussen de vloeistofoppervlakken. Als volgende stap wordt het monster zeer snel afgekoeld, zodat de vloeistof in een glasachtige toestand komt. Het aldus verkregen preparaat kan bij een lage temperatuur (bijvoorbeeld -170 °C) zon-5 der verdere bewerkingen in een cryo-elektronenmicroscoop bekeken en gefotografeerd worden.

Een inrichting voor het vervaardigen van preparaten voor een cryo-elektronenmicroscoop is bijvoorbeeld bekend uit S. Trachtenberg, "A Fast-Freezing Device with a Retractable 10 Environmental Chamber, Suitable for Kinetic Cryo-Electron Microscopy Studies", Journal of Sructural Biology 123, 45-55 (1998). In deze publicatie wordt een inrichting beschreven die is voorzien van een klimaatkamer met doorzichtige polycarbo-naat wanden. Onder de kamer bevindt zich een bad van vloeibaar 15 ethaan. De temperatuur en de (hoge) luchtvochtigheid in de kamer worden geregeld door middel van verwarmingselementen en een ultrasone luchtbevochtiger. Nadat een grid is voorzien van een monster wordt deze, met de hand of automatisch door middel van een onafhankelijke eenheid, geblot. Vervolgens wordt een 2 0 sluiter in de bodem van de kamer geopend en valt het grid met hoge snelheid in de ethaan, zodat het monster zeer snel afkoelt, i.e. vitrificeert. Daarna wordt de kamer omhoog bewogen en is het preparaat gereed.

Een dergelijke opstelling en werkwijze komt tegemoet 25 aan het inzicht dat het preparaat tot aan het moment van bevriezen gevoelig is voor veranderingen in temperatuur en luchtvochtigheid. Gebleken is echter, dat de bestaande apparatuur onvoldoende in staat is grote aantallen preparaten te vervaardigen op een reproduceerbare manier.

30 Met de onderhavige uitvinding wordt beoogd te voorzien in een verbeterde inrichting van het in de eerste alinea beschreven type, waarmee op beter reproduceerbare wijze preparaten vervaardigd kunnen worden.

Hiertoe heeft de inrichting volgens de uitvinding het 35 kenmerk dat de middelen voor het blotten van het grid in de klimaatkamer zijn geplaatst. Het verdient de voorkeur dat de genoemde middelen van buiten de klimaatkamer bediend kunnen worden en/of dat de genoemde middelen ten minste één element 3 omvatten waarop een medium voor het opnemen van vocht bevestigd is of kan worden en dat op gecontroleerde wijze naar het grid, wanneer deze zich in een blotpositie bevindt, toe bewogen kan worden.

5 Met de inrichting volgens de uitvinding kunnen schom melingen in de temperatuur en de luchtvochtigheid van de omgeving van het grid beter onderdrukt worden. Gevonden werd dat de reproduceerbaarheid van het vervaardigen van preparaten veel sterker afhangt van de genoemde parameters dan tot nu toe 10 werd vermoed. Bovendien kan de vervaardiging van preparaten met de inrichting volgens de onderhavige uitvinding (relatief) eenvoudig uitgevoerd en grotendeels geautomatiseerd worden.

Het verdient dan ook de voorkeur dat de houder voor het grid en de middelen voor het blotten van het grid elk zijn voorzien 15 van een aandrijving en dat de inrichting middelen, zoals een PC, omvat of hiermee is verbonden die zijn ingericht om deze aandrijvingen te besturen en zo ten minste het grid in een suspensie van te onderzoeken deeltjes onder te dompelen, het grid naar een blotpositie te verplaatsen en dit grid één of 20 meer malen te blotten.

De uitvinding heeft voorst betrekking op een werkwijze voor het vervaardigen van een preparaat door middel van de beschreven inrichting, waarbij in de klimaatkamer een relatieve luchtvochtigheid wordt gehandhaafd die hoger is dan 97%.

25 De uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van de aangehechte figuren waarin een uitvoeringsvoorbeeld van de inrichting volgens de onderhavige uitvinding schematisch is weergegeven.

Figuren 1 en 2 tonen respectievelijk een voor- en een 30 zijaanzicht van een inrichting voor het vervaardigen van preparaten voor een cryo-elektronenmicroscoop.

Figuur 3 toont in perspectief een deel van het inwendige van de klimaatkamer van de inrichting volgens figuren 1 en 2 .

35 Figuur 1 toont een inrichting 1 voor het vervaardigen van preparaten voor een cryo-elektronenmicroscoop omvattende een klimaatkamer 2, een voorste compartiment 3 waarin de aandrijvingen voor hieronder te bespreken onderdelen in de kli- 4 maatkamer 2 zijn ondergebracht en een achterste compartiment 4 waarin een elektronische besturing voor de genoemde aandrij-vingen dan wel middelen om met een buiten de inrichting 1 geplaatste aansturing te communiceren ondergebracht kunnen zijn.

5 Onder de klimaatkamer 2 bevindt zich een vat 5 met een centrale holte voor het opnemen van een koelmedium waarmee een preparaat gevitrificeerd kan worden, zoals bijvoorbeeld vloeibaar ethaan. Het vat 5 kan voorts bijvoorbeeld een ringvormig kanaal omvatten waarin een tweede koelmedium, zoals vloeibaar 10 stikstof, gebracht kan worden. Dit medium kan dienen om de ethaan te koelen en/of om gerede preparaten tijdelijk op te slaan. Vat 5 kan door middel van een tafel 6 en een daarbij behorende pneumatische aandrijving 7 omhoog en omlaag bewogen worden. Het inwendige van de klimaatkamer 2 is toegankelijk 15 door middel van een deur 8 welke is voorzien van een venster.

Figuur 3 toont het inwendige van de klimaatkamer 2 doordat in deze figuur de zijwanden en de deur 8 zijn weggelaten. De klimaatkamer 2 omvat een tweetal parallele buizen 9, welke dienen ter ondersteuning van een deel van de overige on-20 derdelen in de klimaatkamer 2. Aan de buizen 9 zijn een dwarsbalk 10 en een subframe 10A bevestigd die weer steun bieden aan een tweetal draaibare armen 11, 11'. Aan de uiteinden van deze armen 11, 11' zijn ronde blotelementen 12, 12' draaibaar bevestigd. Elk van de blotelementen 12, 12' omvat een pad of 25 kussen 13, 13’ waaraan een vloeipapier of een ander vochtopne-mend medium bevestigd kan worden. Om de positie van dit vloeipapier te stabiliseren bevindt zich in het midden van de blotelementen 12, 12' een opening, eventueel aangevuld met radiaal verlopende kanalen in het oppervlak van de kussens 13, 13'. De 3 0 opening staat in verbinding met een vacuümkanaal door de armen 11, 11' en de buizen 9, welk kanaal is aangesloten op een va-cuümpomp in het achterste compartiment 4 van de inrichting 1.

Door middel van een pneumatische aandrijving, waarvan in figuur 3 alleen een pneumatische leiding 14 is getoond en 35 die op zichzelf bekend is, kunnen de armen 11, 11' en daarmee de blotelementen 12, 12' uit elkaar bewogen worden tegen de werking van nastelbare veren in. Met deze veren kunnen de blotelementen 12, 12' weer naar elkaar toe bewogen worden.

5

Parallel aan de buizen 9 bevindt zich, in het voorste gedeelte van de klimaatkamer 2, een buis 15 die door middel van een pneumatische aandrijving in het voorste compartiment 3 met grote snelheid omlaag geschoten kan worden en vervolgens 5 met een stappenmotor (relatief langzaam) weer omhoog bewogen kan worden. Aan het uiteinde van deze schietbuis 15 is een (indirecte) houder voor een grid bevestigd, welke houder in dit geval bestaat uit een klem 15' voor een pincet 16.

Aan de buizen 9 is voorts een driehoekig element 17 be-10 vestigd dat ter plaatse van de tophoek een ringvormige geleiding 18 omvat voor het geleiden van het pincet 16, de klem 15' en de schietbuis 15.

Naast en onder het pincet 16 bevindt zich een houder 19 voor een container of buisje 20 voor het opnemen van een sus-15 pensie van te onderzoeken deeltjes. Onder de klimaatkamer 2 is voorts een reservoir (getoond zonder buitenwand) geplaatst dat van binnen is voorzien van een ultrasone luchtbevochtiger 21, welke door de onderplaat van de klimaatkamer 2 heen steekt.

Aan de bovenzijde van het reservoir bevindt zich een kap 22 20 die (te) grote druppels uit de luchtbevochtiger 21 afvangt.

Voorts bevat de klimaatkamer 2 verwarmingselementen (niet getoond) , waarmee op een op zich bekende wijze de temperatuur geregeld kan worden.

Het vervaardigen van een preparaat voor een cryo-25 elektronenmicroscoop kan geautomatiseerd geschieden en bijvoorbeeld aangestuurd worden door een PC. Na het plaatsen van het buisje 20 met daarin een suspensie van te onderzoeken deeltjes en een rustperiode van bijvoorbeeld 20 tot 30 minuten, waarin het buisje 20 en de suspensie kunnen acclimatise-30 ren, wordt het pincet 16, waarin in de onderzijde van de bek een grid (ex Stork Veco; niet getoond) geklemd is, naar beneden bewogen en ondergedompeld in de genoemde suspensie. In plaats van onderdompelen is het bijvoorbeeld ook mogelijk een kleine hoeveelheid suspensie eenzijdig aan te brengen, e.g.

35 met een pipet of spray inrichting. Hiertoe kan een zijwand van de klimaatkamer 2 voorzien zijn van een afsluitbare opening 25 (figuur 1).

6

Na het aanbrengen van de suspensie wordt het pincet 16 omhoog bewogen in een positie waarin de blotelementen 12, 12' tegen het uiteinde van het pincet 16 en daarmee tegen de grip gedrukt kunnen worden. Afhankelijk van de omstandigheden, zo-5 als de eigenschappen van het specifieke grid, de viscositeit van de gebruikte suspensie en de temperatuur, kan het Plotten één of meer malen herhaald worden en kan bovendien de druk waarmee geblot wordt ingesteld worden. Bovendien kan zo de dikte van de film in de openingen van het grid geregeld wor-10 den.

Elk van de blotelementen 12, 12’ is aan zijn achterzijde voorzien van een cirkelvormige opstaande rand 23 die concentrisch is met de rest van het blotelement 12 en die is voorzien van een vertanding met bijvoorbeeld 16 tanden. De ge-15 noemde armen 11, 11' zijn elk voorzien van een plaatvormig lichaam 24 dat aan zijn uiteinde is voorzien van een veerkrachtige nok die bij een terugkerende beweging van de respectieve arm 11 tegen één van de genoemde tanden drukt en zo het blotelement 12 l/16e slag verdraait. Op het moment dat de arm 11 2 0 weer naar binnen beweegt valt de genoemde nok achter de vol gende tand en aldus is gegarandeerd dat bij elke keer dat geblot wordt, het blotelement 12 over een van te voren bepaalde afstand verdraait en zo voorzien wordt in een ongebruikt stuk vloeipapier ter hoogte van het grid. Nadat voldoende is geblot 25 kan enige tijd gewacht worden om het hierboven beschreven draineren in het grid te laten verlopen.

Daarna is het preparaat in principe klaar en kan het in het ethaan onder de klimaatkamer 2 geschoten worden. Hiertoe wordt het vat 5 omhoog bewogen om dicht bij de onderplaat van 3 0 de klimaatkamer 2 te komen. Vervolgens wordt de houder 19 voor het buisje 20, die tevens als sluiter dienst doet, door middel van een pneumatische aandrijving, waarvan in figuur 3 alleen een pneumatische leiding 14' is getoond, opzij gedraaid zodat een daaronder gelegen opening vrijkomt en wordt het pincet 16 35 met de schietbuis 15 naar beneden geschoten. Het monster in het grid vitrificeert vrijwel instantaan en kan daarna verplaatst worden naar het genoemde ringvormige kanaal in het vat 5 of kan op een andere manier opgeslagen worden. Vervolgens 7 wordt een ander, bij voorkeur steriel, grid in het pincet 16 geplaatst en wordt het pincet 16 door middel van een stappen-motor omhoog bewogen waarna het volgende preparaat vervaardigd kan worden.

5 Het is gebleken dat door middel van de uitvinding en de bovenbeschreven voorkeursuitvoeringen op reproduceerbare wijze en in (relatief) korte tijd een groot aantal preparaten voor een cryo-elektronenmicroscoop vervaardigd kan worden. Doordat het blotten niet met een verstoring van het klimaat in 10 de klimaatkamer 2 gepaard gaat wordt het preparaat, dat tijdens het blotten en het daar op volgende draineren juist het meest kwetsbaar is, zo min mogelijk belast.

Door voorts te werken bij een luchtvochtigheid hoger dan 97%, bij voorkeur 100%, wordt dit effect nog versterkt.

15 Hoewel in bestaande inrichtingen voor het vervaardigen van preparaten wordt gewerkt bij hoge luchtvochtigheid is gebleken dat, door het gebruik van sensoren die een luchtvochtigheid van 97% of meer kunnen waarnemen en/of door te controleren op de aanwezigheid van mist en/of condens op de wanden van de 20 klimaatkamer, het mogelijk is een luchtvochtigheid van 100% in te stellen zonder dat daarbij grote druppels ontstaan die het prepareren zouden kunnen verstoren.

De uitvinding is vanzelfsprekend niet beperkt tot de in het bovenstaande beschreven uitvoeringsvormen en kan binnen 25 het kader van de conclusies gevarieerd worden. Indien bijvoorbeeld een ander medium dan water wordt gebruikt voor het suspenderen van de te onderzoeken deeltjes, zal het gas in de klimaatkamer bij voorkeur niet met water doch met dat medium verzadigd worden.

30

Claims (10)

1. Inrichting (1) voor het vervaardigen van preparaten voor een cryo-elektronenmicroscoop, omvattende een klimaatkamer (2), waarin zich een houder (15') voor een grid voor het opnemen van een monster bevindt, middelen (12) voor het blot- 5 ten van het grid en een daarin opgenomen monster en een houder (5) voor een vloeistof waarmee genoemd monster afgekoeld kan worden, met het kenmerk dat de middelen (12) voor het blotten van het grid in de klimaatkamer (2) zijn geplaatst.

2. Inrichting (1) volgens conclusie 1, waarbij de ge-10 noemde middelen (12) van buiten de klimaatkamer (2) bediend kunnen worden.

3. Inrichting (1) volgens conclusie 1 of 2, waarbij de genoemde middelen ten minste één element (12) omvatten waarop een medium voor het opnemen van vocht bevestigd is of kan wor- 15 den en dat op gecontroleerde wijze naar het grid, wanneer deze zich in een blotpositie bevindt, toe bewogen kan worden.

4. Inrichting (1) volgens conclusie 3, waarbij aan weerszijden van het grid, wanneer deze zich in de genoemde positie bevindt, in een dergelijk element (12, 12') is voorzien.

5. Inrichting (1) volgens conclusie 3 of 4, waarbij het element (12) (respectievelijk de elementen) telkens tussen bewegingen van en naar de genoemde positie automatisch roteert en/of transleert (respectievelijk roteren en/of transleren).

6. Inrichting (1) volgens één der voorgaande conclu-25 sies, waarbij in de klimaatkamer (2) een sensor is geplaatst waarmee een luchtvochtigheid hoger dan 97% gemeten kan worden.

7. Inrichting (1) volgens één der voorgaande conclusies, waarbij de houder (15') voor het grid en de middelen (12) voor het blotten van het grid elk zijn voorzien van een 30 aandrijving en waarbij de inrichting (1) middelen, zoals een PC, bevat of hiermee is verbonden die zijn ingericht om deze aandrijvingen te besturen en zo ten minste het grid in een suspensie van te onderzoeken deeltjes onder te dompelen, het grid naar een blotpositie te verplaatsen en dit grid één of 35 meer malen te blotten.

8. Werkwi j ze voor het vervaardigen van een preparaat door middel van de inrichting (1) volgens één der voorgaande conclusies, waarbij in de klimaatkamer (2) een relatieve luchtvochtigheid wordt gehandhaafd die hoger is dan 97%.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij de lucht vochtigheid 100% of nagenoeg 100% is.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9, waarbij de luchtvochtigheid voor gestuurd op basis van de waarneming dat in de klimaatkamer (2) mist aanwezig is en/of de wanden van de 10 klimaatkamer (2) beslaan.