CN115406915A - 制备样品的方法和制备样品的设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备样品的方法和制备样品的设备。该方法包括以下步骤：将样品材料施加至具有两个较大侧部的扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域；将带样品材料的扁平式样品承载件部分地竖向浸入到容纳有低温液体的储存部中，直到带有样品材料的所有区域定位在低温液体的表面下方；通过将至少一股低温液体流从处于低温液体的表面处或位于其紧下方的水平引导至位于扁平式样品承载件的每个较大侧部上的样品材料来使样品材料玻璃化，其中，该扁平式样品承载件处于储存部中的低温液体的表面处或在其紧下方；将带有玻璃化的样品材料的扁平式样品承载件完全浸入低温液体中，以将扁平式样品承载件冷却至低于136K的温度。

Description

制备样品的方法和制备样品的设备

技术领域

本发明涉及在低温条件下制备样品的方法，该样品用于在低温条件下在电子显微镜中进行成像或衍射实验。

背景技术

样品可以是大分子化合物的(单个)颗粒，该颗粒用于在透射电子显微镜(TEM)中进行成像或者在衍射实验期间使用。衍射实验例如是在低温条件下通过单色带电粒子或电离辐射进行检查。

可以通过一种包括三个步骤的方法来制备样品。在第一步骤中，将样品材料溶解在水中以形成水溶液或分散体。在第二步骤中，将含有样品材料的水溶液或分散体施加至TEM样品承载件。TEM样品承载件包括由薄的箔覆盖的支承件、特别是载网。在第二步之后，样品承载件在承载件上的薄的箔上包括下述一个或更多个区域：所述区域具有由含有样品材料的水溶液或分散体形成的薄膜。在第三步中，通过将样品承载件(部分地)浸入容纳有低温液体的容器中或通过用低温液体进行“喷洒”来快速冷却样品材料，使具有含有样品材料的水溶液或分散体的区域玻璃化。

样品承载件通常包括标准TEM载网，该标准TEM载网是直径大约为3.05mm且厚度为30μm的铜支承载网，但是也可以具有不同的结构(构造和尺寸)。样品承载件通常还包括TEM的电子束可穿透的薄的碳(或其他材料)箔以填充载网网格之间的间隙。

在透射电子显微镜中，通过在超高真空环境中使用电子束来检查样品材料。TEM包括产生电子束的电子源，该电子束通常具有例如介于60KeV与300KeV之间的能量。然后，偏转器和透镜操纵光束，使得光束照射样品材料。样品材料通常是由例如生物材料制成的薄的样品，或者是厚度小到足以使得其对电子显示出可穿透性的半导体材料。为此，通常使用例如介于30nm(对于包括许多高Z原子(high-Z atom)的样品、比如半导体材料或金属样品材料)与200nm(对于生物样品材料)之间的厚度，但是也可以使用例如厚度为1μm的样品。

光束在穿过样品材料时与样品材料相互作用。一些电子不受阻碍地穿过样品材料，一些电子被样品材料散射，同时产生X射线量子，并且一些电子被样品材料吸收。穿过样品材料的电子然后用于例如在诸如荧光屏的传感器上形成图像(由投影透镜系统放大)。荧光屏可以是使用CCD传感器或CMOS传感器的相机系统的一部分。然而，还已知直接在CMOS或CCD传感器上形成图像。这种传感器通常能够成像4000x4000像素。还已知获得信息的其他方法，比如形成样品材料的电子能量损失谱或能量色散X射线图、或者形成给出晶体学信息的衍射图案。

当通过电子束检查生物样品材料时，在检查期间会发生损坏。这种损坏部分地由局部加热引起，并且部分地由样品材料中的化学键破坏引起。这种损坏的影响在低温温度下比在室温下要小得多。因此，优选地在低温TEM中检查生物样品材料，在该低温TEM中，可以在低温温度下观察样品材料。在这种情况下，低温是指低于冰的玻璃化转变温度的温度，在该冰的玻璃化转变温度处，无定形冰是稳定的；如136K或更低的温度。需要这样的温度，否则冰晶的形成将会损害生物细胞或组织。当放置在TEM样品室的真空内时，样品玻璃化过程还将防止“湿”生物样品材料的脱水。

注意的是，在液氮或甚至液氦的样品温度下运行的低温显微镜是商业可获得的。为了避免在检查前对样品材料造成损坏，必须避免生物细胞或组织中的冰的结晶化。这是通过将样品材料非常快地制冷到低于136K的温度、使得形成玻璃化冰(也称为无定形冰)而不是结晶冰来实现的。

在本领域中已知在低温条件下制备用于在电子显微镜中进行成像或衍射实验的样品材料的若干方法。

用于样品材料的低温制备的第一种方法是在施加样品材料之后将样品承载件插入低温液体中。

EP 2 381 236A1涉及一种用于在样本承载件上制备低温TEM样本的设备，该设备包括柱塞、吸液纸、用于保持低温液体的容器，柱塞将样本承载件移动至用于施加液体的施加器位置，将样品承载件吸干液体，以及将样品承载件插入低温液体中。该设备的特征在于它示出了：第一接纳部，该第一接纳部用于保持配装成存储一个或更多个样本承载件的第一存储囊状物，柱塞配备有用于夹持样本承载件的夹持件；第二接纳部，该第二接纳部用于将第二存储囊状物保持在低温温度处以将一个或更多个样品承载件存储在低温温度处；并且该设备配装成将样本承载件从第一存储囊状物经由施加器位置和吸液位置自动移动至第二存储囊状物。

S.Kasas等人的“Vitrification of cryoelectron microscopy specimensrevealed by high-speed photographic imaging(通过高速摄影成像揭示的低温电子显微镜标本的玻璃化)”，Microscopy杂志，第211卷，第1期，2003年7月，第48至53页中包括通过样品载网的插入制冷对样品玻璃化机制的详细分析。

在US9865428的第3栏中提到了Kasas等人的文献。

在描述了现有技术的图1B中示出了将样品插入低温液体中。根据US9865428中的图1B中，使用“竖向插入”技术而不是“水平插入”方法使样品S玻璃化(参见US9865428的图1A)。竖向插入被认为会产生不令人满意的结果，因为样品S是“线性”(沿竖向方向)冷却而不是“面上(face on)”冷却(参见US9865428的第9栏)。在竖向插入期间，在低温液体与样品之间没有直接接触，因为当将样品承载件插入时，在低温液体的表面下方的样品承载件的两个平面侧面附近形成间隙。因此，位于样品承载件上的样品通过从周边向中心冷却载网而以间接方式冷却。这由在上文提到的Kasas的文章中的图7示出。在这种方法期间，在玻璃质层上会形成冰晶。这些冰晶能够损坏样品。

在US9865428的图2A中描绘的样品是“水平插入”的结果，并且当使用低温TEM在相对较低的放大倍率处成像时，没有显示出基本同质/无特征的图像。相反，它点缀着深色的点状特征。这些是在插入期间在膜面朝上(背对制冷剂表面)的侧部上形成的表面的冰岛。这些特征的存在掩盖了对共享共同视线的样品的研究，并且在用于研究样品的带电粒子束中引起不必要的散射效应。

用于样品材料的低温制备的第二种方法是通过在将样品材料施加至样品承载件上之后用低温液体进行“喷洒”来快速冷却样品材料。

US9865428公开了一种制备用于在带电粒子显微镜中进行研究的样品的方法，其中，使用制冷剂对样品进行快速冷却，该方法包括以下步骤：

提供用于输送低温流体的两个导管，这两个导管中的每个导管通向吸嘴中，这些吸嘴布置成跨过中间间隙面向彼此；

将样品放置于所述间隙中；

将低温流体泵送通过所述导管以便同时从所述吸嘴进行冲洗，从而将样品从两个相反侧突然浸入低温流体中。

根据US9865428的“喷洒”方法的缺点是，在用低温流体开始冷却时，样品的环境是空气，这需要大量的湿度来防止薄的含水样品层的蒸发。然后，该潮湿空气与样品和样品承载件一起被冷却，并将在玻璃化样品上沉积一定量的结晶冰。如上所述，在生产高质量低温电子显微镜样品时要避免冰晶。

EP3475681B1描述了一种用于在低温条件下制备用于成像或衍射实验的样品的方法和设备，该方法包括以下步骤：将样品施加至样品承载件上，比如施加至支承件上的膜、特别是包括位于支承件上的这种膜的载网；将残留介质、通常是液体从位于支持件上的膜上的温育样品中去除；将承载件上的样品玻璃化。通过将液体冷却剂的射流引导至膜的中央和样品上而将样品在小于5ms内玻璃化。在样品玻璃化后，将整个样品承载件冷却至低温温度，以防止玻璃化样品的再次加热。接下来，将样品和承载件存储在低温流体中直到成像。

根据EP3475681B1的样品冷却速度足够块以产生玻璃化冰，但是这种方法的缺点是不能立即冷却整个样品和样品保持件。在开始喷射液体冷却剂与整个样品承载件处于低温温度下的时刻之间的200ms至300ms的时间段内，可能会发生样品的部分解冻。这会在玻璃质层中产生结晶冰，该结晶冰可能会损坏样品中的大分子化合物。

根据本发明的方法的发明者发现的是，现有技术中描述的方法在制备用于电子显微镜应用的玻璃化的样品材料中没有显示出令人满意的结果。特别是在玻璃质样品层中包括的结晶冰将会损坏生物结构。此外，冰晶将会散射电子束并显著降低图像质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于在低温条件下制备样品的改进的方法和设备，该样品用于在低温条件下在电子显微镜中进行成像或衍射实验，该方法和设备没有显示上述缺点。

为此目的，根据本发明的方法的特征在于，该方法包括以下步骤：

a.将样品材料施加至具有两个较大侧部的扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域，

b.将带有样品材料的扁平式样品承载件部分地竖向浸入到容纳有低温液体的储存部中，直到带有样品材料的所有区域都定位在低温液体的表面下方，

c.通过将至少一股低温液体流从处于低温液体的表面处或在低温液体的表面紧下方的水平引导至位于扁平式样品承载件的每个较大侧部上的样品材料来使样品材料玻璃化，该扁平式样品承载件处于储存部中的低温液体的表面处或在储存部中的低温液体的表面紧下方，以及

d.将带有玻璃化的样品材料的扁平式样品承载件完全浸入到低温液体中，以将扁平式样品承载件冷却至低于136K的温度。

根据本发明的方法具有的优点是，低温液体流将会将潮湿空气“推动”远离样品材料的环境并用低温液体来代替该潮湿空气。

另一个优点是，使样品材料玻璃化和使样品承载件冷却所需的时间与现有技术中描述的方法相比更短。这个更短的时间将减少能够在玻璃质层内部形成的结晶冰的量。因此，获得了低温电子显微镜图像中原始样品材料的更好表示。

根据本发明的方法是一种在低温条件下制备样品的方法，该样品用于在低温条件下在电子显微镜中进行成像或衍射实验。

样品材料可以是大分子化合物的(单个)颗粒。将样品材料施加至具有两个较大侧部的扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域，以用于在透射电子显微镜中或在衍射实验期间进行成像。样品材料可以例如是生物样品，比如蛋白质、病毒、细胞、细胞成分、单细胞生物、细菌、纳米颗粒以及晶体。

在玻璃化之前，将样品材料作为薄的含水层施加至具有两个较大侧部的扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域。

将样品材料施加在扁平式样品承载件上。术语“扁平”是指样品承载件具有薄的形状。在二维中，样品承载件可以具有任何形状，例如矩形、三角形或圆形。然而，三维具有比其他二维小得多的尺寸。

扁平式样品承载件具有两个较大侧部。可以在较大侧部中的一个侧部或两个侧部的至少一个区域上施加样品材料。

扁平式样品承载件特别地为载网，该载网包括位于网格之间的薄的箔。载网通常是标准的TEM载网；具有的直径约为3.05mm且厚度为30μm的铜支承载网，但可以具有不同的结构(构造和尺寸)。与载网相比，网格之间的薄的箔是TEM的电子束可穿透的。该薄的箔由例如碳箔、方华箔或方华箔与碳或一氧化硅的组合制成。在称为

的具体实施方式中，在3mm铜载网周围添加了坚固的环，以促使通过自动夹持件进行的样品转移，而不会损坏载网和样品材料。

在EP3475681B1中描述了如何通过将样品颗粒置于水溶液或分散体中并且然后将一滴溶液或分散体滴在薄的箔上来将样品材料施加至扁平式样品承载件。在实施方式中，借助于毛细管或针将样品材料施加至样品承载件，例如印制到样品承载件上。这种称为针印的方法相比于其他已知的样品沉积方法具有的优点在于，可以控制样品材料在承载件表面上的位置以及具有样品材料的含水膜的宽度和厚度。在针印期间，通过靠近扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域定位的施加器(例如，实心针)将样品材料施加至所述区域，使得在针与扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域之间产生水中样品材料的毛细管桥。然后，施加器将在扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域上方移动，以形成水中样品材料的膜，该膜的厚度为10nm至2000nm、优选地厚度为30nm至200nm。

在实施方式中，储存部、例如移液管设置成向针或毛细管提供水中样品材料。例如，将液滴或弯液面暂时从储存部中排出，借助于针或毛细管从液滴或弯液面中取出水中样品材料，一次或重复地进行直到已经将足够的水中样品材料施加至一个或更多个扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域，并且液滴或弯液面被收回到储存部中。可以将容纳有水中样品材料的储存部储存起来以备将来使用。

优选地通过针印施加水中样品材料，因为针印通过将亚纳升体积的水中样品材料沉积在扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域上而减少了样品浪费。优选地，仅将要进行玻璃化的水中样品材料的量沉积在扁平式样品承载件的特定区域上，因此不需要从承载件表面吸干过量的水中样品材料。这将显著增加在水平样品材料的沉积与玻璃化之间的时期中对水中样品材料的层厚度的控制。

替代性地，可以使用MEMS技术(例如，参见EP1803141B1)由半导体材料(例如Si、SiO₂、SiN等)制成扁平式样品承载件。由MEMS技术制成的扁平式样品承载件是四方形的、例如5x10mm的四方形，并且包括厚度为10nm至50nm的窗。MEMS技术允许将温度传感器结合在悬浮的膜片上。

将含有样品材料的水溶液或悬浮液以层的形式施加至位于(用于载网的)网格之间的薄的箔或施加至样品承载件中的(用于半导体承载件的)窗，该层的厚度为10nm至2000nm、优选地厚度为30nm至200nm。

扁平式样品承载件可以在至少一个较大侧部上包含若干样品材料。当通过针印施加至扁平式样品承载件时，可以沉积多于一种模式的包含不同类型的样品材料的水溶液。

在实施方式中，在施加样品材料之前，将扁平式样品承载件暴露于等离子体。等离子体将使扁平式样品承载件放电，从而使扁平式样品承载件具有亲水性，这又促使将样品材料大致均匀地施加至扁平式样品承载件。代替放电或附加于放电，等离子体对扁平式样品承载件进行清洁。优选的是，就在将样品材料施加至扁平式样品承载件之前，例如在将样品材料施加至扁平式样品承载件之前小于15分钟、优选地小于10分钟，使扁平式样品承载件经受等离子体。

在另一实施方式中，可以使用在先前段落中描述的产生等离子体所需的电极中的一个或两个电极，在一方面的毛细管或针与另一方面的扁平式样品承载件之间施加高的直流电压差，从而产生样品材料朝向扁平式样品承载件的电场驱动喷射。

在另一实施方式中，至少在将样品材料施加至扁平式样品承载件之前，并且还优选地，在将样品材料施加至扁平式样品承载件期间和之后，将扁平式样品承载件的温度调节至接近、等于或高于扁平式样品承载件周围的气体的露点的温度，优选地调节至低于或高于扁平式样品承载件周围的气体的露点温度的十分之一度或多于十分之一度，例如在0.1至1.0度的范围中。在一个示例中，露点温度是根据扁平式样品承载件周围的气体的温度和湿度测量值进行计算的。也测量扁平式样品承载件的温度。这三个测量值用于闭合反馈回路以控制例如与扁平式样品承载件热接触的珀尔帖(Peltier)元件。因此，样品材料与周围气体之间的水交换、特别是蒸发被抑制或理想地被阻止，并且再现性得到提高。

在另一实施方式中，上述步骤中的一个或更多个步骤、优选地所有步骤在密闭室中进行，优选地在提供受控的温度和湿度的密闭室中进行。

根据样品制备过程的步骤b，将包含一种或更多种样品材料的扁平式样品承载件部分地竖向地浸入包含低温液体的储存部中，直到带有样品材料的所有区域都定位于低温液体的表面下方。

根据样品制备过程的步骤c，通过将至少一股低温液体流从处于低温液体的表面处或在低温液体的表面紧下方的水平引导至位于扁平式样品承载件的每个较大侧部上的样品材料来使样品材料玻璃化，其中，该扁平式样品承载件处于储存部中的低温液体的表面处或在储存部中的低温液体的表面紧下方。这至少在使水中样品材料的膜玻璃化所需的持续时间内完成。

至少一股低温液体流被引导至位于扁平式样品承载件的每个较大侧部上的样品材料。以这种方式，将更快地使位于扁平式样品承载件上的样品材料玻璃化。

根据样品制备过程的最后步骤d，将带有玻璃化的样品材料的扁平式样品承载件完全浸入到低温液体中，以将扁平式样品承载件冷却至低于136K的温度。

低温液体是处于低温温度的液体，该低温温度为等于或低于136K的温度。

低温液体优选地具有在4K至1K范围内的温度，优选地在50K至135K范围内的温度，更优选地在90K至125K范围内的温度。低温液体可以例如是液态的乙烷、丙烷、氦、氧、氮及其混合物。最优选地，低温液体是液态乙烷。液态乙烷可以具有99K的温度，并产生最高的冷却速度(Ravelli,R.B.G.等人的Automated cryo-EM sample preparation by pin-printing and jet vitrification(通过针印和喷射玻璃化的自动低温电子显微镜样品制备)http://dx.doi.org/10.1101/651208(2019))。

由于低温液体可能由于来自样品材料和扁平式样品承载件的热传递而开始蒸发，因此，低温液体可能包含一定量的气相或蒸汽相的低温液体。

根据图2A至图2C中所示的方法，将包含一种或更多种样品材料的扁平式样品承载件以竖向位置浸入。根据步骤b，将扁平式样品承载件置于储存部中的低温液体的表面下方，直到带有样品材料的所有区域都定位于低温液体的表面下方。根据步骤c，通过将至少一股低温液体流从处于低温液体的表面处或在低温液体的表面紧下方的水平引导至位于扁平式样品承载件的每个较大侧部上的样品材料来使样品材料玻璃化，其中，该扁平式样品承载件处于储存部中的低温液体的表面处或直接在储存部中的低温液体的表面下方。

优选地，完成将样品材料施加至扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域与玻璃化之间的时间小于1秒，优选地小于100ms，更优选小于10ms。根据本发明，样品材料被快速玻璃化，因为至少一股低温液体流被引导至位于扁平式样品承载件的每个较大侧部上的样品材料，其中，该扁平式样品承载件处于储存部中的低温液体的表面处或在储存部中的低温液体的表面紧下方。

不受该理论的束缚，发明者认为限制插入制冷法的冷却速率的问题是，在将扁平式承载件浸入到低温液体中之后直接在扁平式样品承载件的两个侧部处产生蒸汽层，参见Kasas(上面提到的)的文章中的图7d和图7f。该气态层在扁平式样品承载件上的样品材料与低温液体之间提供热绝缘，从而限制样品材料的冷却速率。大多数这种气体将是来自刚好高于沸点温度的低温液体的蒸汽。另外，还会有水蒸汽从样品沉积室(处于露点温度)与扁平式样品承载件一起行进到达具有低温液体的储存部。来自处于刚刚高于低温液体的沸点温度的温度的低温液体的蒸汽和水蒸汽的混合物很可能在样品材料上形成冰晶。这使得尽快将蒸汽混合物从浸入的扁平式样品承载件上去除是非常必要的，这样将仅在样品材料周围产生玻璃质冰。

为了快速去除位于样品材料与低温液体之间的低温液体/水蒸汽层，根据本发明的方法将增加浸入的扁平式样品承载件周围的低温液体上的局部压力，以加速该层中的(水)分子的上升速度。为此目的，优选地在低温液体的表面处或在低温液体的表面紧下方将两个喷嘴安装在包含一定体积的低温液体的储存部内(参见图2A)。经由该喷嘴，低温液体流将被引导至扁平式样品承载件上的样品材料。这将去除在扁平式样品承载件浸入到液体中时在扁平式样品承载件上的样品材料周围产生的蒸汽层(参见图2B)。在部分地浸入扁平式样品承载件期间，从扁平式样品承载件撞击低温液体的表面的时刻开始，低温液体流只需被施加很短的时间(<1秒)。

优选地，在储存部中的低温液体的表面处或在储存部中的低温液体的表面下方至多10mm处设置有至少两个喷嘴，并且其中，喷嘴彼此相对地安置，并且离开喷嘴的低温液体流被引导至位于扁平式样品承载件的每个较大侧部上的样品材料。

更优选地，喷嘴安置在低温液体的表面处或低温液体的表面下方至多8mm处，最优选地安置在低温液体的表面处或低温液体的表面下方至多5mm处。

优选地，储存部中的至少两个喷嘴面向彼此，扁平式样品承载件安置在喷嘴之间，离开喷嘴的低温液体流各自被引导至位于扁平式样品承载件的每个较大侧部上的样品材料，并且每个喷嘴与扁平式样品承载件之间的距离至多为5mm。更优选地，每个喷嘴与扁平式样品承载件之间的距离至多为2mm，最优选地至多为1mm。

优选地，第一喷嘴至扁平式样品承载件的距离与第二喷嘴至扁平式样品承载件的距离大约相等。更优选地，第一喷嘴至扁平式样品承载件的距离与第二喷嘴至扁平式样品承载件的距离的差小于0.1mm。

优选地，至少一股低温液体流的速度在1m/s至20m/s的范围内，更优选地在2m/s至10m/s的范围内。

优选地，流的组合质量流率介于10mL/min至2L/min之间，更优选地介于100mL/min至1L/min之间。

本发明还涉及一种用于制备样品的设备，该样品用于在低温条件下在电子显微镜中进行成像或在低温条件下在电子显微镜中进行衍射实验，该设备包括：扁平式样品承载件，该扁平式样品承载件具有两个较大侧部；能够竖向移动的臂，该能够竖向移动的臂具有夹持件以保持样品承载件；施加器，该施加器用于将样品材料施加至位于夹持件中的扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域；储存部，该储存部容纳低温液体；以及至少两个喷嘴，至少两个喷嘴用于在通过能够竖向移动的臂将扁平式样品承载件定位在储存部中的低温液体的表面处或定位在储存部中的低温液体的表面紧下方时使低温液体从处于低温液体的表面处或在低温液体的表面紧下方的水平流动至位于夹持件中的扁平式样品承载件的每个较大侧部，以使位于扁平式样品承载件上的样品材料玻璃化。

在实施方式中，第一喷嘴至扁平式样品承载件的距离与第二喷嘴至扁平式样品承载件的距离的差小于0.1mm。

在该设备的实施方式中，在储存部中设置有面向彼此的两个喷嘴，通过能够移动的臂将位于夹持件中的扁平式样品承载件定位在喷嘴之间，并且每个喷嘴与扁平式样品承载件的较大侧部之间的距离至多为5mm。

在该设备的实施方式中，第一喷嘴至扁平式样品承载件的一个较大侧部的距离与第二喷嘴至扁平式样品承载件的一个较大侧部的距离的差小于0.1mm。

在该设备的另一实施方式中，在样品材料玻璃化之后，能够移动的臂竖向地对带有扁平式样品承载件的夹持件进行定位，直到样品承载件完全浸入到低温液体中，以将扁平式样品承载件冷却至低于136K的温度。

通过以下附图和示例进一步解释本发明。所附示例本质上是示例性的和解释性的，而非限制本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，可能明显的是，可以想到许多变型，无论是否明显，都落入由本权利要求书限定的保护范围内。

附图说明

图1A：根据如US9865428中描述的现有技术的扁平式样品承载件的水平插入。

图1B：根据如US9865428中描述的现有技术的扁平式样品承载件的竖向插入。

图2A：在将扁平式样品承载件插入之前的根据本发明的设备。

图2B：在将扁平式样品承载件插入期间的根据本发明的设备。

图2C：在将扁平式样品承载件插入之后的根据本发明的设备。

图3A：在将扁平式样品承载件插入之前的根据本发明的第二设备。

图3B：在将扁平式样品承载件插入期间的根据本发明的第二设备。

在图1A和图1B中，标号表示：

XYZ 笛卡尔坐标系

S 位于扁平式样品承载件上的样品材料

Sf 扁平式样品承载件的前侧部

Sb 扁平式样品承载件的后侧部

1 设备

3 能够竖向移动的臂

3a 夹持件

5 用于低温液体的储存部

7 制冷剂浴

9 低温液体表面

11a 滑动件

11b 杆

11c 指示滑动件11a沿Z方向移动的箭头

在图2A至图2C中，标号表示：

XYZ 笛卡尔坐标系

1a 柱塞导轨

1b 柱塞机构

1c 竖向柱塞运动

2 能够竖向移动的臂

2a 样品夹持件

S 扁平式样品承载件

S’ 沉积在承载件上的样品材料

3 用于低温液体的储存部

4 低温液体

4a 液体表面

5 液体泵

6a 用于至液体泵的低温液体流的管

6b 用于来自液体泵的低温液体流的管

6c 具有在储存部内部的低温液体流的管

6d 位于管6c的端部处的用以产生低温液体流的喷嘴

7 样品插入期间从低温液体中释放的蒸汽

在图3A至图3B中，标号表示：

XYZ 笛卡尔坐标系

1a 柱塞导轨

1b 柱塞机构

1c 竖向柱塞运动

2 能够竖向移动的臂

2a 样品夹持件

S 扁平式样品承载件

S’ 沉积在承载件上的样品材料

8 用于低温液体的大型储存部

8a 用于储存部8内的低温液体的小型储存部

9 低温液体A

9a 低温液体A的表面

10 低温液体B

10a 低温液体B的表面

11a 至管11b的连接部

11b 用于从储存部10至管11c的低温液体流的管

11c 使低温液体从管11b流动通过储存部8、进入储存部8a的管

11d 位于管11c的端部处的用以产生低温液体流的喷嘴

12 对低温液体B施加压力的活塞

具体实施方式

示例

可以在Passmore,L.A.和Russo,C.J.的“Sample Preparation for High-Resolution Cryo-EM(用于高分辨率低温电镜的样品制备)”、MethodsEnzymol 579、页码51至86(2016)中找到用于低温电子显微镜的样品制备方法。这还包括使用商业可获得的

柱塞(FEI，现在为Thermo Fisher Scientific(赛默飞世尔科技))的标准玻璃化程序(协议9，第77至79页)。

比较实验A

根据图1A的现有技术的方法

图1A提供了现有技术的设备1的各方面的示意性正视图，设备1用于将位于扁平式样品承载件S上的样品材料插入式冷却至低温温度，更具体地，使用以上提及的“水平插入”技术将位于扁平式样品承载件S上的样品材料插入式冷却至低温温度。样品承载件S将通常(但不必定)具有诸如US9865428的图1D中更详细地示出的类型的复合结构。指出的是，将在以下描述中使用笛卡尔坐标系XYZ。所描述的设备1包括：能够竖向移动的臂3，能够竖向移动的臂3可以用于在扁平式样品承载件S的边缘处/附近夹持扁平式样品承载件S，并将扁平式样品承载件S保持处于大致水平取向(平行于XY平面)。该能够竖向移动的臂3包括夹持件3a，夹持件3a使用例如镊子动作来夹持扁平式样品承载件S。如果需要，扁平式样品承载件S可以具有小的突出凸耳(未描绘)，该突出凸耳允许扁平式样品承载件S更容易被夹持件3a夹持。

可以至少部分地填充有制冷剂7的浴的储存部5(比如，杜瓦瓶)使得所述制冷剂7具有暴露的上表面9(除了相对小的弯液面效应之外，上表面9将大致是水平的)。可以用于(至少部分地)将臂3移动到储存部5中的下降机构11a、11b允许位于能够竖向移动的臂3(的夹持件3a)中/上的扁平式样品承载件S被插入到制冷剂表面9的下方，其中，扁平式样品承载件S的前侧部Sf指向下方(平行于Z方向)。如此处所描绘的，下降机构11a、11b包括滑动件11a，滑动件11a可以沿着杆11b、与Z方向平行地竖向上下移动(如由箭头11c所指示的)。在插入期间，滑动件11a的向下运动例如可以是自由落体、弹射式或机动化的。作为所描绘机构的替代性方案，也可以仅手动地将扁平式样品承载件S浸入制冷剂表面9下方。

比较实验B

根据图1B的现有技术的方法

根据图1B，使用“竖向插入”技术而不是如上文针对图1A所描述的“水平插入”方法将扁平式样品承载件S玻璃化。除了插入技术外，其他遵循针对图1A所描述的方法。

示例1

根据本发明的方法；图2A至图2C

根据以上提到的Passmore等人描述的方法，将样品材料S’施加至扁平式样品承载件S。如图2A中所示，扁平式样品承载件S附接至样品夹持件2a。在如图2A中所示的根据本发明的设备中，用于低温液体6c的两个管在储存部3内部靠近低温液体4的表面4a浸入到低温液体4中。在管6c的出口处，两个喷嘴6d以之间具有小的间隙的方式彼此相对地安装(参见图2A)。泵5用于产生经由管6a供应的低温液体向上通过管6b并且然后向内通过管6c的流动。具有臂2和夹持件2a的柱塞机构1b用于将样品承载件在竖向方向上保持在间隙内侧的液体冷却剂的表面4a上方。

在样品玻璃化过程开始时，柱塞机构将开始使用柱塞机构1b沿着柱塞导轨1a快速向下1c移动，因此，带有样品材料S’的扁平式样品承载件将变得浸入低温液体中。此时，液体泵5将启动并且经由喷嘴将低温液体流(例如，99K的乙烷)引导至在位于间隙内侧的扁平式样品承载件上的浸入样品材料S’的表面(参见图2B)。根据这些流的流速，低温液体的增加的局部压力将会将在扁平式样品承载件浸入到低温液体中时在扁平式样品承载件周围形成的蒸汽层7向上推动。优选地，就在扁平式样品承载件撞击低温液体表面的时刻之前开始，低温液体流被施加非常短的时间(<1秒)。

在这个非常短的时间之后，完全浸入的扁平式样品承载件周围的蒸汽层将已经被低温液体取代(参见图2C)。另外，在扁平式样品承载件完全浸入低温液体中的时刻，柱塞的快速向下运动会停止。

示例2

根据本发明的方法；图3A和图3B

通过使用如图3A中所示的根据本发明的设备可以获得样品材料S’的玻璃化速度的进一步提高。在该设备中，将产生相对的低温液体流的两个喷嘴11d位于小储存部8a内部的低温液体B(10)的表面层10a上方一小段距离(例如，2mm)处，该小储存部8a浸入到低温液体A(9)的较大储存部8中，该低温液体A(9)具有的沸点在位于较小储存部8a内部的低温液体B(10)的熔点与沸点之间(例如，沸点为231K且熔点为86K的丙烷位于沸点为185K的乙烷内侧)。较大储存部8中的低温液体A(9a)的表面层将略高于两个喷嘴11d的竖向位置，因此连接至这些喷嘴的管内部的液体将保持处于低的温度。

在玻璃化过程开始时，柱塞机构1b将扁平式样品承载件S降低至下述位置：在该位置处，样品材料S’位于两个喷嘴11d之间(参见图3B)。在扁平式样品承载件S已经到达该位置处的时刻，柱塞运动1c暂停，并且低温液体流将从两个相对的喷嘴11d使扁平式样品承载件S的中央区域玻璃化。这是通过移动活塞12来增加较小储存部8a内部的压力来实现的。较小储存部8a中的压力增加将同时提高低温液体B的表面水平9a，参见图3B。通过使储存部8a在扁平式样品承载件S的水平处的水平尺寸尽可能小，该储存部内部的气体和蒸汽将被非常快速地向上推动。因此，样品材料S’将以比通常通过传统插入获得的快约1ms地玻璃化。

与图3A中的情况相比，活塞12已经在图3B中移动至右侧。该动作将液位10a升高至刚好高于喷嘴11d的水平。

扁平式样品承载件S的浸入部分、包括沉积的样品材料S’可以通过这种方式在0.1ms内玻璃化(取决于扁平式样品承载件的确切结构)。根据该方法进行的样品材料的玻璃化将在大约20μs内、以大于10⁶K/s的冷却速率完成。扁平式样品承载件在冷却剂流之间的半浸入位置将允许存在于扁平式样品承载件的浸没表面周围的蒸汽比处于完全浸入构型可能的情况更快地向上逸出。

通过重新开始向下移动能够竖向移动的臂2来将扁平式样品承载件完全浸入，将防止玻璃化的样品材料被仍存在于扁平式样品承载件S的上部部分中的热重新加热。

可以通过改变插入动作与活塞动作之间的同步性来修改对于这种使用流和浸入的样品玻璃化方法的不同步骤的时间。可以通过改变供低温液体流过的管11a、11b和11c的直径来改变在从喷嘴11d开始低温液体流与增加液位10a之间的时间。结果将取决于需要被玻璃化的样品材料的厚度和扁平式样品承载件的温度。

Claims (16)

1.一种制备样品的方法，所述样品用于在低温条件下在电子显微镜中进行成像或在低温条件下在电子显微镜中进行衍射实验，所述方法包括以下步骤：

a.将样品材料施加至具有两个较大侧部的扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域，

b.将带有所述样品材料的所述扁平式样品承载件部分地竖向浸入到容纳有低温液体的储存部中，直到带有样品材料的所有区域都定位在所述低温液体的表面下方，

c.通过将至少一股低温液体流从处于所述低温液体的表面处或在所述低温液体的表面紧下方的水平引导至位于所述扁平式样品承载件的每个较大侧部上的所述样品材料来使所述样品材料玻璃化，其中，所述扁平式样品承载件处于所述储存部中的所述低温液体的表面处或在所述储存部中的所述低温液体的表面紧下方，以及

d.将带有玻璃化的样品材料的所述扁平式样品承载件完全浸入到所述低温液体中，以将所述扁平式样品承载件冷却至低于136K的温度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述储存部中的所述低温液体的表面处或者在所述储存部中的所述低温液体的表面下方至多10mm处设置有至少两个喷嘴，并且其中，所述喷嘴彼此相对安置，并且离开所述喷嘴的所述低温液体流被引导至位于所述扁平式样品承载件的每个较大侧部上的所述样品材料。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述储存部中设置有面向彼此的两个喷嘴，所述扁平式样品承载件被安置在所述喷嘴之间，离开所述喷嘴的所述低温液体流各自被引导至位于所述扁平式样品承载件的一个较大侧部上的所述样品材料，并且每个喷嘴与所述扁平式样品承载件之间的距离至多为5mm。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，第一喷嘴至所述扁平式样品承载件的距离与第二喷嘴至所述扁平式样品承载件的距离的差小于0.1mm。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，完成将所述样品材料施加至所述扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域与玻璃化之间的时间小于1秒，优选地小于100ms，更优选地小于10ms。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述至少一股低温液体流的速度在从1m/s至20m/s的范围内，优选地在从2m/s至10m/s的范围内。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述流的组合质量流率介于10mL/min至2L/min之间，优选地介于100mL/min至1L/min之间。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，在施加所述样品材料之前，将所述扁平式样品承载件暴露于等离子体。

9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，至少在将所述样品材料施加至所述扁平式样品承载件之前，将所述扁平式样品承载件的温度调节至等于或高于所述扁平式样品承载件周围的气体的露点的温度。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，通过靠近所述扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域定位的针将所述样品施加至所述扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域，使得在所述针与所述扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的所述至少一个区域之间产生水中样品材料的毛细管桥。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，在所述扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域上形成水中样品材料的膜，所述膜的厚度为10nm至2000nm。

12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，上述步骤中的一个或更多个步骤、优选地所有步骤在密闭室中进行。

13.一种用于制备样品的设备，所述样品用于在低温条件下在电子显微镜中进行成像或者在低温条件下在电子显微镜中进行衍射实验，所述设备包括：扁平式样品承载件，所述扁平式样品承载件具有两个较大侧部；能够竖向移动的臂，所述能够竖向移动的臂具有夹持件以保持所述样品承载件；施加器，所述施加器用于将样品材料施加至位于所述夹持件中的所述扁平式样品承载件的至少一个较大侧部的至少一个区域；储存部，所述储存部容纳低温液体；以及至少两个喷嘴，所述喷嘴用于在通过所述能够竖向移动的臂将所述扁平式样品承载件定位在所述储存部中的所述低温液体的表面处或定位在所述储存部中的所述低温液体的表面紧下方时使低温液体从处于所述低温液体的表面处或在所述低温液体的表面紧下方的水平流动至位于所述夹持件中的所述扁平式样品承载件的每个较大侧部，以使位于所述扁平式样品承载件上的所述样品材料玻璃化。

14.根据权利要求13所述的设备，其中，在所述储存部中设置有面向彼此的两个喷嘴，通过所述能够移动的臂将位于所述夹持件中的所述扁平式样品承载件定位在所述喷嘴之间，并且每个喷嘴与所述扁平式样品承载件的较大侧部之间的距离至多为5mm。

15.根据权利要求13或14所述的设备，其中，所述第一喷嘴至所述扁平式样品承载件的一个较大侧部的距离与所述第二喷嘴至所述扁平式样品承载件的另一较大侧部的距离的差小于0.1mm。

16.根据权利要求13至15中的任一项所述的设备，其中，在所述样品材料玻璃化之后，所述能够移动的臂竖向地对带有所述扁平式样品承载件的所述夹持件进行定位，直到所述样品承载件完全浸入到所述低温液体中，以将所述扁平式样品承载件冷却至低于136K的温度。

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