ES2644764T3 - Procedimiento de detección y cuantificación de analitos de interés en un líquido y dispositivo de aplicación - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos de interes en un Ifquido y dispositivo de aplicacion

La invencion se refiere a un procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos de interes en un lfquido y a un dispositivo de aplicacion.

Mas adelante en la presente descripcion, se denominara "objetivos" a los analitos de interes buscados.

El procedimiento segun la invencion permite alcanzar lfmites de resolucion que van hasta cinco nanoobjetos por mililitro o inferiores a una concentracion de moleculas atto-molar. El lfquido puede ser complejo, es decir, que puede comprender varios tipos de analitos, de los cuales solamente interesa detectar una parte.

Numerosos trabajos muestran que la creciente utilizacion de pesticidas (fungicidas, insecticidas, herbicidas), raticidas, antibabosas, abonos, detergentes, hormonas y medicamentos, dispersa las moleculas que se introducen en su composicion en el medio ambiente y, asf, en las plantas y los alimentos.

Del mismo modo, las reacciones de combustion de carburantes emiten a la atmosfera numerosas nanopartmulas, plomo y grafito.

Las aplicaciones programadas de nanopartmulas funcionales plantean tambien el problema de su dispersion en la naturaleza.

Evaluar los riesgos de estas moleculas y nanopartmulas para el medio ambiente y para el ser humano requiere detectarlos, comprender su movilidad, su reactividad, su ecotoxicidad y su persistencia. Los parametros importantes que hay que dominar son, sobre todo, la deteccion de su presencia y el seguimiento de la evolucion de esta presencia a lo largo del tiempo.

De hecho, poder detectar y analizar los analitos presentes en el agua, el aire, el suelo, las plantas o los alimentos es un reto medioambiental importante.

Se trata igualmente de un reto medico. Poder obtener rapidamente la composicion de muestras humanas de tipo suero, sangre u organos, capturar hebras de ADN, protemas y biomarcadores circulantes, (los biomarcadores circulantes son los precursores de reincidencias metastasicas de tumores malignos), capturar bacterias o virus, detectar esporas, a un nivel de concentracion muy bajo, es esencial para establecer el diagnostico medico y es la base del tratamiento precoz de las enfermedades. La vigilancia permanente de su evolucion es indispensable para medir la eficacia de los tratamientos medicos y modificarlos si es necesario y evolucionar asf hacia una medicina individualizada.

El acceso al analisis de las secuencias de ADN se hace necesario para iniciar el desarrollo del “pronostico” (termino que se refiere a la identificacion de anomalfas geneticas que hacen probable el desarrollo a largo plazo de una enfermedad).

Asf, la deteccion por ejemplo de un numero reducido de copias de secuencias de acidos nucleicos en suero, sin recurrir a la PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa, por sus siglas en ingles) para multiplicar su numero, es tambien un reto principal para el analisis medico o la virologfa, para reducir el tiempo de analisis.

Es pues esencial disponer de tecnicas de medicion espedficas y muy sensibles que permitan detectar de manera simple, rapida, rutinaria, in situ y con bajo coste, la presencia de trazas de una multitud de analitos (moleculas espedficas, nano o micropartmulas, bacterias, virus, protemas, biomarcadores circulantes, ADN, esporas....) dispersados en un medio que puede ser complejo. Estos analitos son, por ejemplo, las 33 sustancias peligrosas enunciadas en la ley del agua (Directivas 76/464/CEE y 200/60/CEE) donde el 50% son para eliminar prioritariamente.

Esta directiva marco sobre la polftica de aguas ha impulsado el desarrollo del sector del analisis de trazas en los laboratorios, pero se proponen pocas tecnicas a nivel industrial.

Un estudio publicado por la Agencia Francesa de Seguridad Sanitaria del Medio ambiente y del Trabajo (AFSSET, por sus siglas en frances) (2006) titulado « les nano-materiaux: effets sur la sante de l'homme y sur l'environnement » evalua el estado de la tecnica en materia de tecnicas y lfmites de deteccion de nanopartmulas en aerosoles (gases de escape, humos) en el aire, el agua y los suelos.

Una primera categona esta constituida por tecnicas de deteccion no espedficas (es decir, caracterizan globalmente el conjunto de las partmulas) y que se llevan a cabo sin concentracion de los analitos previamente al analisis. Se trata de tecnicas denominadas “Contadores de Nucleos de Condensacion” (CNC) comercializadas por la compama americana TSI y por la compama alemana GRIMM. Consisten en detectar opticamente una serie de partmulas por segundo. Las partmulas pueden tener un tamafo comprendido entre 5 nm y 1 pm y una concentracion comprendida entre 0,1 y 106 partmulas/ml. Se aplican sobre todo en el caso de aire y aerosoles.

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La segunda categona esta constituida por tecnicas de deteccion no espedficas, pero que se llevan a cabo por concentracion o acumulacion de los analitos previamente al analisis. Son batenas de difusion en las que el paso del aerosol a traves de una sucesion de rejillas clasifica los analitos por tamano. Un acoplamiento con un contador de pardculas permite el recuento de la proporcion de cada granulometna de analitos cuyo tamano esta comprendido entre 2 y 200 nm. La tecnica ELPI (Impactador Electrico de Baja Presion, por sus siglas en ingles) selecciona partfculas cargadas previamente, por inercia, cuyo tamano esta comprendido entre 7 nm y 10 pm, despues los detecta electricamente. Su concentracion debe ser bastante elevada (entre 1.000 y 10.000 partfculas por ml). El analisis de movilidad electrica (Separador de Barrido de las Partfculas por Movilidad o SMPS, por sus siglas en ingles) permite detectar partfculas de 3 a 50 nm de diametro con un analizador de movilidad diferencial (DMA, por sus siglas en ingles) y un contador de partfculas.

Otra categona esta constituida por tecnicas de deteccion espedficas, que se llevan a cabo generalmente por concentracion previa al analisis. Las partfculas atmosfericas o de suelo, cuyo tamano esta comprendido entre 30 y 300 nm, se ponen en disolucion, despues se analizan, por cromatograffa ionica o por espectrometna de masas. Otra tecnica utiliza la fluorescencia inducida por laser (LIBS). Por ultimo, la fijacion previa de nanotrazadores que reconocen la superficie activa de ciertas nanopartfculas permite detectarlas de manera espedfica.

Se pueden citar, en el caso de disoluciones acuosas de partfculas organicas, las tecnicas que se llevan a cabo por recuento de los analitos por metodos de microscopio (microscopio electronico o de fuerza atomica), por separacion por tamano (ultrafiltracion, centrifugacion, fraccionamiento de flujo), cromatograffa, acoplamiento del fraccionamiento con la tecnica de deteccion denominada Espectrometna de Masas con Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-MS), y por deteccion laser.

Tambien se pueden citar, en el caso de nanopartfculas inorganicas, tecnicas de observacion al microscopio de barrido electronico (MBE), de difusion de la luz, de difusion de rayos X o de neutrones, de “Fraccionamiento en Flujo mediante Campo de Flujo” (FFFF), cromatograffa hidrodinamica (HDC), electrospray y movilidad electrica, potencial zeta (o medida de la carga superficial), absorcion atomica y analisis de elementos ligeros C-H-N-S.

Sin embargo, estas tecnicas no se adaptan mas que a analisis de tamanos, formas, estado de agregacion, carga superficial y composicion qmmica en elementos ligeros. Cuando son espedficas, sus lfmites de deteccion, despues de concentracion, son malas y se extienden de 1 g/l a 10 ng/l (o 108 a 109 nanopartfculas/ml).

Son diffcilmente cuantitativas, insuficientemente sensibles (es decir, que su concentracion del lfmite de deteccion no es suficientemente baja) y sobre todo insuficientemente espedficas para las partfculas que se desea detectar generalmente en un medio complejo. Son tambien demasiado costosas, no son moviles en el terreno, son impracticables de manera rutinaria y requieren operadores altamente especializados en los laboratorios.

Las publicaciones relativas a la deteccion de moleculas procedentes de seres vivos (o biodiagnostico) proporcionan un lfmite de deteccion mucho mas exhaustivo. Por ejemplo, en « Nanostructures in biodiagnostics » (N Chem. Rev.105 (2005) 1547-1562), una primera tabla proporciona los lfmites de deteccion alcanzados para el acido nucleico. Fluctuan entre nanomolar (nM o 10-9 moles por litro) y femtomolar (fM o 10'15 moles por litro), siguiendo la tecnica utilizada. Un solo metodo que utiliza los productos de una reaccion PCR permite alcanzar 0,1 fM. Pero este metodo es largo en base al tiempo necesario para multiplicar las cadenas de nucleotidos. Una segunda tabla proporciona los lfmites de deteccion de protemas, que fluctuan tambien entre nM y fM. Solo la tecnica de multiplicacion por codigo de barra permite alcanzar 0,030 fM (30 aM) pero es compleja de aplicar.

Este examen demuestra que existe una gran diversidad de tecnicas de deteccion y de analisis de disoluciones. Las “mas sensibles” se desarrollan en laboratorio, son costosas, lentas, poco moviles y a menudo no son espedficas. Para ser verosfmiles en los planes de la contaminacion del medio ambiente y del biodiagnostico, cualquier tecnica de deteccion de trazas debe ser de bajo coste, rapida, movil, selectiva, con suficiente resolucion para permitir alcanzar, y si es posible estar por debajo de, el umbral de deteccion de 105 a 106 nanoobjetos por mililitro o si los analitos son moleculas, femtomolar.

Las patentes de EE. UU. 2005/0079517, 5334837, 2004/0203175 y 20060105453 muestran ejemplos de preparacion de muestras por evaporacion controlada.

El objetivo general de la presente invencion es proporcionar un metodo de deteccion y cuantificacion de analitos presentes en una disolucion compleja, movil, rapido y selectivo, que puede utilizarse con numerosos tipos de analitos, economico y que permite alcanzar, incluso supera, un umbral de deteccion de 6.105 nano o microobjetos por mililitro o, si los analitos son moleculas, del orden de femtomolar.

Mas en particular, la invencion tiene por objetivo permitir la deteccion de analitos en forma de nano- o micropartfculas, analitos moleculares espedficos y nucleotidos en una disolucion simple o compleja. La invencion tiene por objetivo igualmente permitir la deteccion de analitos de tipo esporas, virus o bacterias, en una disolucion simple o compleja. La disolucion compleja puede ser preacondicionada para representar los analitos presentes en el aire, el agua, el suelo, los alimentos, los organismos vivos, etc.

La presente invencion propone un procedimiento de deteccion de analitos objeto de interes, presentes o puestos en

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disolucion, combinando una fase de concentracion natural de los analitos de interes objetivo en la muestra y una fase de captura de los analitos de interes por un ensamblaje convectivo y capilar dirigido sobre una superficie provista de sondas y comprendiendo una fase de analisis de la superficie estructurada. Estas sondas son motivos topograficos, qmmicos, biologicos, electrostaticos o magneticos.

Con este fin, la invencion tiene por objeto un procedimiento tal como se define en la reivindicacion 1.

Por convenio, las etapas del procedimiento precedente se hacen por orden alfabetico.

Para alcanzar una gran sensibilidad, es decir, la posibilidad de detectar una concentracion muy baja de analitos objetivo, la invencion propone utilizar la combinacion de una tecnica, eficaz y reproductible, de concentracion natural de la disolucion madre, con una retencion espedfica de los analitos objeto de interes en sitios organizados, denominados «sondas», dispuestos en la superficie de un sustrato, lo que permite un analisis automatizado de la superficie del sustrato.

Asf, la evaporacion controlada de la muestra en los alrededores de la lmea triple genera corrientes de conveccion que concentran los analitos en su proximidad. Ademas, cuando se desplaza la lmea triple, a medida que el lfquido se evapora a la atmosfera, en la superficie estructurada del sustrato, los analitos objetivo se fijan por fuerzas capilares a la superficie estructurada, despues son capturados (inmovilizados) por fuerzas espedficas ejercidas por las sondas.

Segun otros modos de realizacion:

- la etapa d) puede aplicarse contando los analitos capturados en la etapa c) por la superficie micro- o nanoestructurada del sustrato y comparando el numero de analitos objetivo, capturados, en una tabla de conversion, para obtener la concentracion de analitos en la disolucion madre;

- la etapa d) puede aplicarse contando los analitos capturados en la etapa c), comprendiendo estos analitos los analitos de referencia cuya concentracion es conocida y los analitos de interes cuya concentracion es desconocida pero proporcional a la de los analitos de referencia y comparando las proporciones de los analitos de referencia y los analitos de interes;

- la etapa b) puede comprender, ademas, el deposito de una placa en contacto con la muestra lfquida, para encerrarlo entre el sustrato y la placa;

- la placa y el sustrato pueden desplazarse uno con respecto al otro segun una direccion de traslacion casi paralela al sustrato, durante la evaporacion controlada de la muestra;

- el sustrato y la muestra pueden confinarse en un recinto con atmosfera controlada;

- durante la etapa c), se puede regular la presion parcial de los componentes del lfquido en atmosfera controlada;

- la etapa c) puede aplicarse aportando una cantidad de energfa suficiente para provocar y controlar la evaporacion del lfquido al nivel de la lmea triple;

- el procedimiento puede comprender una etapa a) de preacondicionamiento de la disolucion madre;

- el preacondicionamiento de la disolucion madre puede consistir en eliminar de la disolucion madre los analitos inutiles, anadir nuevos analitos objetivo y/o anadir disolventes o nuevas moleculas que favorezcan el ensamblaje convectivo y capilar sobre la superficie estructurada;

- el procedimiento puede comprender una etapa previa de preparacion de la superficie estructurada que consiste en depositar una gota de lfquido que comprende moleculas de sondas, espedficas de los analitos objetivo, en la superficie del sustrato, para que la gota recubra al menos parcialmente la superficie del sustrato, para provocar despues una evaporacion controlada de la gota en los alrededores de una lmea triple gota/sustrato/atmosfera, de tal manera que esta lmea triple se desplace, a una velocidad controlada, sobre la superficie estructurada del sustrato, a medida que se evapore el lfquido a la atmosfera, y que las moleculas sonda se fijen sobre la superficie del sustrato para crear una red de sondas estructurando la superficie del sustrato;

- el procedimiento puede comprender una etapa intermedia entre la etapa c) y la etapa d), de fijacion de fluoroforos en los analitos objetivo, capturados, para permitir un recuento por fluorimetna durante la etapa d);

- el procedimiento puede comprender, ademas, entre la etapa c) y la etapa d), al menos una etapa de diferenciacion espedfica de los analitos retenidos en la etapa c), aplicando el sustrato obtenido al termino de la etapa c) en una o varias superficies de captura funcionalizadas;

- durante la etapa c), la evaporacion puede controlarse de tal manera que la lmea triple se desplace a velocidad constante;

- durante la etapa c), la evaporacion puede controlarse de tal manera que la lmea triple se desplace a velocidad

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variable;

- las sondas de la superficie pueden definir, cada una, una red que presente un espectro optico, aplicandose la etapa d) analizando el espectro optico de cada red despues de la captura de los analitos en la etapa c) y/o

- las sondas de la superficie pueden ser cavidades de diferentes tamanos, terminando la etapa c) en la captura de los analitos objetivo en micro o nanogotas de diferentes tamanos, retenidas en las cavidades de diferentes tamanos, y aplicandose la etapa d) midiendo variaciones de intensidad de al menos una propiedad ffsica o qmmica de cada micro o nanogota, determinando el volumen de la micro o nanogota « lfmite » que no comprende ningun analito, siendo la concentracion del analito en la disolucion madre igual a 1 dividido por el volumen de micro o nanogota lfmite.

La invencion se refiere igualmente a un sistema de deteccion tal como se define en la reivindicacion 17.

Segun otros modos de realizacion:

- el medio de analisis puede ser apto para contar los analitos retenidos por la superficie estructurada del sustrato y comparar el numero de analitos obtenido precedentemente en una tabla de conversion, para obtener la concentracion de analitos en la disolucion madre;

- el sistema de deteccion comprende, ademas, una placa destinada a ponerse en contacto con la muestra de disolucion para encerrarlo entre el sustrato y la placa;

- el sustrato y la placa pueden montarse moviles y casi paralelos uno con respecto al otro segun una direccion de traslacion;

- el sustrato y la placa pueden montarse moviles uno con respecto al otro segun una direccion de traslacion, estando la placa inclinada respecto al sustrato para aplicar la muestra de disolucion sobre el sustrato estructurado;

- la placa puede ser flexible;

- la placa esta funcionalizada y/o estructurada;

- el sistema de deteccion puede comprender, ademas, un recinto con atmosfera controlada rodeando el sustrato y la muestra;

- el recinto comprende un regulador de la presion parcial de los componentes del lfquido en la atmosfera;

- el sistema de deteccion puede comprender, ademas, canales de bombeo y/o inyeccion de un flujo de gas o mezcla gaseosa;

- el sistema de deteccion puede comprender, ademas, un dispositivo de suministro de energfa, termica y/o electromagnetica;

- el medio de control se acopla a al menos un dispositivo de observacion de la lmea triple para adaptar el control de la evaporacion y ajustar la velocidad de desplazamiento de la lmea triple, a al menos un valor deseado, sobre la superficie estructurada del sustrato;

- el regulador de la presion parcial puede acoplarse a al menos un dispositivo de observacion de la lmea triple para adaptar las presiones parciales de los componentes del lfquido en la atmosfera y ajustar la velocidad de desplazamiento de la lmea triple, a al menos un valor deseado;

- la superficie del sustrato puede comprender una estructura adoptada entre estructuras topograficas, biologicas, qmmicas, electrostaticas, magneticas o una combinacion de estas estructuras;

- la disolucion madre puede ser una disolucion coloidal, una disolucion preacondicionada, una disolucion prefiltrada, una disolucion que comprenda tensioactivos y objetivos de calibracion, una disolucion que integre objetivos marcados por el color, por fluorescencia o por un codigo de barras integrado o una disolucion que integre acoplamientos objetivos-sondas ya realizados en disoluciones y/o

- la disolucion madre y/o la muestra puede/pueden comprender varios tipos de disolventes.

Otras caractensticas de la invencion se enunciaran en la descripcion detallada a continuacion hecha con referencia a las figuras adjuntas que representan, respectivamente:

- figura 1, vista esquematica del perfil de una muestra dispuesta sobre un sustrato y que experimenta evaporacion natural;

- figura 2, vista esquematica del perfil de un primer modo de realizacion de un dispositivo segun la invencion, que comprende un medio de control de la evaporacion en los alrededores de la lmea triple;

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- figura 3, vista esquematica del perfil de un segundo modo de realizacion de un dispositivo segun la invencion, que comprende una placa superior de confinamiento de la muestra;

- figura 4, vista esquematica del perfil de una variante del modo de realizacion de la figura 3, que comprende una placa superior de confinamiento de la muestra menos humectante que el sustrato;

- figura 5, vista esquematica del perfil de un tercer modo de realizacion de un dispositivo segun la invencion, que comprende una placa superior movil de confinamiento de la muestra;

- figura 6, vista esquematica del perfil de un cuarto modo de realizacion de un dispositivo segun la invencion, que comprende un recinto con atmosfera controlada;

- figuras 7a a 7f, vistas esquematicas de un modo de realizacion ventajoso del procedimiento segun la invencion, que comprende dos etapas de diferenciacion espedfica de los analitos retenidos en la superficie de un sustrato de un dispositivo segun la invencion y

- figura 8, vista en perspectiva de un sustrato de deteccion de analitos despues de aplicar el procedimiento segun la invencion.

En la descripcion a continuacion, los analitos pueden ser microobjetos (celulas, bacterias...), nanoobjetos (nanopartmulas, moleculas espedficas (medicamentos, pesticidas...)), biomoleculas (ADN, protemas...) o incluso virus, esporas, etc.

La presente invencion combina tecnicas de microelectronica y funcionalizacion de superficies con tecnicas de ensamblaje convectivo y capilar para retener los analitos objetivo, buscados, en sitios funcionales y espedficos, o sondas, implantados y organizados en una superficie. Esta retencion organizada permite una etapa simple de deteccion de zonas de acoplamiento sonda/objetivo y, asf, una etapa simple de analisis.

Se lleva a cabo, de manera general, en tres fases:

1) funcionalizacion de una superficie con sitios sondas predefinidos, densificados y organizados por tecnicas de microelectronica. Estas sondas ejercen fuerzas espedficas de inmovilizacion para permitir una muestra espedfica de objetivos.

2) ensamblaje convectivo y capilar de una disolucion coloidal, eventualmente preacondicionada, que contiene los analitos objetivo, que concentra naturalmente la disolucion, sobre la superficie del sustrato.

3) deteccion de la proporcion de sitios sondas ocupados por los objetivos, que proporciona, promediando una calibracion previa, la concentracion de analitos objetivo en la disolucion ensayada.

La superficie funcionalizada que comprende los sitios sondas se representa esquematicamente por las cavidades 21 en la figura 1.

Mas en particular, el principio del procedimiento segun la invencion consiste en tomar una muestra, es decir, extraer al azar una muestra calibrada de lfquido en la disolucion madre que se tiene que analizar. Esta disolucion madre presenta una concentracion desconocida de nanoobjetos para determinar. Despues, el procedimiento segun la invencion consiste en concentrar y capturar los analitos sobre un sustrato estructurado y contar el numero de analitos capturados. A continuacion, el analisis estadfstico de una o varias de estas capturas permite deducir, con un cierto intervalo de confianza, la concentracion de la disolucion inicial. A cantidad extrafda fijada, la captura contiene tantos mas analitos buscados como este concentrada la disolucion madre. Por otra parte, cuanto mas importante sea el numero de sitios de captura presentados mas representativo sera el analisis de la composicion de la disolucion madre.

La invencion se basa en el control de la evaporacion de la muestra en una zona particular denominada lmea triple. Esta lmea es la interfase entre el lfquido de la muestra, la atmosfera en la que el lfquido es adecuado para evaporarse en determinadas condiciones de evaporacion (presion parcial, temperatura, humectabilidad del sustrato) y el sustrato solido sobre el que se deposita la muestra. Este control permite dominar el desplazamiento de la lmea triple por la superficie estructurada del sustrato (veanse las figuras 2 a 5).

Asf, el procedimiento segun la invencion comprende una etapa b) de deposito de la muestra sobre un sustrato de retencion de los analitos, donde al menos una parte de la superficie es micro o nanoestructurada. De esta manera, la muestra lfquida recubre al menos parcialmente la superficie estructurada del sustrato.

Esta superficie puede ser estructurada topograficamente, es decir que comprende relieves 22 entre los que se inmovilizan los analitos. Pero igualmente puede ser estructurada de manera funcional. Dicho de otro modo, puede comprender sitios de retencion qrnmica, biologica, electrostatica, electrica o magnetica. Estos sitios se obtienen, respectivamente, por sondas qrnmicas o biologicas fijadas en la superficie o por la presencia de electrodos que proporcionan un campo electrostatico, electrico o magnetico de retencion de los analitos de interes. La superficie puede ser estructurada igualmente por diferentes zonas de humectabilidad (o capacidad para disolver) en

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comparacion con la disolucion que se tiene que ensayar.

Preferiblemente, la estructura de la superficie se organiza segun un motivo ordenado y no aleatorio, para facilitar el analisis automatico posterior del sustrato.

Despues, el procedimiento segun la invencion comprende una etapa c) de evaporacion controlada del Kquido (o disolvente) de la muestra, casi al nivel de la lmea triple lfquido/sustrato/atmosfera, de tal manera que esta lmea triple se desplaza de manera continua sobre el sustrato, a medida que el lfquido (o disolvente) se evapora a la atmosfera.

Este control localiza la evaporacion del lfquido (o disolvente) casi al nivel de la lmea triple. Por el contrario, con una evaporacion natural, por lo tanto, no controlada (simbolizada por las flechas onduladas discontinuas 3 en la figura 1), toda la superficie S de lfquido en contacto con la atmosfera, y no solamente la zona de la lmea triple lfquido/sustrato/atmosfera, esta sujeta a evaporacion.

Por supuesto, en la practica, el control de la evaporacion se hace lo mas proximo posible a la lmea triple, en una zona de los alrededores Vt mas grande que la lmea triple. Lo que cuenta, es que el fenomeno de evaporacion del lfquido (o disolvente) sea predominante en los alrededores Vt y sobre todo en la lmea triple T, con respecto al resto de la superficie S de la muestra 1 expuesta a la atmosfera.

El procedimiento segun la invencion concentra de manera natural, y muy eficazmente, los analitos presentes en la muestra al nivel de la lmea triple gracias a corrientes de conveccion en el seno de la muestra lfquida. Estas corrientes de conveccion aparecen de manera natural puesto que la evaporacion que es predominante a partir de la lmea triple requiere un aporte de calor latente, lo que genera intercambios termicos importantes. Estas corrientes de conveccion transportan y por lo tanto concentran enormemente, los analitos hacia los alrededores Vt de la lmea triple T.

Despues, el procedimiento segun la invencion captura los analitos de interes, concentrados a nivel de los alrededores Vt de la lmea triple, sobre el sustrato que comprende una superficie micro o nanoestructurada de manera topografica, qmmica, biologica, electrostatica, electrica o magnetica.

La retencion se hace durante el desplazamiento, continuo y controlado, del frente de evaporacion (o lmea triple) del disolvente que contiene los analitos en la superficie nanoestructurada. Las fuerzas capilares, presentes al nivel de esta lmea triple, dirigen estos analitos durante el desplazamiento de la lmea triple durante la evaporacion, hacia puntos precisos del sustrato (las sondas) definidos por la estructura. Las sondas seleccionan e inmovilizan, gracias a fuerzas espedficas, los analitos objetivo buscados. En otras palabras, la lmea triple reacciona como el extremo de un rascador o cepillo natural que concentra los analitos y los extiende reteniendolos en las estructuras de la superficie 20 del sustrato.

La superficie del sustrato se trata, preferiblemente, para que sea mayoritariamente no humectante (hidrofoba si el lfquido es agua, solvofoba si el lfquido es un disolvente). Eso favorece el confinamiento de los analitos por las fuerzas de capilaridad hacia estructuras de la superficie del sustrato.

El numero de estructuras de retencion de los analitos, en la superficie del sustrato, condiciona la resolucion y la sensibilidad del procedimiento. Como este numero puede ser muy elevado, el procedimiento es muy sensible. La determinacion de las dimensiones de los sitios y/o su funcionalizacion permite considerar analitos selectivos por forma, carga o funcion qmmica, biologica o magnetica. Es posible, por ejemplo, crear mas de un millon de sitios en 2 mm cuadrados, lo que permite extraer un numero importante de analitos de la muestra sobre el sustrato, estando este numero directamente relacionado con la concentracion de objetivo de la disolucion inicial.

Asf, el procedimiento segun la invencion realiza una captura organizada que facilita la automatizacion de su recuento.

Este procedimiento permite, durante la etapa d), analizar la superficie estructurada. Este analisis puede ser una deteccion binaria (de tipo 0 o 1) rapida, y por lo tanto una medida estadfstica de la concentracion en la muestra. La deteccion de capturas puede hacerse por optica (reflexion, contraste de fase, campo oscuro, fluorescencia, epifluorescencia, fluorescencia para casos inducidos (LIBS), difraccion de haz laser, plasmones de superficie (SPR), utilizacion de nanotrazadores) o por campo electrostatico, electrico o magnetico. Tambien se puede considerar fijar, sobre los objetivos retenidos, partmulas fluorescentes despues de analizar la superficie gracias a escaneres clasicos de analisis.

La deteccion de capturas de un analito puede obtenerse tambien estructurando de manera individual los motivos sonda (por ejemplo, en redes de difraccion o en combinaciones de di o trinanopartmulas) cuyo espectro optico se modifica por la retencion.

Asf, las sondas de la superficie micro o nanoestructurada definen, cada una, una red de difraccion que presenta un espectro optico. La etapa d) se aplica entonces analizando el espectro optico de cada red de difraccion despues de la captura de los analitos en la etapa c).

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La concentracion de analitos en la disolucion madre se deduce del numero de analitos detectados en el sustrato, gracias a una tabla de conversion. Esta tabla asocia, para un numero determinado de estructuras en la superficie del sustrato, el numero de sitios ocupados por los analitos en la concentracion inicial en la disolucion madre.

Tambien son posibles diversas variantes para deducir esta concentracion.

Por ejemplo, la concentracion de un analito en la disolucion madre puede obtenerse de manera relativa, con respecto a la concentracion conocida de otro analito, que puede anadirse en la disolucion madre y que es perceptible por su color, por la lectura de un codigo de barras optico definido por cajas cuanticas integradas o por su fluorescencia. Su proporcion en la superficie funcionalizada del sustrato proporciona directamente la concentracion del analito buscado.

La concentracion de un analito en la disolucion madre puede obtenerse igualmente calibrando el metodo de muestra en las mismas condiciones de evaporacion a partir de diferentes disoluciones calibradas de analitos objetivo, identicos.

La concentracion de un analito en la disolucion madre puede obtenerse tambien buscando, previamente y en las mismas condiciones experimentales, la concentracion umbral de analito de una disolucion patron a partir de la que aparecen los primeros fallos de relleno de los sitios de recepcion de los objetivos.

La concentracion de un analito en la disolucion madre puede obtenerse igualmente determinando, previamente, las condiciones experimentales de retencion de los objetivos, a partir de las disoluciones calibradas que minimizan la concentracion lfmite terminando en un relleno de todos los sitios. Estas condiciones se adaptaran para un analisis ultrasensible.

La concentracion de un analito en la disolucion madre puede obtenerse tambien por una medida de la intensidad suministrada por cada retencion.

Se puede, para ello, capturar los analitos con motivos sonda diferentes (en tamano, por ejemplo). Se capturan entonces varios analitos objetivo por motivo retenido, por ejemplo, gotas calibradas de lfquido (eventualmente de diferentes volumenes) en motivos hidrofilos o solvofilos, separados por intervalos hidrofobos o solvofobos, por un desplazamiento rapido de la lmea triple sobre ellos. La evaporacion de los disolventes crea igualmente, en este ultimo caso, ensamblajes de analitos.

Mas precisamente, la superficie micro o nanoestructurada presenta, preferiblemente, cavidades de tamanos diferentes. El barrido rapido de esta superficie por la lmea triple deja micro o nanogotas de volumenes diferentes en estas cavidades de tamanos diferentes. Asf, cuanto mas reducido el volumen de la micro o nanogota, menos probabilidad estadfstica habra de encontrar un analito.

Se miden entonces variaciones de la intensidad de al menos una propiedad ffsica o qmmica de cada micro o nanogota. Por ejemplo, se miden variaciones de intensidad de propiedades opticas de cada cavidad despues de la evaporacion de micro o nanogotas y se traza la curva representativa de la intensidad en funcion del volumen de la micro o nanogota.

Esta curva permite determinar el volumen de la micro o nanogota denominada “lfmite” que no comprende analito. La concentracion de analito en la disolucion madre es pues igual a 1 dividido por el volumen de micro o nanogota lfmite.

La concentracion de un analito en la disolucion madre puede obtenerse finalmente conociendo el rendimiento de diferentes fases de retencion.

Preferiblemente, el procedimiento segun la invencion comprende una etapa de aclarado previa a la etapa c) para eliminar los parasitos unidos.

Un ejemplo de calculo descrito a continuacion permite evaluar los rendimientos del procedimiento segun la invencion.

Se realiza un sustrato 10 con una superficie de 2 mm x 2 mm que presenta una estructura topografica de dimensiones adaptadas a la retencion de nanopartmulas de 100 nm de diametro. Por ejemplo la superficie 20 presenta cavidades 21 de 100 nm de diametro, distantes 2 pm. Este sustrato 10 consta pues de 106sondas en forma de cavidades de retencion 21.

Se deposita una muestra en esta superficie con un espesor casi igual al diametro de las nanopartmulas que contiene. Comprendiendo la muestra una concentracion conocida de 1011 nanopartmulas objetivo por ml. El diametro de cada nanopartmula es de 100 nm.

El volumen de muestra depositada representa pues 4.10-7 cm3 o ml (10-5 x 4.10-2) y consta de 1011 x 4.10-7 = 40.000 nanopartmulas.

Con una evaporacion natural no controlada del lfquido (como la que se ilustra en la figura 1), estas nanopartmulas;

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supuestas inmoviles, no debenan llenar, estad^sticamente, mas que las cavidades para las que estan perfectamente colocadas. Dicha muestra al azar en 106 cavidades retiene un volumen de 106 x 10-5 x 10-5 x 10-5 ml sobre los 4.10-7 ml de la capa, o una nanopartmula sobre 400, es decir, 100 nanopartmulas (40.000/400) en la muestra.

Con una evaporacion controlada segun la invencion, se observa experimentalmente que, con una muestra identica, todas las nanopartmulas son retenidas por las cavidades del sustrato. Asf, las corrientes de conveccion en los alrededores de la lmea triple mejoran la retencion de las nanopartmulas. As^ es posible retener con dicho sustrato, hasta 106 nanopartmulas si la concentracion de la muestra lo permite. El procedimiento segun la invencion presenta pues una eficacia hasta 10.000 (106/100) veces superior a una evaporacion natural no controlada.

Se realiza entonces una calibracion con concentraciones diferentes de disolucion madre. Por ejemplo, las concentraciones pueden ser cada vez mas reducidas. Se puede constituir entonces una tabla de conversion entre el numero de sitios ocupados por los analitos y la concentracion inicial.

El procedimiento segun la invencion tiene por tanto una gran sensibilidad.

Para alcanzar el lfmite de deteccion de 6.105 nanopartmulas por mililitro (o femtomolar), basta entonces con poder detectar (106/1011)x(6.105) ensamblajes, o 6 nanoobjetos unidos entre 106 motivos. Este numero crece a 600, si una concentracion de partida de la muestra de 109 bastara para llenar todos los motivos. Asf, se ha determinado experimentalmente que una concentracion de 5.108 nanopartmulas por mililitro permite salvar el sistema de 106 motivos topograficos. Una sola captura sobre los 106 corresponded a una concentracion de analito menor que 5 x 108/ 106= 500 nanoobjetos por ml o, si los nanoobjetos son moleculas, (500/ 6,02.1023 ) x 103 = 8.10-19 Moles/l = 0,8 attomolar.

Con 108 sitios de captura repartidos sobre 4 cm2 el lfmite de deteccion pasana a ser 5 nanoobjetos por ml o 0,01 attomolar.

Este calculo demuestra que el procedimiento segun la invencion permite sobrepasar los lfmites de deteccion de las tecnicas clasicas, de manera simple, economica y utilizando superficies muy pequenas de sensor, por lo tanto volumenes reducidos de muestra. Permite alcanzar lfmites de deteccion de 500 nanoobjetos por ml o attomolar con 106 sitios de captura repartidos sobre 4 mm2 y 100 veces mas bajos (5 nanoobjetos por ml o 0,01 attomolar) con 108 estructuras repartidas sobre 4 cm2.

El procedimiento segun la invencion permite la deteccion/el analisis de analitos situados en un entorno lfquido de gran complejidad (agua, sueros, etc.) pero tambien en aire, suelo, alimentos, despues de poner en suspension los analitos en una disolucion madre.

Este procedimiento es simple de poner en practica, rapido, economico, movil y muy sensible. Abre un gran campo de aplicaciones que se extiende desde la nanotoxicologfa, el biodiagnostico, la nanobiomedicina, la farmacologfa hasta la nanoseguridad.

Los sistemas de deteccion de analitos, para la aplicacion del procedimiento segun la invencion, se ilustran en las figuras 2 a 5.

El modo de realizacion de la figura 2 es el mas simple. Una muestra 1, o gota, que comprende los analitos de interes 2, se deposita sobre un sustrato 10 que presenta una superficie 20 micro o nanoestructurada (o sondas) de retencion de los analitos objetivo.

Se puede favorecer la evaporacion de la gota 1 al nivel de la lmea triple creando un gradiente de temperatura en el sustrato.

Se puede asf integrar en este sistema un medio de control 30 de la evaporacion de la muestra, dispuesto para provocar una evaporacion controlada (simbolizada por las flechas onduladas discontinuas 5) de la muestra, casi en los alrededores Vt de la lmea triple T. Dicho de otro modo, el medio de control favorece una evaporacion en los alrededores Vt de la lmea triple T que predomina con respecto al fenomeno de evaporacion natural (simbolizada por las flechas onduladas discontinuas 3) que pueden aparecer al nivel del resto de la superficie de la muestra expuesta a la atmosfera Atm.

El medio de control 30 puede emitir, por ejemplo, una radiacion R, adaptada y calibrada para aportar una cantidad de energfa suficiente para vaporizar el lfquido en los alrededores Vt de la lmea triple T. El medio de control 30 puede ser, alternativamente, un flujo gaseoso que evacua rapidamente la capa lfmite de lfquido.

A medida que el lfquido se evapora en la atmosfera, la lmea triple T se desplaza sobre el sustrato. En la figura 2, la lmea triple se desplaza de izquierda a derecha.

Para mantener el fenomeno de la evaporacion en los alrededores Vt de la lmea triple T, el medio de control 30 puede montarse movil respecto a la traslacion o sobre un pivote.

El medio de control 30 puede acoplarse igualmente a al menos un dispositivo de observacion (no ilustrado) de la

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lmea triple T para adaptar el control de la evaporacion por el medio de control 30 y/o la radiacion emitida y regular, as^ la velocidad de desplazamiento de la lmea triple, a un valor deseado, en la superficie estructurada del sustrato. Esto permite controlar la velocidad de deposito de los analitos objetivo sobre las sondas.

Sin embargo, el control de la evaporacion al nivel de la lmea triple puede resultar delicado en esta configuracion, puesto que la muestra esta en un medio abierto, es decir, que presenta una gran superficie de contacto con la atmosfera. De hecho, los fenomenos de evaporacion natural pueden desempenar, en funcion de las condiciones atmosfericas, una funcion suficientemente importante para reducir el fenomeno de la concentracion y por tanto de retencion de los analitos. Ademas, la evaporacion se efectua siguiendo la lmea circular de la gota.

Segun un segundo modo de realizacion ilustrado en la figura 3, despues de haber depositado la muestra sobre el sustrato y antes de provocar la evaporacion controlada de la muestra, el procedimiento segun la invencion comprende una etapa de deposito de una placa 40 en contacto con la muestra lfquida 1 para encerrar este entre el sustrato 10 y la placa 40. Se cubre, asf, la parte de la superficie del lfquido que esta expuesta a la atmosfera en el dispositivo precedente. La placa es, preferiblemente, transparente para poder observar el desplazamiento de la lmea triple y controlar la evaporacion en sus alrededores. Por ejemplo, puede ser de vidrio cuando el disolvente de la muestra sea agua.

Este sistema forma una celula microflmdica que permite una evaporacion en medio confinado. Dicho de otro modo, solo los alrededores Vt de la lmea triple T se exponen a la atmosfera Atm. Este sistema permite un mejor control de la evaporacion, lo que conduce a una mayor reproductibilidad del relleno de los sitios sonda de captura.

El medio de control 30 provoca una evaporacion que forma un menisco en la muestra 1, entre la placa 40 y el sustrato 10 y en los alrededores Vt de la lmea triple T. El retroceso de este menisco, hacia la derecha de la figura 3, conforme a la evaporacion, provoca un desplazamiento de la lmea triple T, igualmente hacia la derecha de la figura 3. En este sistema, existe igualmente una lmea triple entre la muestra, la atmosfera y la placa 40. Sin embargo, esta placa 40 no esta estructurada, de manera que los analitos no se fijan sobre la placa 40. Puede estar tambien estructurada para evitar que los analitos se fijen en ella. Gracias a las corrientes de conveccion F1, los analitos se concentran hacia la superficie estructurada del sustrato 10.

Se trata el sustrato 10 para que no este mas que parcialmente humedecido y reunir los analitos hacia los motivos utilizando fuerzas capilares. Los motivos seleccionan los objetivos fijandolos bajo la accion de sus fuerzas espedficas.

En el modo de realizacion ilustrado en la figura 4, la placa 40 ha recibido tratamiento superficial que la hace menos humectante que el sustrato. Se obtiene entonces la lmea triple, hacia la derecha de la figura 4, conforme a la evaporacion, y dirige el desplazamiento de la lmea triple sobre el sustrato 10. El ensamblaje se efectua de manera cuasiestatica.

Este equilibrio entre la humectabilidad del sustrato y la de la placa superior es sutil. El sustrato no debe ser demasiado hidrofilo para evitar el ensamblaje compacto por conveccion pura entre las estructuras. En caso de dificultades, una doble funcionalizacion del sustrato (atraccion en los motivos y repulsion fuera de los motivos) sera una variante eficaz. Otra solucion es estructurar la placa.

Una variante a la celula microflmdica precedente, ilustrada en la figura 5, anade una traslacion controlada de la placa superior 40 en el sentido de la fecha F2a. La direccion de traslacion (flecha F2a) es casi paralela al plano del sustrato 10. Esta traslacion presenta la ventaja de controlar la expansion del menisco proximo a la lmea triple y por tanto la retencion de los analitos en las estructuras de la superficie 20. Alternativamente o en combinacion, la traslacion controlada puede ser la del sustrato 10, en el sentido de la flecha F2b. Lo que es importante, en este modo de realizacion, es que se aplique un movimiento relativo entre el sustrato 10 y la hoja 40.

Se puede prever igualmente un dispositivo de ajuste de la distancia entre la hoja superior 40 y el sustrato 10 para regular la altura del menisco.

La hoja superior 40 puede estar ligeramente inclinada y ser de material flexible y estar desplazada, segun la direccion de traslacion F2a, de manera que desempene la funcion de un raspador (o un cepillo) que aplique una disolucion coloidal sobre el sustrato estructurado.

La inclinacion de la placa 40 puede ser regulable.

Los sistemas de deteccion representados en las figuras 2 a 5 pueden situarse en un recinto con atmosfera controlada, isotermo o con gradiente de temperatura, de manera que se controle la velocidad de desplazamiento de la lmea triple.

Un ejemplo de modo de realizacion, ilustrado en la figura 6, combina la celula microflmdica con la placa superior movil 40 (y/o con sustrato 10 movil), ilustrado en la figura 5, con un recinto 50 rodeando el sustrato 10, la placa 40 y la muestra 1. El recinto 50 permite controlar la atmosfera y no solamente confinarla, como con la celula microflmdica sola.

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En un modo de realizacion mas simple (no ilustrado), la placa superior no es movil. Puede ser entonces inutil si el recinto asegura la misma funcion comprendiendo una cubierta 51 adecuada para entrar en contacto con la muestra 1.

El recinto esta asociado, preferiblemente, a un regulador 60 de presion parcial de los componentes del lfquido de la muestra (disolventes y solutos) en la atmosfera.

Por ejemplo, si el disolvente de la muestra es agua, cuando la muestra se vaporiza en los alrededores de la lmea triple, la presion parcial en agua en la atmosfera aumenta. La cinetica del cambio de fase se modifica por lo tanto, puesto que se hace mas diffcil que se evapore el disolvente.

El regulador 60 puede mantener la presion parcial por debajo del valor umbral de la presion de vapor de saturacion del agua. Require entonces una evacuacion de una parte del agua en forma de vapor (segun la flecha F3) para que la muestra pueda continuar evaporandose. La lmea triple T se desplaza entonces de manera controlada, por esta evacuacion, sobre la superficie 20 del sustrato 10.

El regulador 60 puede mantener igualmente la presion parcial por debajo del valor umbral precedente. Se bloquea entonces la evacuacion de agua en forma de vapor, lo que detiene la evaporacion de la muestra. La eleccion de la presion parcial del agua en el recinto regula por tanto la velocidad de desplazamiento de la lmea triple T sobre la superficie 20 del sustrato 10. En el caso de una disolucion que comprenda varios disolventes se puede bloquear, por este mecanismo, la evaporacion de uno de ellos.

El regulador 60 puede acoplarse igualmente a un dispositivo de observacion (no ilustrado) de la lmea triple T para ajustar la velocidad de desplazamiento de la lmea triple al valor deseado sobre la superficie estructurada del sustrato, por la eleccion de la presion parcial.

Asf, regulando la presion parcial de la atmosfera, es posible actuar sobre la velocidad de desplazamiento de la lmea triple sobre el sustrato. Al hacerlo, se optimiza la retencion de los analitos por la superficie estructurada 20 del sustrato 10.

El regulador 60 puede controlar igualmente la temperatura de la atmosfera o crear un gradiente sobre el sustrato.

Un dispositivo de aspiracion o de insuflado de gas, integrado en la placa tambien puede controlar la velocidad de desplazamiento de la lmea triple por evacuacion mas rapida de la capa lfmite de evaporacion (evacuacion de las moleculas de disolvente vaporizadas).

Asf es posible forzar, por capilaridad y accion de fuerzas espedficas, la captura de microobjetos (celulas, bacterias...), de nanoobjetos (nanopartmulas, moleculas espedficas tales como medicamentos o pesticidas), biomoleculas (ADN, protemas...) o incluso virus, esporas, etc.

El procedimiento segun la invencion puede comprender, previamente a la etapa c) de analisis de la superficie, una o varias etapas suplementarias de diferenciacion espedfica de los analitos retenidos, aplicando el sustrato obtenido al termino de la etapa b) sobre una o varias superficies prefuncionalizadas. Es posible entonces extraer del sustrato los analitos objetivo, espedficos, de la superficie prefuncionalizada utilizada. Despues, la superficie asf obtenida se analiza conforme a la etapa c) precitada. Esta etapa de diferenciacion espedfica de los analitos retenidos se ilustra en las figuras 7a a 7f.

La figura 7a ilustra un sustrato 10 obtenido al termino de la etapa b). Se han capturado tres tipos de analitos 2a, 2b y 2c por la superficie funcionalizada 20 del sustrato 10.

La superficie 20 del sustrato 10 se aplica, en el sentido de la fecha F4, contra un sustrato 10a, provisto de una superficie funcionalizada 20a susceptible de fijar espedficamente los analitos 2a (figuras 7b y 7c).

Despues, se retira el sustrato 10 del sustrato 10a, en el sentido de la fecha F5. El sustrato 10a retira pues los analitos 2a de la superficie 20 del sustrato 10 (figura 7d).

La operacion se renueva con un sustrato 10b, provisto de una superficie funcionalizada 20b susceptible de fijar espedficamente los analitos 2b.

La superficie 20 del sustrato 10, obtenido al termino de la etapa de diferenciacion espedfica ilustrada en las figuras 7b a 7d, se aplica contra el sustrato 10b (figura 7e).

Despues, se retira el sustrato 10 del sustrato 10b en el sentido de la fecha F5. El sustrato 10b retira pues los analitos 2b de la superficie 20 del sustrato 10 que no comprende mas que los analitos 2c.

Finalmente, la superficie de los sustratos 10, 10a y 10b asf obtenidos se analiza conforme a la etapa c) precitada.

La funcionalizacion de las superficies 20a-20b debe adaptarse para que la fuerza de transferencia, es decir, de atraccion de la superficie 20a-20b sea superior a la de la retencion de los analitos 2a-2b en los motivos de la

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superficie 20 del sustrato 10. Ventajosamente, se utilizan, para el sustrato 10, sustratos con energfa de superficie mas reducida, como PDMS, que las superficies 20a y 20b.

Esta etapa o etapas suplementarias de diferenciacion espedfica de los analitos retenidos permiten un analisis automatico y espedfico de cada tipo de analitos.

La figura 8 representa la superficie estructurada del sustrato de deteccion de analitos despues de la aplicacion del procedimiento segun la invencion. Sobre esta figura, las nanopartfculas 2, de 100 nm de diametro, son retenidas en cavidades espaciadas 2 pm sobre la superficie estructurada 20 de un sustrato 10, transferidas despues sobre un sustrato 10a de vidrio.

El procedimiento segun la invencion puede aplicarse a numerosos sectores industriales. Mas en particular:

- nano-toxicologfa (es decir, la deteccion de nanoobjetos generados artificialmente por el hombre y que dispersa en el medio ambiente): deteccion de moleculas espedficas (pesticidas, medicamentos, detergentes...), nanopartfculas o productos de combustion (cenizas, dioxinas ...); permite estudiar, eventualmente, sus efectos perjudiciales.

- nanobiomedicina, es decir, analisis medico, desarrollo de micro y nanotecnicas adaptadas a la deteccion cada vez mas precoz de anormalidades biologicas (ADN, protemas, etc.), deteccion de virus o bacterias, utilizacion de nanopartfculas como “vector” de analisis, estudio de medios favorables o desfavorables para la multiplicacion de virus y bacterias, etc.

- farmacologfa para el cribado de medicamentos.

- nanoseguridad por deteccion ultrasensible de esporas, virus, bacterias, etc.

- tratamiento de superficies y en particular la recuperacion de sus defectos superficiales.

Segun otros modos de realizacion:

• La funcionalizacion de la superficie del sustrato puede comprender:

- funcionalizacion global de la superficie muy hidrofila, denominada “ensamblaje convectivo”, para obtener un ensamblaje compacto de los analitos sobre la superficie;

- La fabricacion de motivos topograficos de diferentes diametros (para clasificar los nanoobjetos por tamano), de diferentes alturas (para permitir recuperar los objetivos interesantes por amortiguacion sobre otro sustrato), de diferentes pasos y geometnas de configuracion (para densificar y/o aprovechar mejor las tecnicas de lectura global);

- La fabricacion de motivos sonda por contrastes qmmicos favoreciendo interacciones con objetivos de tipo enlace covalente (tipo tiol) y/o hidrogeno y o de Van Der Waals (radical carbonado), enlace amino, enlace ionico por interaccion dipolo/dipolo y/o desfavoreciendo, en los intervalos entre motivos, estas interacciones (por contrastes qmmicos de tipo octadeciltrimetoxisilano (OTS), aminopropiltrimetoxisilano (APTES), etc., por contrastes hidrofilos/ hidrofobos-solvofilos//solvofobos);

- La fabricacion de motivos sonda por contrastes biologicos de tipo biotina, estreptavidina, polietilenglicol, etc.;

- La utilizacion de una qmmica de superficie pasivante (como OTS, PEG - Polietilenglicol - o BSA - Albumina de Suero Bovino -, etc.) de ciertas zonas para impedir la retencion de anticuerpos, peptidos y ADN entre motivos;

- La inyeccion localizada de cargas positivas o negativas para retener analitos polarizados o polarizables;

- La utilizacion de trampas magneticas como nanopartfculas esfericas de bastoncillos, cintas, toros y o sus apilamientos;

- La combinacion de dos o varios de los procedimientos precedentes;

- La utilizacion de sustratos de objetivos de materiales diferentes como vidrio, silicio, oxido de silicio, PDMS (polidimetilsiloxano), ITO - oxido de indio y titanio - una fuerte o una debil energfa superficial cuyas propiedades opticas como la reflectividad preparan el recuento;

- La utilizacion de sustratos con una superficie diferente de 4 mm2 y que comprenden un numero de sitios de retencion diferente de 106.

• La disolucion madre puede elegirse entre:

- Disoluciones coloidales naturales de objetivos;

- Disoluciones a base de agua;

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- Disoluciones a base de disolventes de diferente naturaleza: organica, eter, acetona, cloroformo, octano, heptano, nonano, decano, tricloretileno;

- Muestras de sueros, sangre, organos biologicos;

- Disoluciones de solidos en un disolvente adecuado;

- Recuperaciones y preconcentraciones, por acumulacion en un disolvente adaptado, de analitos presentes en el aire, en aerosoles o en cualquier medio complejo,

- Disoluciones en las que la retencion objetivo/sonda buscada ya se ha efectuado, pudiendo estar soportadas las sondas (hechas sustrato previamente) por nanopartmulas con codigo de barras integrado (definido por cajas cuanticas) definido por el color, la fluorescencia, etc.;

- Objetivos marcados por marcadores fluorescentes;

- Disolucion compleja.

- Disoluciones preacondicionadas por filtracion, por eliminacion de objetivos inutiles.

• La introduccion de tensioactivos en la disolucion madre (triton X, etc.) y disolventes (lo que tambien es un preacondicionamiento) para facilitar el ensamblaje;

• La introduccion, en la disolucion madre, de un objetivo de calibracion con concentracion y comportamiento conocidos para permitir determinar concentraciones relativas.

• El deposito de la muestra de disolucion madre sobre el sustrato puede aprovechar:

- o el caracter humectante (hidrofilo para el agua, solvofilo para un disolvente) del sustrato para expandir la gota depositada, o al contrario un caracter humectante/deshumectante intermedio (parcialmente hidrofobo para el agua) para limitar su expansion fuera de la zona estructurada sobre el sustrato.

- El deposito de una placa superior sobre la gota que tiene como objetivo definir una capa de lfquido de espesor controlado e impedir la evaporacion de disolvente fuera de la lmea triple.

- Esta placa superior puede ser funcionalizada no humectante (mas hidrofoba para el agua que el sustrato) con el fin de forzar (obtener) de manera natural el desplazamiento de la lmea triple;

- Esta placa puede esta ligeramente inclinada para definir una lmea triple de evaporacion casi rectilmea, para formar un menisco bien definido en su extremidad y minimizar la superficie de contacto con el aire.

- Esta placa superior puede ser estructurada

• La etapa b) de evaporacion controlada puede aprovechar:

- una evaporacion natural mas eficaz en el nivel de la lmea triple que en el resto del volumen de la gota, y que concentra, gracias a corrientes de conveccion, los analitos en esta lmea; esta evaporacion natural puede ser controlada aplicando un gradiente de temperatura entre la lmea triple y el resto de la gota;

- evaporacion forzada del disolvente en los alrededores de esta lmea triple por una reduccion local de la presion parcial del disolvente (bombeo), una evacuacion mas rapida de la capa lfmite evaporada (por un flujo gaseoso) o aspiracion, calentamiento, iluminacion laser, calentamiento de la parte correspondiente del sustrato que crea un gradiente de temperatura sobre el sustrato, etc.;

- deposito de una placa en contacto con la gota de lfquido que encierra este entre el sustrato y la placa, lo que limita y confina la evaporacion en la region proxima a la lmea triple;

• La etapa b) de evaporacion controlada puede utilizarse para:

- primero unir las sondas, renovadas despues para unir los objetivos sobre estas sondas;

- extraer micro o nanogotas de disolucion por desplazamiento rapido de la lmea triple y retener asf las configuraciones de los analitos o realizar micronanomuestreos o micronanolaboratorios

• un dispositivo de seguimiento del desplazamiento de la lmea triple puede integrarse para permitir automatizar el deposito de la muestra lfquida sobre el sustrato, gracias a una electronica de contrarreaccion acoplada a un analisis de imagen;

• el sustrato puede ser de un primer material y estar recubierto, totalmente o parcialmente, de capas estructuradas

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de captura de materiales diferentes.

• el sistema de deteccion de analitos puede comprender, ademas, canales de bombeo y/o de inyeccion de un flujo de gas. En particular, en los modos de realizacion ilustrados en las figuras 3 a 6, la placa 40 puede soportar estos canales de bombeo y/o de inyeccion de un flujo de gas;

• la disolucion madre puede ser una disolucion coloidal, una disolucion que integre tensioactivos y objetivos de calibracion, una disolucion que integre los objetivos marcados por fluorescencia o una disolucion que integre acoplamientos objetivos-sondas ya realizados en disolucion. En este ultimo caso, la superficie estructurada del sustrato 10 puede elegirse para fijar preferentemente o sucesivamente la sonda, el objetivo o el conjunto;

• la disolucion madre y/o la muestra pueden comprender varios disolventes.

Una de las caractensticas prominentes de esta invencion es controlar la evaporacion de un disolvente en los alrededores de la lmea triple que concentra de manera natural los analitos objetivo, buscados, sobre esta lmea en una organizacion compacta. Este fenomeno de concentracion procede de la generacion de corrientes de conveccion en el lfquido que se evapora, cuya funcion es aportar energfa termica (o calor latente) necesario para la vaporizacion. La utilizacion de una evaporacion controlada de la muestra, depositada sobre una superficie estructurada, permite analisis por tamano o por propiedades qmmicas, biologicas, electrostaticas, electricas y/o magneticas de los analitos.

Otra caractenstica prominente consiste en alcanzar un lfmite de deteccion muy bajo efectuando el muestreo sobre un gran numero de sitios sonda de recepcion de funciones o selectivos ocupando una superficie muy pequena. La invencion se adapta por tanto al analisis de muestras de unas centesimas de microlitro.

Ademas, la organizacion de sondas permite aprovechar tecnicas de deteccion automatizadas de la union sonda- objetivo. La invencion permite obtener asf un motivo definido de los sitios ocupados y no ocupados por los analitos buscados y un recuento simple y automatizable.

La invencion propone por tanto un laboratorio sobre microchip que acelera y reduce los costes de los analisis y que permite numerosos analisis en paralelo.

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos objeto de interes (2) en una muestra (1) de Ifquido obtenida a partir de una disolucion madre, teniendo dicha disolucion madre una concentracion desconocida de analitos para determinar, siendo el Ifquido adecuado para evaporarse en una atmosfera (Atm) en condiciones determinadas de evaporacion, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes:

   b1) depositar la muestra (1) sobre un sustrato (10) que presente una superficie (20) micro o nanoestructurada definiendo sondas de captura de analitos, para que la muestra lfquida recubra al menos parcialmente la superficie estructurada del sustrato;

   b2) depositar una placa (40) funcionalizada y/o estructurada en contacto con la muestra lfquida (1), para encerrarlo entre el sustrato (10) y la placa 40.

   c) provocar una evaporacion controlada (5) de la muestra en los alrededores (Vt) de una lmea triple (T) lfquido/sustrato/atmosfera, constituida por la interfase entre el lfquido de la muestra, la atmosfera y el sustrato, de tal manera que esta lmea triple se desplace, a una velocidad controlada, sobre la superficie estructurada del sustrato, a medida que el lfquido se evapore a la atmosfera, y que los analitos objetivo sean capturados, por ensamblaje convectivo y capilar dirigido hacia las sondas;

   d) analizar la superficie estructurada del sustrato obtenido al termino de la etapa c).
2. 2. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun la reivindicacion 1, en el que la etapa d) se aplica contando los analitos capturados en la etapa c) por la superficie micro o nanoestructurada del sustrato y comparando el numero de analitos objetivo, capturados, en una tabla de conversion, para obtener la concentracion de analitos en la disolucion madre.
3. 3. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos, relativo, segun la reivindicacion 1, en el que la etapa d) se aplica contando los analitos capturados en la etapa c), comprendiendo estos analitos los analitos de referencia cuya concentracion es conocida y los analitos de interes cuya concentracion es desconocida pero proporcional a la de los analitos de referencia y comparando las proporciones de los analitos de referencia y de los analitos de interes.
4. 4. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones precedentes, en el que la placa (40) y el sustrato (10) se desplazan uno con respecto al otro segun una direccion de traslacion (F2a-F2b) casi paralela al sustrato, durante la evaporacion controlada de la muestra.
5. 5. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones precedentes, en el que el sustrato y la muestra son confinados en un recinto (50) con atmosfera controlada.
6. 6. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun la reivindicacion 5, en el que durante la etapa c), se regula la presion parcial de los componentes del lfquido en atmosfera controlada.
7. 7. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa c) se aplica aportando una cantidad de energfa suficiente para provocar y controlar la evaporacion del lfquido al nivel de la lmea triple.
8. 8. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una etapa a) de preacondicionamiento de la disolucion madre.
9. 9. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun la reivindicacion 8, en el que el

   preacondicionamiento de la disolucion madre consiste en eliminar de la disolucion madre los analitos inutiles, anadir nuevos analitos objetivo y/o anadir disolventes o nuevas moleculas que favorezcan el ensamblaje convectivo y capilar sobre la superficie estructurada.
10. 10. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun una cualquiera de las reivindicaciones

    precedentes, que comprende una etapa previa de preparacion de la superficie estructurada que consiste en depositar una gota de lfquido que comprende moleculas sonda, espedficas de los analitos objetivo, sobre la superficie (20) del sustrato (10), para que la gota recubra al menos parcialmente la superficie del sustrato, para provocar despues una evaporacion controlada de la gota en los alrededores (VT) de una lmea triple (T)

    gota/sustrato/atmosfera, de tal manera que esta lmea triple se desplace, a una velocidad controlada, sobre la superficie estructurada del sustrato, a medida que el lfquido se evapore a la atmosfera y que las moleculas sonda se fijen sobre la superficie del sustrato para crear una red de sondas que estructure la superficie del sustrato.
11. 11. Procedimiento de deteccion y cuantificacion de analitos segun una cualquiera de las reivindicaciones

    precedentes, que comprende una etapa intermedia entre la etapa c) y la etapa d), de fijacion de fluoroforos sobre los analitos objetivo, capturados, para permitir un recuento por fluorimetna durante la etapa d);
12. 12. Procedimiento de deteccion y cuantificacion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende, ademas, entre la etapa c) y la etapa d), al menos una etapa de diferenciacion espedfica de los analitos

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    retenidos (2a, 2b) en la etapa c), aplicando el sustrato (10) obtenido al termino de la etapa c) en una o varias superficies (20a, 20b) de captura funcionalizadas.
13. 13. Procedimiento de deteccion y cuantificacion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, durante la etapa c), la evaporacion se controla de tal manera que la lmea triple (T) se desplace a velocidad constante.
14. 14. Procedimiento de deteccion y cuantificacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que, durante la etapa c), la evaporacion se controla de tal manera que la lmea triple (T) se desplace a velocidad variable.
15. 15. Procedimiento de deteccion y cuantificacion segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las sondas de la superficie (20) definen, cada una, una red que presenta un espectro optico, aplicandose la etapa d) analizando el espectro optico de cada red despues de la captura de los analitos en la etapa c).
16. 16. Procedimiento de deteccion y cuantificacion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las sondas de la superficie (20) son cavidades de diferentes tamanos, terminando la etapa c) en la captura de los analitos objetivo en micro o nanogotas de diferentes tamanos, retenidas en las cavidades de diferentes tamanos y aplicandose la etapa d) midiendo variaciones de intensidad de al menos una propiedad ffsica o qmmica de cada micro o nanogota, determinando el volumen de la micro o nanogota « lfmite » que no comprende ningun analito, siendo la concentracion del analito en la disolucion madre igual a 1 dividido por el volumen de micro o nanogota lfmite.
17. 17. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos para la aplicacion del procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende:

    - un sustrato (10) que presenta una superficie estructurada destinada a recibir una muestra de disolucion madre que contiene los analitos de interes;

    - un medio de control (30) de la evaporacion de la disolucion en los alrededores (Vt) de una lmea triple (T) lfquido/sustrato/atmosfera;

    - una placa (40) destinada a ponerse en contacto con la muestra de disolucion para encerrar este entre el sustrato y la placa;

    - un medio de analisis de la superficie micro o nanoestructurada del sustrato, caracterizado por que dicha placa esta funcionalizada y/o estructurada.
18. 18. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun la reivindicacion 17, caracterizado por que la placa (40) es mas hidrofoba que el sustrato (10).
19. 19. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 17 o 18, caracterizado por que consta ademas de uno o varios sustratos (10a, 10b) comprendiendo, cada uno, una superficie funcionalizada (20a, 20b) susceptible de fijar espedficamente los analitos de interes (2a, 2b).
20. 20. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el medio de analisis es adecuado para contar los analitos retenidos por la superficie estructurada del sustrato.
21. 21. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 17 a 20, en el que el medio de analisis es adecuado para comparar el numero de analitos obtenido precedentemente en una tabla de conversion, para obtener la concentracion de analitos en la disolucion madre.
22. 22. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el sustrato (10) y la placa (40) se montan moviles y casi paralelos uno con respecto al otro segun una direccion de traslacion (F2a-F2b).
23. 23. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el sustrato (10) y la placa (40) se montan moviles uno con respecto al otro segun una direccion de traslacion (F2a-F2b), estando montada la placa (40) inclinada con respecto al sustrato (10) de manera que se aplique la muestra de disolucion sobre el sustrato estructurado.
24. 24. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 17 a 23, en el que la placa (40) es flexible.
25. 25. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 17 a 24, que comprende, ademas, un recinto (50) con atmosfera controlada rodeando el sustrato y la muestra.
26. 26. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun la reivindicacion 25, en el que el recinto comprende un regulador (60) de presion parcial de los componentes del lfquido en la atmosfera.
27. 27. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 25 o 26, que comprende, ademas, canales de bombeo y/o de inyeccion de un flujo de gas o mezcla gaseosa.
28. 28. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, que comprende, ademas, un dispositivo de aporte de energfa, termica y/o electromagnetica.

    5 29. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 28, en el que

    el medio de control (30) se acopla a al menos un dispositivo de observacion de la lmea triple (T) para adaptar el control de la evaporacion y ajustar la velocidad de desplazamiento de la lmea triple, a al menos un valor deseado, sobre la superficie estructurada del sustrato.
29. 30. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una de las reivindicaciones 26 a 29, en el que el 10 regulador de presion parcial (60) se acopla a al menos un dispositivo de observacion de la lmea triple (T) para

    adaptar las presiones parciales de los componentes del lfquido en la atmosfera y ajustar la velocidad de desplazamiento de la lmea triple (T), a al menos un valor deseado.
30. 31. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 30, en el que la superficie del sustrato comprende una estructura adoptada entre estructuras topograficas, biologicas, qmmicas,

    15 electrostaticas, magneticas o una combinacion de estas estructuras.
31. 32. Sistema de deteccion y cuantificacion de analitos segun una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 31, en el que la disolucion madre es una disolucion coloidal, una disolucion preacondicionada, una disolucion prefiltrada, una disolucion que comprende tensioactivos y objetivos de calibracion, una disolucion que integra los objetivos marcados por el color, por fluorescencia o por un codigo de barras integrado o una disolucion que integra acoplamientos

    20 objetivos-sondas ya realizados en las disoluciones.