BR112016009958B1 - Dispositivo microfluídico, método, sistema e kit - Google Patents

Abstract

dispositivos microfluídicos e métodos para sua produção e utilização. a presente invenção refere-se a métodos e sistemas para análise de uma amostra. um dispositivo microfluídico para executar uma análise de uma amostra (por exemplo, amostra biológica) é descrito tendo um local de aplicação da amostra, um componente poroso e um canal de fluxo. o componente poroso fornece a dissolução uniforme de um reagente e mistura uniforme da amostra e do reagente sem filtração da amostra.

Description

[001] Este pedido está relacionado com o Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N°. de Série 61/900,590, depositado em 6 de novembro, 2013, sendo a divulgação de tal aplicação incorporada aqui por referência.

INTRODUÇÃO

[002] O diagnóstico laboratorial remoto inclui os passos de ob tenção de uma amostra biológica de um sujeito, a realização de análises da amostra para determinar a presença ou concentração de um ou mais analitos alvo e fornecer um diagnóstico ao sujeito em uma única localização. O diagnóstico laboratorial remoto fornece resultados mais rápidos e muitas vezes menos dispendiosos para o sujeito do que o teste de diagnóstico que exige a obtenção de uma amostra em um local e realização da análise da amostra em um local diferente.

[003] O diagnóstico rápido de doenças infecciosas de uma única gota de sangue usando uma tecnologia de baixo custo e fácil disponível no ponto de atendimento iria melhorar muito as iniciativas globais de saúde. A citometria de fluxo baseada em imunoensaios de micro- partículas fornece excelente precisão e multiplexação, mas é inadequada para contextos laboratoriais remotos devido à preparação complexa da amostra e instrumentação dispendiosa. Tendo em consideração o referido, vários campos da medicina e biotecnologia avançariam significativamente com a disponibilidade de técnicas capazes de serem usadas em contexto laboratorial remoto, permitindo medições fáceis e flexíveis de marcadores celulares, particularmente em fluidos biológicos, tal como sangue.

SUMÁRIO

[004] Aspectos da presente invenção incluem um dispositivo mi- crofluídico para análise de uma amostra. Os dispositivos microfluídicos de acordo com certas modalidades, incluem um local de aplicação da amostra, um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra e um componente poroso que contém matriz porosa e um reagente de análise posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo. Sistemas e métodos adequados para analisar uma amostra, tal como uma amostra biológica, utilizando os presentes dispositivos microfluídicos também são descritos.

[005] Tal como resumido anteriormente, aspectos da presente divulgação incluem um dispositivo microfluídico para análise de uma amostra tendo um local de aplicação da amostra, um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação e um componente poroso posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo. Em modalidades, o componente poroso inclui uma matriz porosa e um reagente de análise. Em alguns casos, a matriz porosa é de uma frita, tal como uma frita de vidro. Em outros casos, a matriz porosa é uma matriz polimérica. Em algumas modalidades, a matriz porosa é configurada para não ser de filtragem no que diz respeito aos componentes da amostra. Em certos casos, a matriz porosa é configurada para fornecer a mistura do reagente de análise com a amostra que flui através da matriz porosa. A matriz porosa pode ter poros com diâme-tros de entre 1 μm e 200 μm e volumes de poro de entre 1 μL e 25 μL. Por exemplo, o volume de poro pode estar entre 25% e 75% do volume da matriz porosa, tal como entre 40% e 60% do volume da matriz porosa.

[006] O reagente de análise inclui um reagente de ligação a um ou mais componentes da amostra. Em algumas modalidades, o reagente é um membro de ligação específico ao analito. Por exemplo, o membro de ligação específico ao analito pode ser um anticorpo ou fra- gmento de anticorpo. Em certos casos, o membro de ligação específico ao analito é um anticorpo que se liga especificamente a um composto, tal como CD14, CD4, CD45RA, CD3 ou uma sua combinação. Em algumas modalidades, o membro de ligação específico ao analito é ligado a um marcador detectável, tal como um marcador detectável opticamente. Por exemplo, o marcador detectável opticamente pode ser um corante fluorescente, tal como de rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, boro diflúor-dipirrometeno, naftalimida, fi- cobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina ou uma sua combinação. Em certos casos, o corante é ficoeritrina (PE), Ficoeritrina - Cianina 5 (PE-Cy5) ou aloficocianina APC. Em algumas modalidades, os tampões incluem albumina de soro bovino (BSA), trealose, polivinil- pirrolidona (PVP) ou ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico ou uma sua combinação. Por exemplo, o tampão pode incluir BSA, trealose e PVP. Os tampões também podem incluir um ou mais agentes quelantes, tal como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido etilenoglicol bis- (beta-aminoetil éter) N,N,N',N'-tetracético (EGTA), ácido 2,3- dimercaptopropano 1-sulfônico (DMPS), e ácido 2,3- dimercaptosuccínico (DMSA). Em certas modalidades, o tampão inclui EDTA. O reagente de análise pode estar presente na matriz porosa como um líquido. Em outros casos, o reagente de análise está seco. Em ainda outros casos, o reagente de análise está liofilizado.

[007] Em algumas modalidades, o canal de fluxo é configurado para receber uma amostra com um volume variando de 1 mL a 1000 mL. Em certos casos, o canal de fluxo é um canal capilar configurada para transportar a amostra através do canal de fluxo, por ação capilar. Em certas modalidades, o canal de fluxo inclui uma ou mais paredes opticamente transmissivas. Em um exemplo, o canal de fluxo é opti- camente transmissivo à luz ultravioleta. Em outro exemplo, o canal de fluxo é opticamente transmissivo à luz visível. Em ainda outro exem- plo, o canal de fluxo é opticamente transmissivo à luz próxima de in-fravermelho. Em ainda outro exemplo, o canal de fluxo é transmissivo à luz ultravioleta e luz visível. Em ainda outro exemplo, o canal de fluxo é transmissivo à luz visível e a luz próxima de infravermelho. Em ainda outro exemplo, o canal de fluxo é transmissivo à luz ultravioleta, a luz visível e na luz próxima de infravermelho.

[008] Os dispositivos microfluídicos de acordo com certas moda lidades incluem uma frita porosa que contém microcanais que definem uma trajetória tortuosa que tem um comprimento suficiente para a mistura de um reagente e uma amostra. O volume do poro pode ser de 40 a 60% do volume total da frita porosa, tal como 2 μL ou mais, tal como 5 μL, 10 μL e incluindo 20 μL ou mais. Em algumas modalidades os microcanais fornecem o fluxo através de substancialmente todos os componentes da amostra. Em algumas modalidades os microcanais têm uma média de diâmetro através dos poros entre 5 μm e 200 μm tal como entre 5 μm e 60 μm ou entre 30 μm e 60 μm.

[009] A mistura de análise inclui um reagente e tampão. Em al guns casos, a mistura de análise prevê a dissolução substancialmente uniforme do reagente na amostra durante um período de tempo prede-terminado. O período de tempo predeterminado pode estar compreendido entre 5 segundos e 5 minutos, tal como entre 20 segundos e 3 minutos, ou entre 50 segundos e 2 minutos. Em algumas modalidades, os componentes do tampão incluem albumina de soro bovino (BSA), trealose e polivinilpirrolidona (PVP). A razão em peso de BSA:Trealose:PVP pode ser de 21:90:1. O peso total dos componentes do tampão pode estar compreendido entre 0,01 g/μL e 2 g/μL do volume de poros da matriz porosa. Em algumas modalidades os componentes do tampão incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Em certas modalidades, os componentes do tampão compreendem ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES). Em alguns casos, o rea- gente inclui um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpo conjugados com um marcador detectável. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ligar-se a um alvo, tal como um alvo selecionado de CD14, CD4, CD45RA, CD3 ou uma sua combinação. Em alguns casos, o marcador detectável é um corante fluorescente. Por exemplo, o corante pode ser um composto tal como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, boro diflúor-dipirrometeno, naftalimida, fi- cobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina, seus conjugados, e suas combinações. Em algumas modalidades corante pode ser ficoeritri- na (PE), Ficoeritrina -Cianina 5 (PE-Cy5) ou aloficocianina APC. Em modalidades da presente invenção, a mistura de análise pode incluir enzimas, substratos, catalisadores, ácidos nucleicos ou uma sua combinação. Em certos casos, os dispositivos microfluídicos podem ainda incluir uma amostra biológica tal como sangue, urina, saliva ou uma amostra de tecido.

[0010] Aspectos da presente invenção também incluem um méto do para analisar uma amostra para um analito, onde o método inclui o contato de uma amostra com um local de aplicação da amostra de um dispositivo microfluídico com um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra e um componente poroso posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo, iluminar a amostra no canal de fluxo com uma fonte de luz e a detectar a luz da amostra para determinar a presença ou concentração de um ou mais componentes na amostra.

[0011] Em algumas modalidades, a amostra se mistura com um reagente de análise presente na matriz porosa do componente poroso pelo movimento da amostra através da matriz porosa. O movimento da amostra através da matriz porosa é, em certas modalidades, de não filtragem com respeito aos componentes da amostra. Em algumas modalidades, o canal de fluxo é um canal capilar e a amostra é movida através da matriz porosa por ação capilar. A mistura da amostra com o reagente de análise pode incluir marcar um ou mais componentes da amostra com um marcador detectável. Em alguns casos, a marcação inclui colocar em contato um ou mais componentes da amostra com um membro de ligação específica ao analito, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em certos casos, o membro de ligação específica ao analito é um anticorpo que se liga especificamente a um composto, tal como CD14, CD4, CD45RA, CD3 ou uma sua combinação. Em algumas modalidades, o membro de ligação específica ao analito é acoplado a um marcador detectável, tal como um marcador opticamente detectável. Exemplos de marcadores detectáveis optica- mente incluem corantes fluorescentes tais como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, boro diflúor-dipirrometeno, nafta- limida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina, seus conjugados, e suas combinações. Em algumas modalidades, corante é ficoeri- trina (PE), Ficoeritrina -Cianina 5 (PE-Cy5) ou aloficocianina APC.

[0012] Os métodos de acordo com algumas modalidades incluem a iluminar a amostra no canal de fluxo com uma fonte de luz de espectro largo. Em algumas modalidades, a fonte de luz de espectro largo é uma fonte de luz ultravioleta, uma fonte de luz visível ou uma fonte de luz de infravermelho, ou uma sua combinação. Em certas modalidades, a amostra é iluminada com luz com um comprimento de onda entre 200 nm e 800 nm.

[0013] Em algumas modalidades, os métodos incluem a detecção de luz da amostra no canal de fluxo. A luz detectada da amostra pode incluir fluorescência, luz transmitida, luz difusa ou uma sua combinação. Em alguns casos, os métodos de detecção incluem fluorescência da amostra. Em certos casos, a detecção de luz da amostra inclui a captura de uma imagem da amostra no canal de fluxo.

[0014] Os métodos para analisar uma amostra, tal como uma amostra biológica, com os dispositivos microfluídicos em causa também são fornecidos. Em algumas modalidades, os métodos incluem a aplicação de uma amostra de líquido em um local de aplicação da amostra que está em comunicação de fluido com um elemento poroso e um canal capilar, dirigindo o fluxo da amostra do local de aplicação da amostra, através do elemento poroso, para o canal capilar. O canal capilar pode incluir uma parede opticamente transmissiva e o elemento poroso compreende pelo menos um reagente opticamente ativo e um ou mais componentes do tampão.

[0015] Os métodos podem ainda incluir dissolver o reagente na amostra onde a dissolução do reagente é substancialmente constante ao longo de um período de tempo predeterminado, tal como entre 5 segundos e 5 minutos, ou entre 20 segundos e 3 minutos ou entre 1 minuto e 2 minutos. Em algumas modalidades, a mistura da amostra e do reagente é feita em uma frita porosa que fornece uma série de mi- crocanais que definem uma trajetória tortuosa que tem um comprimento suficiente para misturar a amostra e o reagente. A mistura pode facilitar a ligação do reagente a um ou mais componentes da amostra e é seguida por avaliar opticamente a amostra através da parede optica- mente transmissiva. A mistura pode ser passiva (difusora), por convecção, ativa ou qualquer sua combinação. A amostra pode fluir por uma força de ação capilar através do elemento poroso e através do canal capilar. Em certas modalidades, a avaliação óptica inclui a obtenção de uma imagem da amostra através de uma parede transmissi- va, determinar um sinal de fundo que corresponde ao reagente não ligado e amostra e subtrair o sinal de fundo da imagem da amostra. Em algumas modalidades, o sinal de fundo é substancialmente constante (varia por 75% ou menos, tal como por 50%) ao longo da parede transmissiva. Em alguns casos, a amostra flui através do elemento poroso substancialmente não filtrada. Em modalidades, a amostra pode ser uma amostra biológica, tal como sangue, urina, tecidos, saliva ou semelhantes. Em algumas modalidades, o reagente opticamente ativo inclui um anticorpo ou fragmento de anticorpo marcado por fluorescência e fornece a mistura para a formação de um ou mais componentes marcados por fluorescência na amostra biológica.

[0016] Aspectos da presente divulgação também incluem sistemas para praticar os presentes métodos. Sistemas de acordo com certas modalidades, incluem uma fonte de luz, um detector óptico para detectar um ou mais comprimentos de onda de luz e um dispositivo microflu- ídico para análise de uma amostra tendo um local de aplicação da amostra, um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação e um componente poroso posicionado entre o local de aplicação da amostra e canal de fluxo.

DEFINIÇÃO DE TERMINOLOGIA SELECIONADA

[0017] Em geral, os termos aqui utilizados, a não ser que definido de outro modo, têm significados correspondentes à sua utilização con-vencional nos campos relacionados com a invenção, incluindo a química analítica, bioquímica, biologia molecular, biologia celular, micros- copia, análise de imagem, e semelhantes, tal como representado nos seguintes tratados: Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Quarta Edição (Garland, 2002); Nelson e Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, Quarta Edição (W.H. Freeman, 2004); Murphy, Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practical Flow Cytometry, Quarta Edição (Wiley-Liss, 2003); Owens et al. (Editores), Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice: Quality Assurance for Quantitative Immunophenotyping (Wiley-Liss, 1994); Ormerod (Editor) Flow Cytometry: A Practical Approach (Oxford University Press, 2000); e semelhantes.

[0018] "Anticorpo" ou "imunoglobulina" significa uma proteína, na tural ou sinteticamente produzida por meios recombinantes ou quími- cos, que é capaz de se ligar especificamente a um determinado antí- geno ou determinante antigênico. Os anticorpos são normalmente gli- coproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. "Fragmento de anticorpo", e todas as suas variantes gramaticais, tal como utilizadas aqui são definidas como uma porção de um anticorpo intato compreendendo o local de ligação ao antígeno ou região variável do anticorpo intato, onde a porção está livre dos domínios constante da cadeia pesada (isto é, CH2, CH3 e CH4, dependendo do isotipo de anticorpo) da região Fc do anticorpo intato. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, e Fv. O termo "anticorpo monoclonal" (mAb) tal como aqui utilizado se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigênico. Além disso, em contraste com preparações convencionais de anticorpos (policlonais) que incluem normalmente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada mAb é dirigido contra um único determinante no antígeno. Para além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que eles podem ser sintetizados por cultura de Hibridoma, não contaminada por outras imuno- globulinas. Orientação na produção e seleção de anticorpos para utilização em imunoensaios pode ser encontrada em textos e manuais prontamente disponíveis, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, 1988); Howard e Bethell, Basic Methods in Antibody Production and Characterization (CRC Press, 2001); Wild (editor) The Immunoas say Handbook (Stockton Press, Nova Iorque, 1994), e semelhantes.

[0019] "Dispositivo microfluídico" significa um sistema integrado de uma ou mais câmaras, portas e canais que estão interligados e em comunicação de fluido e concebido para a realização de uma reação ou processo analítico, quer por si só ou em cofuncionamento com um dispositivo ou instrumento que fornece funções de suporte, tal como introdução da amostra, meios de condução de fluido e/ou reagente, controle da temperatura, sistemas de detecção, recolha de dados e/ou sistemas de integração, e outros semelhantes. Dispositivos microfluí- dicos podem ainda incluir válvulas, bombas e revestimentos funcionais especializados em paredes interiores, por exemplo, para prevenir a adsorção dos componentes da amostra ou reagentes, facilitar o movimento de reagente por eletrosmose, ou semelhantes. Tais dispositivos são geralmente fabricados em ou como um substrato sólido, o qual pode ser vidro, plástico, ou outros materiais poliméricos sólidos, e normalmente têm um formato planar para facilitar a detecção e monitorização do movimento da amostra e reagente, especialmente através de métodos ópticos ou eletroquímicos. Características de um dispositivo microfluídico normalmente incluem dimensões de seção transversal de menos do que algumas centenas de micrómetros quadrados e passagens têm normalmente dimensões de capilares, por exemplo, com as dimensões transversais máximas de cerca de 500 μm a cerca de 0,1 μm. Dispositivos microfluídicos normalmente têm capacidades de volume no intervalo de 1 μL a menos que uns 10 nL, por exemplo, 10100 nL. A fabricação e funcionamento dos dispositivos microfluídicos são bem conhecidos na técnica, como exemplificado pelas referências seguintes que são incorporadas por referência: Ramsey, Publicação de Patente EUA 6.001.229; 5.858.195; 6.010.607; e 6.033.546; Soane et al., Publicação de Patente EUA 5.126.022 e 6.054.034; Nelson et al., Publicação de Patente EUA 6,613,525; Maher et al., Publicação de Patente EUA 6,399,952; Ricco et al., Publicação de Patente Internacional WO 02/24322; Bjornson et al., Publicação de Patente Internacional WO 99/19717; Wilding et al., Publicação de Patentes EUA 5,587,128; 5,498,392; Sia et al., Electrophoresis, 24: 3563-3576 (2003); Unger et al., Science, 288: 113-116 (2000); Enzelberger et al., Publicação de Patente EUA 6,960,437.

[0020] "Amostra" significa uma quantidade de material de uma ori gem biológica, ambiental, médica, ou do paciente em que a detecção ou medição predeterminada de células, partículas, esferas e/ou analitos é procurada. Uma amostra pode compreender material de fontes naturais ou de fontes artificiais, tal como, culturas de tecidos, culturas de fermentação, biorreatores e semelhantes. As amostras podem compreender animal, incluindo o ser humano, fluido, sólido (por exemplo, fezes) ou tecido, bem como produtos alimentares líquidos e sólidos e rações e ingredientes, tais como produtos lácteos, vegetais, carne e subprodutos de carne, e resíduos. As amostras podem incluir materiais retirados de um paciente, incluindo, mas não limitados a culturas, sangue, saliva, fluido cerebral espinal, fluido pleural, leite, linfa, escarro, sêmen, punção aspirada por agulha, e outros semelhantes. As amostras podem ser obtidas de todas as várias famílias de animais domésticos, bem como animais ferozes ou selvagens, incluindo, mas não limitado a animais tais como ungulados, urso, peixes, roedores, etc. As amostras podem incluir materiais ambientais, tal como matéria de superfície, solo, água e amostras industriais, bem como amostras obtidas de instrumentos de processamento de alimentos e laticínios, aparelhos, equipamentos, utensílios, itens descartáveis e não descartáveis. Estes exemplos não são para ser interpretados como limitando os tipos de amostras aplicáveis à presente invenção. Os termos "amostra", "amostra biológica" e "espécime" são usados alternadamente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0021] A invenção pode ser melhor compreendida da descrição detalhada que se segue quando lida em conjunto com os desenhos anexos. Incluído nos desenhos estão as seguintes figuras:

[0022] Figura 1 mostra uma ilustração de uma vista de topo de um dispositivo microfluídico de acordo com certas modalidades.

[0023] Figura 2A mostra uma ilustração de uma vista de topo de um dispositivo microfluídico de acordo com certas modalidades.

[0024] Figura 2B representa um diagrama esquemático que mos tra a vista lateral de um dispositivo microfluídico de acordo com certas modalidades.

[0025] Figura 3A representa uma ilustração de componentes de detecção de uma amostra no dispositivo microfluídico de acordo com certas modalidades.

[0026] Figura 3B representa uma ilustração de melhoramento de imagem de componentes de uma amostra no dispositivo microfluídico de acordo com certas modalidades.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0027] O dispositivo microfluídico e método para usar o mesmo são descritos. O dispositivo pode incluir um local de aplicação da amostra em comunicação com um componente poroso e um canal de fluxo. As dimensões do dispositivo podem fornecer uma ação capilar a ser a principal força para a transmissão de uma amostra através do elemento poroso e o canal de fluxo. O dispositivo pode ser utilizado para avaliar analitos ou componentes de uma amostra que tenham sido marcados com um marcador detectável. O componente poroso é formado por uma matriz porosa, tal como uma frita e um reagente de análise. O componente poroso pode fornecer uma matriz para o reagente de análise e ter dimensões suficientes para fornecer uma trajetória tortuosa para a mistura da amostra e de um reagente de análise. A mistura pode ser passiva ou por convecção e não necessita de uma força adicional para além da força de capilaridade para fornecer uma amostra que é substancialmente uniformemente misturada com um reagente de análise após a saída da matriz porosa. O reagente de análise pode fornecer a dissolução uniforme de um reagente tal como um marcador detectável na amostra ao longo de um período de tempo definido.

[0028] A prática da presente invenção pode utilizar, salvo indica ção em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), biologia celular, tecnologia de imunoen- saio, microscopia, análise de imagem e química analítica, que estão dentro da competência na técnica. Tais técnicas convencionais incluem, mas não estão limitadas a detecção de sinais fluorescentes, análise de imagem, seleção de fontes de iluminação e componentes de detecção de sinais ópticos, marcação das células biológicas, e semelhantes. Tais técnicas e descrições convencionais podem ser encontradas em manuais de laboratório de referência, tal como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, e Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos de Cold Spring Harbor Laboratory Press); Murphy, Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging (Wiley-Liss, 2001); Shapiro, Practical Flow Cytometry, Quarta Edição (Wiley-Liss, 2003); Herman et al., Fluorescence Microscopy, 2a Edição (Springer, 1998); as divulgações das quais são aqui incorporadas na sua totalidade por referência para todos os fins.

[0029] Antes da presente invenção ser descrita em maior detalhe, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a modalidades particulares descritas, uma vez que tais podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a ser limitativa, uma vez que o âmbito da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0030] Quando é fornecido um intervalo de valores, se entende que cada valor intermediário, ao décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto dite claramente de outro modo, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor indicado ou intermediário no intervalo especificado, está englobado no âmbito da invenção. Os limites superior e inferior destes intervalos menores podem ser independentemente incluídos nos intervalos menores e estão também englobados no âmbito da invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excluindo qualquer um ou ambos desses limites incluídos estão também incluídos na invenção.

[0031] A não ser que definido de outro modo, todos os termos téc nicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos também podem ser utilizados na prática ou análise da presente invenção, métodos e materiais ilustrativos representativos são agora descritos.

[0032] Todas as publicações e patentes citadas nesta especifica ção são aqui incorporadas por referência como se cada publicação individual ou patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência e são aqui incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em ligação com os quais as publicações são citadas. A citação de qualquer publicação é pela sua divulgação antes da data de apresentação e não deve ser interpretada como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de antedatar tal publicação por virtude de invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas reais de publicação que podem necessitar de ser confirmadas independentemente.

[0033] É de notar que, tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem as referências plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. É de notar ainda que as reivindicações podem ser redigidas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta afirmação se destina a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como "exclusivamente", "somente" e semelhantes em conexão com a recitação de elementos de reivindicação, ou a utilização de uma limitação "negativa".

[0034] Como será evidente para os peritos na técnica após a leitu ra desta divulgação, cada uma das modalidades individuais descritas e ilustradas aqui tem componentes e características que podem ser facilmente separadas de ou combinadas com as características de qualquer uma das outras várias modalidades sem se sair do âmbito ou essência da presente invenção. Qualquer método enumerado pode ser realizado na ordem dos eventos enumerados ou em qualquer outra ordem que é logicamente possível.

[0035] Tal como resumido acima, aspectos da presente divulgação incluem um dispositivo microfluídico para análise de uma amostra. Ao descrever adicionalmente mais modalidades da presente descrição, dispositivos microfluídicos de interesse são primeiramente descritos em maior detalhe. De seguida, são descritos os métodos para análise de amostras empregando os dispositivos microfluídicos de objeto. São descritos sistemas adequados para praticar os referidos métodos de análise de uma amostra para um analito. Os kits são também fornecidos.

DISPOSITIVOS MICROFLUÍDICOS

[0036] Tal como resumido acima, aspectos da presente invenção incluem um dispositivo microfluídico para análise de uma amostra para um ou mais analitos. O termo "análise" é aqui utilizado no seu sentido convencional para se referir a avaliar qualitativamente a presença ou medir quantitativamente uma quantidade de uma espécie de analito alvo na amostra. Tal como descrito em maior detalhe abaixo, uma variedade de diferentes amostras pode ser testada com o dispositivo micro- fluídico em causa. Em alguns casos, a amostra é uma amostra biológica. O termo "amostra biológica" é utilizado no seu sentido convencional para incluir um organismo inteiro, plantas, fungos ou um subconjunto de tecidos animais, células ou partes componentes que podem, em certos casos, ser encontradas no sangue, muco, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cerebrospinal, saliva, lavado broncoalveolar, líquido amniótico, sangue do cordão amniótico, urina, fluido vaginal e sêmen. Como tal, uma "amostra biológica" se refere tanto ao organismo nativo como a um subconjunto dos seus tecidos, bem como a um homogeneizado, lisado ou extrato preparado do organismo ou um subconjunto dos seus tecidos, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, plasma, soro, fluido espinal, fluido linfático, seções de pele, trato respiratório, gastrointestinal, cardiovascular, e geniturinário, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, tumores, órgãos. As amostras biológicas podem ser qualquer tipo de tecido de organismos, incluindo tanto tecido normal como doente (por exemplo, canceroso, maligno, necrótico, etc.). Em certas modalidades, a amostra biológica é uma amostra líquida, tal como sangue total ou seus derivados, por exemplo, plasma, lágrimas, urina, sémen, etc., onde em alguns casos a amostra é uma amostra de sangue, incluindo sangue total, tal como sangue obtido de punção venosa ou picada no dedo (em que o sangue pode ou não ser combinado com quaisquer reagentes antes do ensaio, tais como conservantes, anticoagulantes, etc.).

[0037] Em certas modalidades a fonte da amostra é um "mamífe- ro", onde este termo é utilizado de forma ampla para descrever organismos que se encontram dentro classe Mammalia, incluindo a ordem carnívora (por exemplo, cães e gatos), Rodentia (por exemplo, ratinhos, porquinhos da índia, e ratos), e primatas (por exemplo, seres humanos, chimpanzés e macacos). Em alguns casos, os sujeitos são seres humanos. As amostras biológicas de interesse podem ser obtidas de sujeitos humanos de ambos os sexos e em qualquer fase de desenvolvimento (isto é, neonatos, infantil, juvenil, adolescente, adulto), em que em certas modalidades o sujeito humano é um jovem, adolescente ou adulto. Embora a presente divulgação possa ser aplicada a amostras provenientes de um sujeito humano, é para ser entendido que os métodos podem também ser realizados em amostras provenientes de outros sujeitos animais não humanos, tais como, mas não se limitando a, pássaros, ratinhos, ratos, cães, gatos, gado e cavalos.

[0038] Em modalidades da presente invenção, os dispositivos mi- crofluídicos incluem um local de aplicação da amostra, um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra e um componente poroso que contém uma matriz porosa e um reagente de análise posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo. O local de aplicação da amostra do dispositivo microfluídico é uma estrutura configurada para receber uma amostra que tem um volume que varia de 5 μL a 1000 μL, tal como de 10 μL a 900 μL, tal como de 15 μL a 800 μL, tal como de 20 μL a 700 μL, tal como de 25 μL a 600 μL, tal como de 30 μL a 500 μL, tal como de 40 μL a 400 μL, tal como de 50 μL a 300 μL e incluindo de 75 μL a 250 μL. O local de aplicação da amostra pode ser de qualquer forma conveniente, desde que forneça o acesso de fluido, quer diretamente ou através de um componente intermediário que fornece a comunicação de fluidos, para o canal de fluxo. Em algumas modalidades, o local de aplicação da amostra é plano. Em outras modalidades, o local de aplicação da amostra é côncavo, tal como na forma de um cone invertido que termina no orifício de entrada da amostra. Dependendo da quantidade de amostra aplicada e a forma do local de aplicação da amostra, o local de aplicação da amostra pode ter uma área de superfície que varia de 0,01 mm2 a 1000 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 900 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 800 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 700 mm2, tal como de 1 mm2 a 600 mm2, tal como de 2 mm2 a 500 mm2, e incluindo de 5 mm2 a 250 mm2.

[0039] A entrada do dispositivo microfluídico está em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra e canal de fluxo e pode ser de qualquer forma adequada, em que formas de seção transversal de entrada de interesse incluem, mas não estão limitadas a: formas retilíneas em seção transversal, por exemplo, quadrados, retângulos, trapézios, triângulos, hexágonos, etc., formas curvilíneas em seção transversal, por exemplo, circular, oval, etc., como bem como formas irregulares, por exemplo, uma porção de fundo parabólico acoplada a uma porção superior plana, etc. As dimensões do orifício do bocal podem variar, em algumas modalidades oscilando de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluindo de 5 mm a 25 mm. Em algumas modalidades, a entrada é um orifício circular e o diâmetro da entrada varia de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm, e incluindo de 5 mm a 25 mm. Logo, dependendo da forma da entrada, a amostra orifício de entrada pode ter uma abertura que varia, oscilando de 0,01 mm2 a 250 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 200 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 150 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 100 mm2, tal como de 1 mm2 a 75 mm2, tal como de 2 mm2 a 50 mm2 e incluindo de 5 mm2 a 25 mm2.

[0040] Em modalidades, a entrada da amostra está em comunica ção de fluido com um componente poroso que contém uma matriz porosa e um reagente de análise posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo. Por "matriz porosa" se entende um substrato que contém uma ou mais estruturas de poros configuradas para a permeação dos componentes líquidos através destas. Em algumas modalidades, a matriz porosa contém uma rede de poros interligados que fornece um meio para a mistura de uma amostra aplicada (por exemplo, uma amostra biológica como discutido em maior detalha abaixo) com um reagente de análise presente na matriz porosa. Em outras modalidades, a matriz porosa contém uma rede de poros inter-ligados que é de não filtragem para a amostra. Por "não filtragem" se entende que a rede de poros interligados não restringe substancialmente a passagem de componentes da amostra através da matriz porosa (isto é, para o canal de fluxo), tal como onde a passagem de 1% ou menos dos componentes da amostra é restrita pelos poros da matriz porosa, tal como 0,9% ou menos, tal como 0,8% ou menos, tal como 0,7% ou menos, tal como 0,5% ou menos, tal como 0,1% ou menos, tal como 0,05% ou menos, tal como 0,01% ou menos, tal como 0,001% ou menos, e incluindo onde 0,0001% ou menos dos compo-nentes da amostra são restritos pelos poros da matriz porosa. Em outras palavras, 1% ou menos da amostra permanece na matriz porosa depois da passagem da amostra, tal como 0,9% ou menos, tal como 0,8% ou menos, tal como 0,7% ou menos, tal como 0,5% ou menos, tal como 0,1% ou menos, tal como 0,05% ou menos, tal como 0,01% ou menos, tal como 0,001% ou menos, e incluindo 0,0001% ou menos da amostra permanece na matriz porosa depois da passagem da amostra. Dito de outra forma, as matrizes porosas de interesse inclu- em uma rede de poros interligados que é configurada para dar a passagem de substancialmente toda a amostra através da matriz porosa, tal como que 99% ou mais da amostra passa através da matriz porosa, tal como 99,5% ou mais, tal como 99,9% ou mais, tal como 99,99% ou mais, tal como 99,999% ou mais, e incluindo passagem de 99,9999% ou mais da amostra através da matriz porosa. Em certas modalidades, toda (isto é, 100%) da amostra passa através da matriz porosa.

[0041] A matriz porosa posicionada entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo pode ser de qualquer forma adequada, tal como formas poligonais planares, incluindo, mas não limitado a um círculo, oval, semicírculo, em forma de crescente, em forma de estrela, quadrado, triângulo, losango, pentágono, hexágono, heptógono, octógono, retângulo ou outro polígono adequado. Em outras modalidades, as matrizes porosas de interesse são tridimensionais, tais como na forma de um cubo, cone, meia esfera, estrela, prisma triangular, prisma retangular, prisma hexagonal ou outro poliedro adequado. Em certas modalidades, a matriz porosa é em forma de disco. Em outras modalidades, a matriz porosa é cilíndrica. As dimensões da matriz porosa pode variar, em algumas modalidades oscilando de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluindo de 5 mm a 25 mm. Em algumas modalidades, a matriz porosa é circular e o diâmetro da matriz porosa varia de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, como d 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluindo de 5 mm a 25 mm e tem uma altura de 0,01 mm a 50 mm, tal como de 0,05 mm a 45 mm, tal como de 0,1 mm a 40 mm, tal como de 0,5 mm a 35 mm, tal como de 1 mm a 30 mm, tal como de 2 mm a 25 mm, tal como de 3 mm a 20 mm, tal como de 4 mm a 15 mm, e incluindo de 5 mm a 10 mm.

[0042] O tamanho dos poros da matriz porosa pode também vari ar, dependendo da amostra biológica e reagentes de análise presentes e pode variar de 0,01 μm a 200 μm, tal como de 0,05 μm a 175 μm, tal como 0,1 μm a 150 μm, tal como 0,5 μm a 125 μm, tal como 1 μm a 100 μm, tal como 2 μm a 75 μm e incluindo 5 μm a 50 μm. Em modalidades, a matriz porosa pode ter um volume de poro suficiente para conter a totalidade ou parte da amostra aplicada como desejado. Por exemplo, 50% ou mais do volume da amostra pode caber dentro da matriz porosa, tal como 55% ou mais, tal como 60% ou mais, tal como 65% ou mais, tal como 75% ou mais, tal como 90% ou mais, tal como 95% ou mais, tal como 97% ou mais e incluindo 99% ou mais do volume da amostra pode caber no interior da matriz porosa. Em certas modalidades, a matriz porosa tem um volume de poro que é suficiente para conter toda (isto é, 100%) a amostra. Por exemplo, o volume de poros da matriz porosa pode variar de 0,01 μL a 1000 μL, tal como de 0,05 μL a 900 μL, tal como 0,1 μL a 800 μL, tal como μL 0,5 a 500 μL, tal como 1 μL a 250 μL, tal como 2 μL a 100 μL e incluindo 5 μL a 50 μL. Em modalidades, a fração vazia (isto é, a razão entre o volume de vazio dentro dos poros e o volume total) de matrizes porosas de intervalos de interesse de 0,1 a 0,9, tal como de 0,15 a 0,85, tal como de 0,2 a 0,8, tal como de 0,25 a 0,75, tal como de 0,3 a 0,7, tal como de 0,35 a 0,65 e incluindo de 0,4 a 0,6. Dito de outra forma, o volume de poro é de 10% e 90% do volume total da matriz porosa, tal como entre 15% e 85%, tal como entre 20% e 80%, tal como entre 25% e 75%, tal como entre 30% e 70%, tal como entre 35% e 65% e incluindo um volume de poro entre 40% e 60% do volume total da matriz porosa.

[0043] Em algumas modalidades, as matrizes porosas de interes- se são configuradas para fornecer uma velocidade predeterminada de fluxo de amostra através da matriz porosa. Como discutido acima, a amostra pode ser misturada com um reagente de análise no interior dos poros da matriz porosa e fluir através da matriz porosa para o canal de fluxo por ação capilar. Em certos casos, a matriz porosa é configurada para fornecer uma velocidade de fluxo através da matriz porosa para o canal de fluxo que é 0,0001 μL/min ou mais, tal como 0,0005 μL/min ou mais, tal como 0,001 μL/min ou mais, tal como 0,005 μL/min ou mais, tal como 0,01 μL/min ou mais, tal como 0,05 μL/min ou mais, tal como 0,1 μL/min ou mais, tal como 0,5 μL/min ou mais, tal como 1 μL/min ou mais, tal como 2 μL/min ou mais, tal como 3 μL/min ou mais, tal como 4 μL/min ou mais, tal como 5 μL/min ou mais, tal como 10 μL/min ou mais, tal como 25 μL/min ou mais, tal como 50 μL/min ou mais, tal como 100 μL/min e incluindo uma taxa de fluxo através da matriz porosa de 250 μL/min ou mais. Por exemplo, a matriz porosa pode ser configurada para fazer passar a amostra através da matriz porosa (onde a amostra é misturada com o reagente de análise) a uma taxa que varia de 0,0001 μL/min a 500 μL/min, tal como de 0,0005 μL/min a 450 μL/min, tal como de 0,001 μL/min a 400 μL/min, tal como de 0,005 μL/min a 350 μL/min, tal como de 0,01 μL/min a 300 μL/min, tal como de 0,05 μL/min a 250 μL/min, tal como de 0,1 μL/min a 200 μL/min, tal como de 0,5 μL/min a 150 μL/min e incluindo fazer passar a amostra através da matriz porosa a uma taxa de 1 μL/min a 100 μL/min.

[0044] Em algumas modalidades, as matrizes porosas em causa são configuradas para fazer passar a amostra através da matriz porosa ao longo de um período de tempo predeterminado. Por exemplo, a matriz porosa pode ter uma estrutura de poros em que a amostra passa através da matriz porosa em um período de tempo, tal como ao longo de um período de 5 segundos ou mais, tal como ao longo de 10 segundos ou mais, tal como ao longo de 30 segundos ou mais, tal como ao longo de 60 segundos ou mais, tal como ao longo de 2 minutos ou mais, tal como ao longo de 3 minutos ou mais, tal como ao longo de 5 minutos ou mais, tal como ao longo de 10 minutos ou mais e incluindo fazer passar a amostra através da matriz porosa ao longo de um período de 30 minutos ou mais. Em certos casos, a matriz porosa é configurada para ter uma estrutura de poros em que a amostra passa através da matriz porosa ao longo de um período que varia de 1 segundo a 60 minutos, como de 2 segundos a 30 minutos, tal como de 5 segundos a 15 minutos, tal como de 10 segundos a 10 minutos, tal como de 15 segundos a 5 minutos e incluindo de 20 segundos a 3 minutos.

[0045] A matriz porosa pode ser qualquer substrato macroporoso ou microporoso adequado e inclui, mas não está limitada a matrizes de cerâmica, fritas, tal como vidro sinterizado, matrizes poliméricas, bem como matrizes poliméricas metal-orgânicas. Em algumas modalidades, a matriz porosa é de uma frita. O termo "frita" é aqui utilizado no seu sentido convencional para referir a composição porosa formada de um granulado sólido sinterizado, tal como vidro. As fritas podem ter um constituinte químico que varia, dependendo do tipo de granulado sinte- rizado utilizado para preparar a frita e pode incluir, mas não se limitando a fritas compostas de silicato de alumínio, trióxido de boro, vidro de borofosfosilicato, vidro de borosilicato, esmalte cerâmico, vidro de cobalto, vidro arando, vidro de fluorofosfato, vidro de fluorsilicato, quartzo fundido, dióxido de germânio, borosilicato de metal e sulfureto incorporado, vidro de chumbo, vidro de fosfato, vidro de pentóxido de fósforo, vidro de fosfosilicato, silicato de potássio, vidro de cal de soda, vidro hexametafosfato de sódio, silicato de sódio, vidro telurito, vidro de urânio, vitrite e suas combinações. Em algumas modalidades, a matriz porosa é uma frita de vidro, tal como uma frita de vidro de borosilicato, aluminossilicato, fluorossilicato, silicato de potássio ou de borofosfosili- cato.

[0046] Em algumas modalidades, a matriz porosa é um polímero orgânico poroso. Os polímeros orgânicos porosos de interesse variam dependendo do volume da amostra, componentes na amostra, bem como reagente de análise presentes e podem incluir, mas não estão limitados a polietileno poroso, polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE), fluoreto de polivinilideno (PVDF), acetato de etilvinila (EVA), policarbonato, ligas de policarbonato, poliuretano, polietersulfona, co- polímeros e suas combinações. Por exemplo, polímeros porosos de interesse incluem homopolímeros, heteropolímeros e copolímeros compostos por unidades monoméricas tais como estireno de etila, mo- nómeros monoalquileno alileno, tais como estireno de etila, estireno α- metila, vinil-tolueno, benzeno e acetato de vinila; ésteres metacrílicos, tais como metil metacrilato, etil metacrilato, butil metacrilato, isobutil metacrilato, isodecil metacrilato, 2-etilhexil metacrilato, metacrilato de laurila, estearilo metacrilato, ciclohexil metacrilato e benzila metacrila- to; monómeros contendo cloro tais como cloreto de vinila, vinilideno- cloreto e clorometilestireno; compostos de acrilonitrilo tais como acrilo- nitrilo e metacrilonitrilo; e acetato de vinila, propionato de vinila, n- octadecil acrilamida, etileno, propileno, e butano, e suas combinações.

[0047] Em algumas modalidades, a matriz porosa é uma matriz de polímero orgânico de metal, por exemplo uma matriz de polímero orgânico que tem uma estrutura de base que contém um metal tal como alumínio, bário, antimónio, cálcio, crómio, cobre, érbio, germânio, ferro, chumbo, lítio, fósforo, potássio, silício, tântalo, estanho, titânio, vaná- dio, zinco ou zircónio. Em algumas modalidades, a matriz orgânica porosa de metal é um polímero de organossiloxano incluindo, mas não se limitando a polímeros de metiltrimetoxissilano, dimetildimetoxissilano, te- traetoxissilano, metacriloxipropiltrimetoxissilano, bis(trietoxissilil)etano, bis(trietoxissilil)pentano, bis(trietoxissilil)butano, bis(trietoxissilil)hexano, bis(trietoxissilil)heptano, bis(trietoxissilil)octano, e suas combinações.

[0048] Em modalidades da presente divulgação, o componente poroso também inclui um reagente de análise. Em algumas modalidades, os reagentes de análise estão presentes dentro dos poros da matriz porosa e são configurados para se misturar com os componentes da amostra aplicada quando a amostra passa através da matriz porosa. Os reagentes de análise de interesse presentes no componente poroso podem incluir membros de ligação específica do analito, tal como enzimas, anticorpos, substratos, oxidantes, entre outros membros de ligação específica do analito. Em certos casos, o membro de ligação específica ao analito inclui um domínio de ligação. Por "ligação específica" ou "se liga especificamente" se entende uma ligação preferencial de um domínio (por exemplo, um membro do par de ligação para o outro membro do par de ligação do mesmo par de ligação) em relação a outras moléculas ou frações em uma solução ou mistura de reação. O domínio de ligação específico pode ligar-se (por exemplo, covalentemente ou não covalentemente) a um epitopo específico de um analito de interesse. Em certas instâncias, o domínio de ligação específico se liga não covalentemente a um alvo. Por exemplo a ligação entre o membro de ligação específica ao analito e o analito alvo pode ser caracterizado por uma constante de dissociação, tal como constante de dissociação de 10-5 M ou menos, 10-6 M ou menos, tal como 10-7 M ou menos, incluindo 10-8 M ou menos, por exemplo, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, 10-12 M ou menos, 10-13 M ou menos, 10-14 M ou menos, 10-15 M ou menos e incluindo 1016 M ou menos.

[0049] Os membros de ligação específica do analito podem variar dependendo do tipo de amostra biológica e componentes de interesse e podem incluir, mas não estão limitados a agentes de ligação de anti- corpo, proteínas, péptidos, haptenos, ácidos nucleicos, oligonucleóti- dos. Em algumas modalidades, o membro de ligação específica ao analito é uma enzima. Exemplos de enzimas podem incluir, mas não se limitam a peroxidase de rábano, piruvato oxidase, oxaloacetato descarboxilase, creatinina amidohidrolase, creatina amidinohidrolase, sarcosina oxidase, malato desidrogenase, lactato desidrogenase, FAD, TPP, P-5-P, NADH, Amplex Red e suas combinações.

[0050] Em certas modalidades, o membro de ligação específica ao analito é um agente de ligação de anticorpo. O termo "agente de ligação de anticorpo" é aqui utilizado no mesmo sentido convencional para se referir a anticorpos policlonais ou monoclonais ou fragmentos de anticorpos que são suficientes para se ligar a um analito de interesse. Os fragmentos de anticorpos podem ser, por exemplo, fragmentos Fab monoméricos, fragmentos Fab' monoméricos ou fragmentos F(ab')2 diméricos. Também dentro do âmbito do termo "agente de ligação de anticorpo" estão moléculas produzidas por engenharia de anticorpos, tais como moléculas de anticorpo de cadeia simples (scFv) ou anticorpos humanizados ou quiméricos produzidos de anticorpos monoclo- nais por substituição das regiões constantes das cadeias pesada e leve para produzir anticorpos quiméricos ou substituição de ambas as regiões constantes e as porções estruturais das regiões variáveis para produzir anticorpos humanizados. Em certas modalidades, o membro de ligação específica ao analito é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a um composto tal como aglomerado de diferenciação 14 (CD14), aglomerado de diferenciação 4 (CD4), aglomerado de diferenciação 45 RA (CD45RA) e aglomerado de diferenciação 3 (CD3) ou uma sua combinação.

[0051] Em algumas modalidades, o membro de ligação específica ao analito é acoplado a um marcador detectável. Qualquer marcador detectável adequado pode ser utilizado, incluindo, mas não limitado a marcadores radioativos, marcadores detectáveis por técnicas de es- pectroscopia tais como ressonância magnética nuclear, bem como marcadores opticamente detectáveis, tais como marcadores detectá- veis por espectrometria de UV-vis, espectroscopia de infravermelho, espectroscopia de absorção transiente e espectroscopia de emissão (por exemplo, fluorescência, fosforescência, quimioluminescência). Em certas modalidades, o membro de ligação específica ao analito é acoplado a um marcador detectável opticamente. Em um exemplo, o marcador opticamente detectável é um fluoróforo. Exemplos de fluoróforos podem incluir, mas não estão limitados a, ácido 4-acetamido-4'- isotiocianatostilbeno-2,2'dissulfônico; acridina e derivados, tal como acridina, laranja de acridina, amarelo de acridina, vermelho de acridina e isotiocianato de acridina; ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1- sulfônico (EDANS); dissulfonato de 4-amino-N-[3- vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 (Amarelo Lucifer VS); N-(4-anilino-1- naftil)maleimida; antranilamida; Amarelo Brilhante; cumarina e derivados tal como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumaran 151); cianina e seus derivados, tal como cianosina, Cy3, Cy5, Cy5.5, e Cy7; 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI); 5',5''-dibromopirogalol-sulfoneftaleina (Vermelho de Bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4- metilcumarina; dietilaminocoumarina; dietilenotriamina penta acetato; ácido 4,4'-diisotioianatodidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico; ácido 4,4'- diisotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico; cloreto de 5- [dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloreto de dansilo), ácido 4-(4'- dimetilaminofenilazo)-benzóico (DABCYL); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'- isotiocianato (DABITC); eosina e derivados, tal como eosina e isotioci- anato de eosina; eritrosina e derivados, tais como eritrosina B e isotio- cianato de eritrosina; etídio; fluoresceína e seus derivados, tal como 5- carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-ila)amina fluoresceí- na (DTAF), 2'7'-dimetóxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), isoti- ocianato de fluoresceína (FITC), clorotriazinil de fluoresceína, naftoflu- oresceína, e QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; Green Fluorescent Protein (GFP); Reff Coral Fluorescent Protein (RCFP); Lissamine™; Rodamina Lissamina, amarelo Lúcifer; isotiocianato de Verde Malaquita; 4-metilumbeliferona; orto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Vermelho do Nilo; Verde Oregon; Vermelho de Fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdeído; pireno e derivados, tais como pireno, bu- tirato de pireno e butirato de succinimidil 1-pireno; Reactive Red 4 (Ci- bacron™ Brilliant Red 3B-A); rodamina e derivados, tais como 6- carbóxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lissamina 4,7- diclororodamina, cloreto de sulfonilo rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonilo de sulforodami- na 101 (Vermelho Texas), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, e isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; derivados do ácido rosolico e quelato térbio; xan- teno ou suas combinações, entre outros fluoróforos. Em certas modalidades, o fluoróforo é um corante fluorescente, tal como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, boro diflúor- dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina, seus conjugados, ou uma sua combinação. Tal como descrito em maior detalhe abaixo, os fluoróforos podem ser detectados por máximos de emissão, dispersão de luz, coeficiente de extinção, polarização de fluorescência, tempo de vida de fluorescência ou uma combinação destes.

[0052] A quantidade de membro de ligação específica ao analito presente no reagente de análise pode variar dependendo do volume e tipo de amostra aplicada. Em alguns casos, a quantidade de membro de ligação específica ao analito é suficiente para fornecer uma concen- tração do membro de ligação específica ao analito na amostra presente no canal de fluxo de 0,0001 μg/mL a 250 μg/mL, tal como de 0,0005 μg/mL a 240 μg/mL, tal como de 0,001 μg/mL a 230 μg/mL, tal como de 0,005 μg/mL a 220 μg/mL, tal como de 0,01 μg/mL a 210 μg/mL, tal como de 0,05 μg/mL a 200 μg/mL, tal como de 0,1 μg/mL a 175 μg/mL, tal como de 0,5 μg/mL a 150 μg/mL e incluindo uma quantidade de membro de ligação específica ao analito suficiente para fornecer uma concentração do membro de ligação específica ao analito na amostra presente no canal de fluxo de 1 μg/mL a 100 μg/mL. Por exemplo, o peso seco do membro de ligação específica ao analito presente no componente poroso pode variar de 0,001 ng a 500 ng, tal como de 0,005 ng a 450 ng, tal como de 0,01 ng a 400 ng, tal como de 0,05 ng a 350 ng, tal como de 0,1 ng a 300 ng, tal como de 0,5 ng a 250 ng e incluindo uma massa seca do membro de ligação específica ao analito de 1 ng a 200 ng.

[0053] Em algumas modalidades, o componente poroso também inclui um ou mais tampões. O termo "tampão" é utilizado no seu sentido convencional para se referir a um composto que ajuda a estabilizar (isto é, manter) a composição, tal como por exemplo durante a dissolução do reagente de análise na amostra aplicada. Os tampões de interesse podem incluir, mas não estão limitados a proteínas, polissaca- rídeos, sais, ligantes químicos e as suas combinações. Abrangidos pela invenção são os dois formatos de tampão líquido e seco, por exemplo, composições aquosas que incluem os componentes abaixo ou versões desidratadas dos mesmos.

[0054] Em algumas modalidades, os tampões incluem polissacarí- deos, tal como por exemplo glucose, sacarose, frutose, galactose, ma- nitol, sorbitol, xilitol, entre outros polissacarídeos. Em alguns casos, os tampões incluem uma proteína tal como a BSA. Em ainda outros exemplos, tampões de interesse em uma pasta química, incluindo, mas não se limitando a dextranos de baixo peso molecular, ciclodex- trina, polietilenoglicol, ésteres de polietileno glicol polivinilpirrolidona (PVP) ou outros polímeros hidrófilos selecionados de entre o grupo que consiste em ácido hialurônico, polivinilpirrolidona (PVP), copolíme- ros de N-vinilpirrolidona, hidroxietil celulose, metil celulose, carboxime- til celulose, dextrano, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de blocos de PEG/PPG, homo e copolímeros de ácido acrílico e metacrílico, poliuretanos, álcool polivinílico, poliviniléteres, copolímeros à base de anidri- do maleico, poliésteres, vinilaminas, polietilenoiminas, óxidos de polie- tileno, poli(ácidos carboxílicos), poliamidas, polianidridos, polifosfaze- nos, e suas misturas.

[0055] Em certas modalidades, os tampões de interesse incluem um tampão biológico, incluindo, mas não limitado a ácido N-(2- acetamido)-aminoetanossulfônico (ACES), acetato, ácido N-(2- acetamido)iminodiacético (ADA), ácido 2-aminoetanossulfônico (AES), amoníaco, 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP), 2-amino-2-metil-1,3- propanodiol (AMPD), ácido N-(1,1-dimetil-2-hidroxietil)-3-amino-2- hidroxipropanossulfônico (AMPSO), ácido N,N-bis-(2-hidroxietil)-2- aminoetanossulfônico (BES), bicarbonato, N,N'-bis-(2-hidroxietil)- glicina, [Bis-(2-hidroxietil)-imino]-tris-(hidroximetilmetano) (BIS-Tris), 1,3-Bis[tris (hidroximetil)metilamino]propano (BIS-Tris-propano), ácido bórico, ácido dimetilarsínico, albumina de soro bovino (BSA), ácido 3- (ciclo-hexilamino)-propanossulfônico (CAPS), ácido 3-(ciclohexilamino)- 2-hidróxi-1-propanossulfônico (CAPSO), ácido ciclohexilaminoetanossul- fônico (CHES), citrato, ácido 3-[N-Bis(hidroxietil)amino]-2- hidroxipropanossulfônico (DIPSO), formiato, glicina, glicilglicina, ácido N- (2-hidroxietil)-piperazina-N'-etanossulfônico (HEPES), ácido N-(2- Hidroxietil)-piperazina-N'-3-propanossulfônico (HEPPS, EPPS), ácido N-(2-Hidroxietil)-piperazina-N'-2-hidroxipropanossulfônico (HEPPSO), imidazole, malato, maleato, ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), ácido 3-(N-Morfolino)propanossulfônico (MOPS), ácido 3-(N- morfolino)-2-hidroxipropanossulfônico (MOPSO), fosfato, Piperazina- N,N'-bis(2-etanossulfônico) (PIPES), Piperazina-N,N'-bis(ácido 2- hidroxipropanossulfônico) (POPSO), piridina, polivinilpirrolidona (PVP), succinato, 3-{[Tris(hidroximetil)-metil]-amino}-propanossulfônico (TAPS), ácido 3-[N-Tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanossulfônico (TAPSO), ácido 2-Aminoetanossulfônico, AES (taurina), trealose, trieta- nolamina (TEA), ácido 2-[Tris(hidroximetil)metilamino]etanossulfônico (TES), N-[Tris(hidroximetil)metil]-glicina (tricina), Tris(hidroximetil)- aminometano (Tris), gliceraldeídos, manose, glucosamina, manoeptu- lose, sorbose-6-fosfato, trealose-6-fosfato, maleimida, iodoacetatos, citrato de sódio, acetato de sódio, fosfato de sódio, tartarato de sódio, succinato de sódio, maleato de sódio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, fosfato de magnésio, acetato de amónio, citrato de amónio, fosfato de amónio, entre outros tampões.

[0056] A quantidade de cada componente de tampão presente na matriz porosa pode variar, dependendo do tipo e tamanho da amostra e do tipo de matriz porosa utilizada (frita inorgânica, polímero orgânico poroso, tal como descrito acima) e podem variar de 0,001% a 99% em peso, tal como de 0,005% a 95% em peso, tal como de 0,01% a 90% em peso, tal como de 0,05% a 85% em peso, tal como de 0,1% a 80% em peso, tal como de 0,5% a 75% em peso, tal como de 1% a 70% em peso, tal como de 2% a 65% em peso, tal como de 3% a 60% em peso, tal como de 4% a 55% em peso e incluindo de 5% a 50% em peso. Por exemplo, o peso seco de tampão presente na matriz porosa pode variar de 0,001 μg a 2,000 μg, tal como de 0,005 μg a 1900 μg, tal como de 0,01 μg a 1800 μg, tal como de 0,05 μg a 1700 μg, tal como desde 0,1 ng a 1500 μg, tal como de 0,5 μg a 1000 μg e incluindo um peso seco de tampão de 1 μg a 500 μg.

[0057] Em algumas modalidades, o peso total de tampão presente na matriz porosa depende do volume de vazio (isto é, o volume no interior dos poros) da matriz porosa e varia de 0,001 g a 5 g de tampão por mL de volume de vazio na matriz porosa, tal como de 0,005 g a 4,5 g, tal como de 0,01 g a 4 g, tal como de 0,05 g a 3,5 g, tal como de 0,1 g a 3 g, tal como de 0,5 g a 2,5 g e incluindo de 1 g a 2 g de tampão por mL de volume de vazio na matriz porosa.

[0058] Em um exemplo, o tampão presente na matriz porosa inclui albumina de soro bovino (BSA). Quando o tampão presente na matriz porosa inclui BSA, a quantidade de BSA varia, oscilando de 1% a 50% em peso, tal como de 2% a 45% em peso, tal como de 3% a 40% em peso, tal como entre 4% e 35% em peso, e incluindo entre 5% e 25% em peso. Por exemplo, o peso seco de BSA no tampão pode variar de 0,001 μg a 2,000 μg, tal como de 0,005 μg a 1900 μg, tal como de 0,01 μg a 1800 μg, tal como de 0,05 μg a 1700 μg, tal como desde 0,1 ng a 1500 μg, tal como de 0,5 μg a 1000 μg e incluindo um peso seco de BSA de 1 μg a 500 μg.

[0059] Em outro exemplo, tampão presente na matriz porosa inclui polivinilpirrolidona (PVP). Quando o tampão presente na matriz porosa inclui PVP, a quantidade de PVP varia, oscilando de 0,01% a 10% em peso, tal como de 0,05% a 9% em peso, tal como de 0,1% a 8% em peso, tal como entre 0,5% e 7%, em peso, e incluindo entre 1% e 5% em peso. Por exemplo, o peso seco de PVP no tampão pode variar de 0,001 μg a 2,000 μg, tal como de 0,005 μg a 1900 μg, tal como de 0,01 μg a 1800 μg, tal como de 0,05 μg a 1700 μg, tal como de 0,1 ng a 1500 μg, tal como de 0,5 μg a 1000 μg e incluindo um peso seco de PVP de 1 μg a 500 μg.

[0060] Em ainda outro exemplo, tampão presente na matriz porosa inclui trealose. Quando o tampão presente na matriz porosa inclui trea- lose, a quantidade de trealose varia, oscilando de 0,001% a 99% em peso, tal como de 0,005% a 95% em peso, tal como de 0,01% a 90% em peso, tal como de 0,05% a 85% em peso, tal como de 0,1% a 80% em peso, tal como de 0,5% a 75% em peso, tal como de 1% a 70% em peso, tal como de 2% a 65% em peso, tal como de 3% a 60% em peso, tal como de 4% a 55%, em peso, e incluindo de 5% a 50% em peso. Por exemplo, o peso seco de trealose no tampão pode variar de 0,001 μg a 2,000 μg, tal como de 0,005 μg a 1900 μg, tal como de 0,01 μg a 1800 μg, tal como de 0,05 μg a 1700 μg, tal como de 0,1 ng a 1500 μg, tal como de 0,5 a 1000 μg μg e incluindo um peso seco de trealose de 1 μg a 500 μg.

[0061] Em certas modalidades, tampão presente na matriz porosa inclui BSA, trealose e polivinilpirrolidona. Por exemplo, o tampão pode incluir BSA, trealose e polivinilpirrolidona em uma razão em peso de BSA:trealose:PVP que varia entre 1:1:1 e 25:100:1 Em determinados casos, a razão em peso de BSA:trealose:PVP é 21:90:1.

[0062] Em algumas modalidades, os tampões podem ainda incluir um ou mais agentes complexantes. Um "agente complexante" é utilizado no seu sentido convencional para se referir a um agente que auxilia na mistura da amostra com o reagente de análise e pode também servir para ligar os íons (por exemplo, ferro ou outros íons) e a prevenir a formação de precipitados durante a mistura. Um agente comple- xante pode ser um agente que é capaz de complexar com um íon metálico. Em alguns casos, o agente complexante é um agente quelante, tal como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietileno triamina pentacético (DTPA), ácido nitrolotriacético (NTA), diacetato de etilenodiamina (EDDA), ácido etilenodiamina-di(o-hidroxifenilacético) (EDDHA), ácido hidroxietiletilenodiaminotriacético (HEDTA), ácido ciclo- hexano diamino tetracético (CDTA), ácido etilenoglicol bis-(beta-aminoetil éter)N,N,N',N'-tetracético (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropano-1- sulfônico (DMPS), e ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA) e semelhantes. Agentes quelantes que ocorrem naturalmente também podem ser utilizados. Por agente quelante que ocorre naturalmente se quer dizer que o agente quelante é um agente quelante que ocorre na natureza, isto é, não um agente que foi sintetizado pela primeira vez por intervenção humana. O agente quelante que ocorre naturalmente pode ser um agente quelante de peso molecular baixo, em que por baixo peso molecular do agente quelante se entende que o peso molecular do agente quelante não exceda cerca de 200 daltons. Em certas modalidades, o peso molecular do agente quelante é maior do que cerca de 100 daltons. Em algumas modalidades, os reagentes de análise de interesse incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Sempre que um agente quelante está presente na matriz porosa, a quantidade de agente quelante pode variar de 0,001% a 10% em peso, tal como de 0,005% a 9,5% em peso, tal como de 0,01% a 9% em peso, tal de 0,05% a 8,5% em peso, tal como de 0,1% a 8% em peso, tal como de 0,5% a 7,5% em peso, e incluindo de 1% a 7% em peso. Por exemplo, o peso seco do agente quelante no reagente de análise pode variar de 0,001 μg a 2000 μg, tal como de 0,005 μg a 1900 μg, tal como de 0,01 μg a 1800 μg, tal como de 0,05 μg a 1700 μg, tal como de 0,1 ng a 1500 μg, tal como de 0,5 μg a 1000 μg e incluindo um peso seco de agente quelante de 1 μg a 500 μg.

[0063] Toda ou parte da matriz porosa pode conter o reagente de análise e os componentes do tampão. Por exemplo, 5% ou mais da matriz porosa pode conter reagente de análise e os componentes do tampão, por exemplo 10% ou mais, tal como 25% ou mais, tal como 50% ou mais, tal como 75% ou mais, tal como 90% ou mais, tal como 95% ou mais e incluindo 99% ou mais. Em certas modalidades, toda a matriz porosa contém reagente de análise e componentes do tampão. O reagente de análise e os componentes do tampão podem ser homogeneamente distribuído por toda a matriz porosa ou podem ser posicionados em locais específicos dentro da matriz porosa, ou alguma sua combinação. Por exemplo, em um exemplo, o reagente de análise e os componentes do tampão são homogeneamente distribuídas por toda a matriz porosa. Em um outro exemplo, o reagente de análise e os componentes do tampão estão posicionados em localizações específicas na matriz porosa, tal como em incrementos específicos de cada 0,1 mm ou mais, tal como 0,5 mm ou mais, tal como 1 mm ou mais e que incluem o posicionamento da matriz porosa a cada 2 mm ou mais da matriz porosa. Em ainda outro exemplo, o reagente de análise e os componentes do tampão podem ser homogeneamente distribuído ao longo de uma primeira metade da matriz porosa e em incrementos específicos ao longo de uma segunda metade da matriz porosa. Em certas modalidades, o reagente de análise e os componentes do tampão estão posicionados na matriz porosa como um gradiente, em que a quantidade de reagente de análise e componentes do tampão, aumenta de uma extremidade proximal (por exemplo, mais perto do local de aplicação da amostra), para a extremidade distal (por exemplo, mais perto do canal de fluxo). Em um exemplo, a quantidade de reagente de análise aumenta linearmente ao longo do percurso de fluxo da amostra através da matriz porosa. Em outro exemplo, a quantidade de reagente de análise e componentes do tampão aumenta exponencialmente ao longo do percurso do fluxo da amostra através da matriz porosa.

[0064] Os reagentes de análise e os componentes do tampão po dem estar presentes no componente poroso em qualquer estado físico adequado, tal como um líquido, sólido seco ou podem ser liofilizados. Em algumas modalidades, os reagentes de análise e os componentes do tampão estão presentes como um sólido seco. Em outras modalidades, os reagentes de análise e os componentes do tampão são liofi- lizadas. Todos ou parte dos reagentes de análise e componentes do tampão podem estar no mesmo estado físico. Por exemplo, 5% ou mais dos reagentes de análise e componentes do tampão podem estar presentes na matriz porosa como um sólido seco, tal como 10% ou mais, tal como 25% ou mais, tal como 50% ou mais, tal como 75% ou mais, tal como 90% ou mais e incluindo 95% ou mais dos reagentes de análise e componentes do tampão. Em algumas modalidades, a 5% ou mais dos reagentes de análise e componentes do tampão são liofi- lizadas, tal como 10% ou mais, tal como 25% ou mais, tal como 50% ou mais, tal como 75% ou mais, tal como 90% ou mais e incluindo quando 95% ou mais dos reagentes de análise e componentes do tampão são liofilizados.

[0065] Em modalidades da presente divulgação, um canal de fluxo é posicionado de forma adjacente ao componente poroso e em comunicação de fluido com a amostra misturada com o reagente de análise e os componentes do tampão na matriz porosa. Como discutido em maior detalhe abaixo, a amostra pode passar através de e ser misturada com o reagente de análise na matriz porosa devido a uma força (por exemplo, força centrífuga, força eletrostática, ação capilar) e para dentro do canal de fluxo. Em algumas modalidades, o canal de fluxo é um canal alongado fechado por uma ou mais paredes. Dependendo do tamanho da amostra, o canal de fluxo pode variar. Em algumas modalidades, o canal de fluxo é linear. Em outras modalidades, o canal de fluxo é não linear. Por exemplo, o canal de fluxo pode ser curvilíneo, circular, sinuoso, torcido ou ter uma configuração helicoidal.

[0066] O comprimento do canal de fluxo pode variar, oscilando de 10 mm a 1000 mm, tal como de 15 mm a 950 mm, tal como de 20 mm a 900 mm, tal como de 20 mm a 850 mm, tal como de 25 mm a 800 mm, tal como de 30 mm a 750 mm, tal como de 35 mm a 700 mm, tal como de 40 mm a 650 mm, tal como de 45 mm a 600 mm, tal como de 50 mm a 550 mm e incluindo de 100 mm a 500 mm.

[0067] Em modalidades, a forma da seção transversal do canal de fluxo pode variar, em que os exemplos de formas transversais incluem, mas não estão limitados às formas de seção transversal retilíneas, por exemplo, quadrados, retângulos, triângulos, trapézios, hexágonos, etc., formas de seção transversal curvilíneas, por exemplo, circular, oval, etc., bem como formas irregulares, por exemplo, uma porção de fundo parabólico acoplada a uma porção superior plana, etc. Em modalidades, as dimensões de seção transversal do canal de fluxo podem variar, oscilando de 0,01 mm a 25 mm, tal como de 0,05 mm a 22,5 mm, tal como de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 17,5 mm, tal como de 1 mm a 15 mm, tal como de 2 mm a 12,5 mm, tal como de 3 mm a 10 mm, e incluindo de 5 mm a 10 mm. Por exemplo, quando o canal de fluxo é cilíndrico, o diâmetro do canal de fluxo pode variar de 0,01 mm a 25 mm, tal como de 0,05 mm a 22,5 mm, tal como de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 15 mm, tal como de 1 mm a 10 mm, e incluindo de 3 mm a 5 mm.

[0068] A razão entre o comprimento e a altura da seção transver sal pode variar, oscilando de 2 a 5000, tal como de 3 a 2500, tais como de 4 a 2000, tal como de 5 de 1500, tal como de 10 a 1000, tal como de 15 a 750 e incluindo de 25 a 500. Em alguns casos, a razão entre o comprimento e a altura da seção transversal é 10. Em outros exemplos, a razão entre o comprimento e a altura da seção transversal é 15. Em ainda outros casos, a razão do comprimento a altura da seção transversal é de 25.

[0069] Em algumas modalidades, o canal de fluxo é configurado para ter uma altura de seção transversal que é substancialmente equivalente ao das dimensões do analito alvo. Por "substancialmente equivalente" às dimensões do analito alvo significa que um ou mais de altura ou largura do canal de fluxo difere do tamanho do analito alvo por 5% ou menos, tal como 4% ou menos, tal como 3% ou menos, tal como 2% ou menos, tal como 1% ou menos, tal como 0,5% ou menos, tal como 0,1% ou menos e incluindo de 0,01% ou menos. Nestas mo- dalidades, as dimensões de seção transversal do canal de fluxo são substancialmente as mesmas que o tamanho do analito e os analitos alvo estão configurados para fluir através do canal de fluxo apenas um analito de cada vez. Em certos casos, o analito alvo são células, tais como os leucócitos ou eritrócitos. Em algumas modalidades, o canal de fluxo é configurado para ter uma altura da seção transversal que substancialmente equivalente ao diâmetro de um eritrócito. Em outras modalidades, o canal de fluxo é configurado para ter uma altura da seção transversal que é substancialmente equivalente ao diâmetro de um leucócito.

[0070] Em modalidades da presente invenção, o canal de fluxo é uma estrutura configurada para receber e reter uma amostra com um volume variando de 5 μL a 5000 μL, tal como de 10 μL a 4000 μL, tal como de 15 μL a 3000 μL, tal como de 20 μL a 2000 μL, tal como de 25 μL a 1000 μL, tal como de 30 μL a 500 μL, tal como de 40 μL a 400 μL, tal como de 50 μL a 300 μL e incluindo de 75 μL a 250 μL.

[0071] Em algumas modalidades, o canal de fluxo é um canal capi lar e está configurado para mover uma amostra de líquido através do canal de fluxo por uma ação capilar. O termo "ação capilar" é aqui utilizado no seu sentido convencional para referir o movimento de um líquido por forças intermoleculares entre o líquido (isto é, coesão) e as paredes adjacentes (isto é, aderência) de um canal estreito, sem a assistência de (e às vezes em oposição à) gravidade. Nestas modalidades, a largura da seção transversal do canal de fluxo é suficiente para fornecer a ação de capilaridade da amostra no canal de fluxo e pode ter uma largura que varia de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 15 mm, tal como de 1 mm a 10 mm e incluindo de 3 mm a 5 mm.

[0072] Em algumas modalidades, o canal de fluxo inclui uma ou mais paredes opticamente transmissivas. Por "opticamente transmissi- vo" se entende que as paredes do canal de fluxo permitem a propaga- ção de um ou mais comprimentos de onda da luz através do mesmo. Em algumas modalidades, as paredes do canal de fluxo são optica- mente transmissivas a uma ou mais de luz ultravioleta, luz visível e luz próxima de infravermelho. Em um exemplo, o canal de fluxo é optica- mente transmissivo à luz ultravioleta. Em outro exemplo, o canal de fluxo é opticamente transmissivo à luz visível. Em ainda outro exemplo, o canal de fluxo é opticamente transmissivo à luz próxima de infravermelho. Em ainda outro exemplo, o canal de fluxo é transmissivo à luz ultravioleta e luz visível. Em ainda outro exemplo, o canal de fluxo é transmissivo à luz visível e luz próxima de infravermelho. Em ainda outro exemplo, o canal de fluxo é transmissivo à luz ultravioleta, luz visível e luz próxima de infravermelho. Dependendo das propriedades transmissoras desejadas das paredes do canal de fluxo, a parede opti- camente transmissiva pode ser qualquer material adequado, tal como o quartzo, vidro, ou polímeros incluindo, mas não se limitando a polímeros opticamente transmissivos, tais como acrílicos, acríli- cos/estirenos, polímeros de ciclo-olefina, policarbonatos, poliésteres e poliestirenos, entre outros polímeros opticamente transmissivos.

[0073] Em modalidades da presente divulgação, o local de aplica ção da amostra do dispositivo microfluídico é uma estrutura configurada para receber uma amostra que tem um volume que varia de 5 μL a 1000 μL, tal como de 10 μL a 900 μL, tal como de 15 μL a 800 μL, tal como de 20 μL a 700 μL, tal como de 25 μL a 600 μL, tal como de 30 μL a 500 μL, tal como de 40 μL a 400 μL, tal como de 50 μL a 300 μL e incluindo de 75 μL a 250 μL. O local de aplicação da amostra pode ser de qualquer forma conveniente, desde que preveja o acesso de fluido, quer diretamente ou através de um componente intermediário que fornece para a comunicação de fluidos, para o canal de fluxo. Em algumas modalidades, o local de aplicação da amostra é plano. Em outras modalidades, o local de aplicação da amostra é côncavo, tal como na forma de um cone invertido que termina no orifício de entrada da amostra. Dependendo da quantidade de amostra aplicada e a forma do local de aplicação da amostra, o local de aplicação da amostra pode ter uma área de superfície que varia de 0,01 mm2 e 1000 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 900 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 800 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 700 mm2, tal como de 1 mm2 a 600 mm2, tal como de 2 mm2 a 500 mm2 e incluindo de 5 mm2 a 250 mm2.

[0074] A entrada do dispositivo microfluídico está em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo e pode ser de qualquer forma adequada, em que formas de seção transversal de entrada de interesse incluem, mas não estão limitadas a: formas de seção transversal retilíneas, por exemplo, quadrados, retângulos, triângulos, trapézios, hexágonos, etc., formas de seção transversal curvilíneas, por exemplo, circular, oval, etc., bem como formas irregulares, por exemplo, uma porção de fundo parabólico acoplada a uma porção superior plana. As dimensões do orifício do bocal podem variar, em algumas modalidades variando de 0,01 mm a 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, tal como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluindo de 5 mm a 25 mm. Em algumas modalidades, a entrada é um orifício circular e o diâmetro da entrada varia entre 0,01 mm e 100 mm, tal como de 0,05 mm a 90 mm, como de 0,1 mm a 80 mm, tal como de 0,5 mm a 70 mm, tal como de 1 mm a 60 mm, tal como de 2 mm a 50 mm, tal como de 3 mm a 40 mm, tal como de 4 mm a 30 mm e incluindo de 5 mm a 25 mm. Logo, dependendo da forma da entrada, o orifício de entrada da amostra pode ter uma abertura que varia, oscilando de 0,01 mm2 a 250 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 200 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 150 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 100 mm2, tal como de 1 mm2 a 75 mm2, tal como de 2 mm2 a 50 mm2 e incluindo de 5 mm2 a 25 mm2.

[0075] Em algumas modalidades, os dispositivos microfluídicos em causa incluem um canal de ventilação. Os canais de ventilação de interesse podem ter uma variedade de configurações diferentes e estão configurados para acoplar em comunicação de fluido uma saída de ventilação (por exemplo, posicionado de forma adjacente ao local de aplicação da amostra) com a extremidade distal do canal de fluxo (isto é, mais afastada do local de aplicação da amostra). O canal de ventilação pode ser uma estrutura alongada, semelhante às descritas acima para o canal de fluxo, incluindo uma configuração tendo um comprimento que é maior do que a sua largura. Embora a razão de comprimento para largura possa variar, em alguns casos a razão de comprimento para largura está no intervalo de 5 a 2000 tal como 10 a 200 e inclui 50 a 60. Em alguns casos, o comprimento do canal de ventilação varia entre 5 e 200, tal como 10 a 100 e incluindo 50 a 75 mm. Em alguns casos, os canais de ventilação de interesse tem um tamanho de micrometro de dimensão da seção transversal, por exemplo, uma maior dimensão em corte transversal (por exemplo, diâmetro no caso do canal tubular) que varia de 0,1 a 10, tal como 0,5 a 5 e incluindo 1 a 2 mm. Em alguns casos, a largura do canal de ventilação varia de 0,1 a 10, tal como 0,5 a 5 e incluindo 1 a 2 mm. Em alguns casos, a altura do canal varia de 0,5 a 5, tal como de 0,2 a 2 e incluindo 0,5 a 1 mm. A forma da seção transversal dos canais de ventilação pode variar, em alguns casos, formas da seção transversal dos canais de ventilação de interesse incluem, mas não estão limitados a: formas retilíneas em seção transversal, por exemplo, quadrados, retângulos, trapézios, triân-gulos, hexágonos, etc., formas curvilíneas em seção transversal, por exemplo, circular, oval, etc., como bem como formas irregulares, por exemplo, uma porção de fundo parabólico acoplada a uma porção superior plana. Em modalidades, as dimensões de seção transversal do canal de ventilação podem variar, oscilando de 0,01 mm a 25 mm, tal como de 0,05 mm a 22,5 mm, tal como de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 17,5 mm, tal como de 1 mm a 15 mm, tal como de 2 mm a 12,5 mm, tal como de 3 mm a 10 mm e incluindo desde 5 mm a 10 mm. Por exemplo, quando o canal de ventilação é cilíndrica, o diâmetro do canal de ventilação pode variar de 0,01 mm a 25 mm, tal como de 0,05 mm a 22,5 mm, tal como de 0,1 mm a 20 mm, tal como de 0,5 mm a 15 mm, tal como de 1 mm a 10 mm e incluindo de 3 mm a 5 mm.

[0076] Sempre que os dispositivos microfluídicos em causa inclu em um canal de ventilação, o canal de fluxo pode ser separado do canal de ventilação por uma região hidrofóbica. Por região hidrofóbica se entende uma região ou domínio que é resistente a ser molhada pela água, por exemplo, que repele meios aquosos. A região hidrofóbica pode ser uma que tem uma energia de superfície que é inferior à energia de superfície das superfícies do canal capilar. A magnitude da diferença nas energias de superfície pode variar, oscilando em alguns casos de 5 a 500, tal como 10 a 30 dines/cm. A energia de superfície da região hidrofóbica pode também variar, oscilando em alguns casos de 20 a 60, tal como de 30 a 45 dines/cm, por exemplo, tal como medido utilizando o protocolo descrito na norma ASTM Std. D2578. As dimensões da região hidrófoba são configuradas para pelo menos par-cialmente, se não completamente, impedir o fluxo líquido de amostra após a região hidrofóbica. As dimensões da região hidrófoba podem variar, em alguns casos tendo uma área de superfície que varia de 0,01 mm2 a 100 mm2, tal como de 0,05 mm2 a 90 mm2, tal como de 0,1 mm2 a 80 mm2, tal como de 0,5 mm2 a 75 mm2 e incluindo de 1 mm2 a 50 mm2.

[0077] Com referência à Figura 1, um dispositivo microfluídico para análise de uma amostra de acordo com certas modalidades, tal como com um aparelho de formação de imagens conforme descrito em Goldberg, Publicação de Patente EUA 2008/0212069 é mostrada. A Figura 1 representa um exemplo de um dispositivo microfluídico com um local de aplicação da amostra (1), componente poroso (elemento poroso 2), e um canal de fluxo (por exemplo, canal capilar 3). Como mostrado na Figura 1, o dispositivo microfluídico também inclui uma junção hidrofóbico (4) e um canal de ventilação (5). Para visualizar a amostra no canal de fluxo, este exemplo representa um canal de fluxo que tem uma parede opticamente transmissiva (6). O local de aplicação da amostra é configurado para receber uma amostra de fluido, tal como um fluido biológico (por exemplo, sangue, saliva, soro, sémen, plasma ou semelhantes). Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue. Como discutido acima, o local de aplicação da amostra se encontra em comunicação de fluido com o componente poroso de uma maneira que direciona a amostra de uma amostra através do componente poroso. O componente poroso pode ser colocado em uma câmara ou canal de tal maneira que a amostra é dirigida através do elemento poroso. O elemento poroso pode ser nivelado com as paredes de dispositivos microfluídicos dispostas tanto em uma câmara equipada no dispositivo ou ao longo de um capilar ou outro canal. Em algu-mas modalidades, o local de aplicação da amostra e o componente poroso são configurados de uma forma que fornece o fluxo de uma amostra do local de aplicação da amostra através da matriz porosa do componente poroso e do canal capilar por uma força capilar, mas outros meios de movimento da amostra são possíveis. A força centrífuga, força eletrostática ou qualquer outra força pode ser usada sozinha ou em conjunto com a força capilar para transmitir amostra através do elemento poroso. O local de aplicação da amostra pode suportar a aplicação de uma amostra distribuída por quaisquer meios, tal como de uma pipeta ou diretamente de um organismo tal como através de uma amostra de sangue da ponta do dedo de um humano.

[0078] Em algumas modalidades, o componente poroso inclui uma frita porosa feita de uma pluralidade de microcanais que servem como matriz para uma mistura de análise. Como descrito acima, os microca- nais podem formar um volume de vazio na frita que se encontra entre 40 e 60% do volume total da frita. Em algumas modalidades, a frita pode ocupar um volume de cerca de 10 μL e o volume de vazio total pode estar entre 4 e 6 μL. Em algumas modalidades, os poros são tão estreitos quanto possível para fornecer uma superfície de suspensão de reagente seco e trajetória tortuosa para mistura, sem filtração das células ou outros objetos até 15-20 mícrones. A mistura de análise pode ser seca ou de outra forma preservada no interior do volume de vazio do filtro poroso e pode compreender os componentes do tampão e um ou mais reagentes, tal como um marcador detectável que se liga a um ou mais alvos ou analitos presentes na amostra. Os componentes do tampão podem prever para uma velocidade de dissolução uniforme do reagente na amostra durante um período de tempo definido. Os componentes do tampão podem compreender qualquer combinação de uma proteína, açúcar e/ou um ligante químico. O componente proteico pode ser uma albumina tal como albumina de soro bovino (BSA). O açúcar pode ser qualquer açúcar tal como um mono, di ou polissa- carídeo. Por exemplo, sacarose, manitol, trealose (tal como trealose D+) podem estabilizar biomoléculas ou outros reagentes na frita porosa e conferir uma proteção aos reagentes, tais como biomoléculas. No desenvolvimento de liofilizados ou reagentes preservados, proteínas ou açúcares (sacarídeos e polióis) podem ser adicionados à formulação, de modo a melhorar a estabilidade e fornecer a dissolução uni-forme de reagentes ou outras biomoléculas e adicionalmente e prolongar a duração da estabilidade dos reagentes no dispositivo.

[0079] Dextrano de baixo peso molecular, ciclodextrina, polietile- noglicol, ésteres de polietileno glicol polivinilpirrolidona (PVP), ou outros polímeros hidrófilos selecionados de entre o grupo que consiste em ácido hialurônico, polivinilpirrolidona (PVP), copolímeros de N- vinilpirrolidona, hidroxietil celulose, metil celulose, carboximetil celulose, dextrano, Polietilenoglicol (PEG), copolímeros de blocos de PEG/PPG, homo e copolímeros de ácido acrílico e metacrílico, poliure-tanos, álcool polivinílico, poliviniléteres, copolímeros à base de anidri- do maleico, poliésteres, vinilaminas, polietilenoiminas, óxidos de polie- tileno, poli(ácidos carboxílicos), poliamidas, polianidridos, polifosfaze- nos, e suas misturas podem ser usados para estabilizar o reagente e auxiliar na dissolução contínua do reagente na amostra.

[0080] Os componentes do tampão podem ser agrupados na ra zão e concentração apropriada para fornecer a dissolução contínua de um reagente em uma amostra. A quantidade total de componentes do tampão pode depender do volume de vazio da frita porosa. Em algumas modalidades o peso combinado dos componentes do tampão (por exemplo, BSA, trealose e PVP) pode situar-se entre 0,01 e 2 gramas por μl de volume de vazio da frita, tal como 0,1 gramas/μL de volume de vazio. Em algumas modalidades, os componentes do tampão da presente invenção podem conter uma razão em peso de BSA:Trealose:PVP que é da ordem de 21:90:1. A razão em peso dos componentes do tampão pode variar tanto quanto 5, 10 ou 20%, desde que a propriedade de dissolução uniforme do reagente em uma amostra de líquido ao longo de um período predeterminado de tempo é mantida. O período predeterminado de tempo pode ser da ordem de segundos ou minutos, tal como entre 5 segundos e 5 minutos, ou entre 20 segundos e 3 minutos, ou entre 1 e 2 minutos, durante o qual uma dissolução uniforme do reagente na amostra é mantida. Isto fornece uma melhoria na uniformidade da distribuição do reagente não ligado na amostra através do canal capilar e a avaliação da amostra. A con- centração de reagente que não reagiu normalmente poderá desviar-se por menos do que 1%, 5%, 10%, 20% ou 50% ao longo do canal capilar. Em algumas modalidades os componentes do tampão podem conter componentes tais como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES) ou semelhantes, ou qualquer outro material útil para a manutenção da estabilidade da amostra ou reagentes durante o decurso da análise. A mistura de análise pode compreender enzimas, substratos, catalisadores, ou qualquer combinação das mesmas para reação com a amostra (por exemplo, peroxidase de rábano, piruvato oxidase, oxaloacetato descarboxi- lase, creatinina amidohidrolase, creatina amidinohidrolase, sarcosina oxidase, malato desidrogenase, lactato desidrogenase, FAD, TPP, P- 5-P, NADH, Amplex Red). Outros componentes da mistura de análise podem ser utilizados para regular o pH, taxa de dissolução, ou a estabilidade da amostra e/ou da mistura de análise (por exemplo, hidroxi- propilmetilcelulose, hidroxipropilcelulose). À medida que a amostra passa através do elemento poroso, os microcanais fornecem a mistura da amostra e do reagente, enquanto a taxa de dissolução uniforme do reagente prevê a distribuição substancialmente uniforme do reagente que não reagiu, uma vez que flui para fora da matriz porosa e para o fluxo de canal.

[0081] Como discutido acima, os reagentes de análise podem in cluir qualquer material capaz de reagir ou ligar a um analito em uma amostra biológica como desejado. Em algumas modalidades, o reagente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a componentes na amostra, tal como um alvo específico na superfície celular na amostra. Pode haver um ou mais reagentes distintos na mistura de análise. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmentos de anticorpos podem ligar-se especificamente a alvos celulares, tais como CD14, CD4, CD45RA, CD3, ou qualquer sua combinação. Os anticor- pos ou fragmentos de anticorpo podem ser conjugados com um corante ou outro marcador detectável tal como um corante fluorescente ou partículas magnéticas. Em algumas modalidades, o marcador detectá- vel é um corante selecionado a partir do grupo compreendendo roda- mina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, boro diflúor- dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina, seus conjugados, e suas combinações. Em algumas modalidades corante pode ser ficoeritrina (PE), ficoeritrina -cianina 5 (PE-Cy5) ou aloficocianina (APC). O marcador detectável pode ser magnético, fosforescentes, fluorescentes ou opticamente ativo de qualquer forma.

[0082] Como representado na Figura 1, os dispositivos microfluídi- cos de interesse de acordo com certas modalidades incluem uma câmara capilar tendo uma geometria plana com grandes dimensões de largura e de comprimento e uma altura quer (a) substancialmente equivalente à profundidade de campo de uma lente objetiva de um detector, ou (b) apenas um pouco maior do que as células a serem analisadas em uma amostra. A amostra pode ser opticamente avaliada através de uma ou mais paredes transmissivas no dispositivo micro- fluídico. A distribuição uniforme do reagente que não reagiu na amostra fornece observações melhoradas do sinal de fundo ao longo do comprimento da parede transmissiva. Este beneficamente fornece a detecção mais fácil de reagente ligado à medida que são observadas concentrações de sinal detectável acima do sinal de fundo.

[0083] Outro exemplo de um dispositivo microfluídico 100 é ilus trado em maior detalhe nas Figuras 2A e 2B e inclui um local de aplicação 10 da amostra em comunicação fluídica com um componente poroso 20 e canal de fluxo 30. Nesta modalidade, o canal de fluxo inclui parede opticamente transmissiva 40. A porção de frita do componente poroso pode ser preparada de qualquer material adequado tal como plástico (por exemplo, polietileno, polipropileno, politetrafluoroeti- leno, fluoreto de polivinilideno, acetato de etilvinila, policarbonato, ligas de policarbonato, poliuretano, polietersulfona ou qualquer sua combinação), como discutido acima. Em algumas modalidades, a matriz porosa é de polietileno de alta densidade. A matriz porosa pode ser um sólido de qualquer tamanho ou forma que preenche uma região entre o canal de fluxo e o local de aplicação. O elemento poroso pode ser colocado em uma câmara distinta ou meramente ocupando uma região do canal capilar. As dimensões externas da frita porosa são projetadas em conjunto com o dispositivo geral de modo que a frita porosa encaixa perfeitamente no dispositivo geral e essencialmente nenhuma amostra passa ao redor da frita porosa. Em algumas modalidades, a frita porosa é integrada como parte do canal de fluxo. A frita porosa pode ser um material sólido composto por uma série de microcanais e tendo um volume de vazio compreendido entre 25 e 75%, tal como 4060% ou 45-55%. Os microcanais podem fornecer a combinação da mistura de análise e uma amostra através de uma pluralidade de trajetórias tortuosas. Em algumas modalidades, o diâmetro médio de poros dos microcanais pode ter entre 5 e 200 mícrons, tais como entre 30 e 60 mícrons; e o volume médio de vazio pode ser de 40-60% do volume total da frita. O diâmetro médio e trajetória tortuosa dos microcanais podem beneficamente fornecer a mistura da amostra e do reagente, enquanto permite que a amostra flua através do elemento poroso substancialmente não filtrada. O dispositivo pode utilizar qualquer força como a gravidade ou força centrífuga para além da força capilar para fornecer movimento da amostra através do canal de fluxo.

[0084] Sempre que os dispositivos microfluídicos em causa utili zam ação capilar, os dispositivos microfluídicos fazem-no porque as superfícies de fluxo são hidrofílicas, e molhando as superfícies é ener- geticamente favorável. Tais dispositivos necessitam a amostra que entra para deslocar o ar residente no dispositivo. É desejável que tanto a amostra aplicada, bem como o ar ventilado sejam contidos no interior do cartucho de modo a proteger os utilizadores de materiais potencialmente bio-perigosos. Em algumas modalidades da presente divulgação, qualquer combinação das seguintes características pode ser utilizada no dispositivo. Por exemplo, o canal capilar ou o local de aplicação da amostra pode incluir uma câmara de mistura onde os reagentes preservados podem ser localizados em separado do canal capilar. As dimensões do canal capilar podem ter impacto na imagem e fluxo da amostra no dispositivo. Em algumas modalidades o canal pode estar entre 2 e 10 mm de largura, tal como entre 3 e 5 mm ou entre 3 e 4 mm de largura. Em algumas modalidades, o canal capilar pode estar entre 1 e 1000 mícrons de profundidade, tal como entre 20 e 60 mí- crons de profundidade ou entre 40 e 60 mícrons de profundidade. Pro-fundidades inferiores a 60 mícrons de profundidade podem beneficamente prover para imagem de leucócitos em uma amostra de sangue total, minimizando os efeitos de obscurecimento dos eritrócitos. O canal capilar pode ser de qualquer comprimento que forneça fluxo capilar ao longo de um canal. Em algumas modalidades o canal capilar pode estar entre 10 e 100 mm de comprimento.

[0085] Como discutido acima, o dispositivo é adequado para en saios para detectar analitos em uma amostra, compreendendo um fluido biológico, tal como urina, saliva, plasma, sangue, em particular sangue total. Os componentes específicos da amostra podem ser distintamente marcados utilizando corantes fluorescentes que são distinguíveis um do outro. Desta forma, os componentes podem ser distinguidos pelas suas emissões fluorescentes.

MÉTODOS PARA ANALISAR UMA AMOSTRA

[0086] Aspectos da presente descrição incluem métodos para a análise de uma amostra. Como discutido acima, o termo "análise" é aqui utilizado no seu sentido convencional para se referir a avaliar qua- litativamente ou quantitativamente medindo a presença ou a quantidade de uma espécie do analito alvo. Uma variedade de diferentes amostras pode ser testada pelos presentes métodos. Em alguns casos, a amostra é uma amostra biológica. O termo "amostra biológica" é utilizado no seu sentido convencional para incluir um organismo inteiro, plantas, fungos ou um subconjunto de tecidos animais, células ou partes de componentes que podem, em certos casos, ser encontradas no sangue, muco, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cerebrospinal, saliva, lavado broncoalveolar, líquido amniótico, sangue do cordão amniótico, urina, fluido vaginal e sêmen. Como tal, uma "amostra bio-lógica" se refere tanto ao organismo nativo como a um subconjunto dos seus tecidos, bem como um homogeneizado, lisado ou extrato preparado do organismo ou um subconjunto dos seus tecidos, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, plasma, soro, fluido espinal, fluido linfático, seções de pele, trato respiratório, gastrointestinal, cardiovascular, e geniturinário, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, tumores, órgãos. As amostras biológicas podem ser qualquer tipo de tecido de organismos, incluindo tanto tecido normal como doente (por exemplo, canceroso, maligno, necrótico, etc.). Em certas modalidades, a amostra biológica é uma amostra líquida, tal como sangue total ou seus derivados, plasma, lágrimas, urina, sémen, etc., onde em alguns casos a amostra é uma amostra de sangue, incluindo sangue total, tal como sangue obtido de punção venosa ou picada no dedo (em que o sangue pode ou não ser combinada com quaisquer reagentes antes do ensaio, tais como conservantes, anticoagulantes, etc.).

[0087] Em certas modalidades a fonte da amostra é um "mamífe ro", onde este termo é utilizado de forma ampla para descrever organismos que se encontram dentro classe Mammalia, incluindo a ordem carnívora (por exemplo, cães e gatos), Rodentia (por exemplo, ratinhos, porquinhos da índia, e ratos), e primatas (por exemplo, seres humanos, chimpanzés e macacos). Em alguns casos, os sujeitos são seres humanos. As amostras biológicas de interesse podem ser obtidas de sujeitos humanos de ambos os sexos e em qualquer fase de desenvolvimento (isto é, neonatos, infantil, juvenil, adolescente, adulto), em que em certas modalidades o sujeito humano é um jovem, adolescente ou adulto. Embora a presente divulgação possa ser aplicada a amostras provenientes de um sujeito humano, é para ser entendido que os métodos podem também ser realizados em amostras provenientes de outros sujeitos animais (isto é, em "sujeitos não humanos"), tais como, mas não se limitando a, pássaros, ratinhos, ratos, cães, gatos, gado e cavalos.

[0088] Em modalidades, a quantidade de amostra analisada nos métodos em causa pode variar, por exemplo, variando de 0,01 μL a 1000 μL, tal como de 0,05 μL a 900 μL, tal como de 0,1 μL a 800 μL, tal como de 0,5 μL a 700 μL, tal como de 1 μL a 600 μL, tal como de 2,5 μL a 500 μL, tal como desde 5 μL a 400 μL, tal como de 7,5 μL a 300 μL e incluindo de 10 μL a 200 μL de amostra.

[0089] A amostra pode ser aplicada ao local de aplicação da amostra utilizando qualquer protocolo conveniente, por exemplo, através de conta-gotas, pipeta, seringa e semelhantes. A amostra pode ser aplicada juntamente com ou incorporado em uma quantidade de um líquido apropriado, por exemplo, tampão, para fornecer o escoamento adequado de fluido. Qualquer líquido adequado pode ser utilizado, incluindo, mas não limitado a tampões, meios de cultura de células (por exemplo, DMEM), etc. Os tampões incluem, mas não estão limitados a: tris, tricina, MOPS, HEPES, PIPES, MES, PBS, TBS e semelhante. Quando desejado, os detergentes podem estar presentes no líquido, por exemplo, os detergentes NP-40, TWEEN™ ou Tri- tonX100.

[0090] Em algumas modalidades, a amostra biológica é pré- carregada em um dispositivo microfluídico (como descrito acima) e armazenado durante um período de tempo predeterminado antes da avaliação da amostra biológica no canal de fluxo. Por exemplo, a amostra biológica pode ser pré-carregada no dispositivo microfluídico, como descrito em maior pormenor abaixo, por um período de tempo antes da amostra biológica no canal de fluxo ser avaliada de acordo com os presentes métodos. O período de tempo que a amostra biológica é armazenada após a pré-carga pode variar, tal como 0,1 horas ou mais, tal como 0,5 horas ou mais, tal como uma hora ou mais, tal como duas horas ou mais, tal como 4 horas ou mais, tal como 8 horas ou mais, tal como 16 horas ou mais, tal como 24 horas ou mais, tal como 48 horas ou mais, tal como 72 horas ou mais, tal como 96 horas ou mais, tal como 120 horas ou mais, tal como 144 horas ou mais, tal como 168 horas ou mais e, incluindo o pré-carregamento da amostra biológica no recipiente 240 horas ou mais antes de analisar a amostra biológica ou pode variar, tal como de 0,1 horas a 240 horas antes de analisar a amostra biológica, tal como de 0,5 horas a 216 horas, tal como de uma hora até 192 horas e incluindo de 5 horas até 168 horas antes de analisar a amostra biológica.

[0091] Em certas modalidades, a amostra biológica é pré- carregada no dispositivo microfluídico e a amostra no canal de fluxo é medida em um local remoto (por exemplo, um laboratório para a análise de acordo com os presentes métodos). Por "localização remota" se entende uma localização diferente da localização em que a amostra é contida e pré-carregada no interior do recipiente. Por exemplo, uma localização remota pode ser uma outra localização (por exemplo, escritório, laboratório, etc.) na mesma cidade, outra localização em uma cidade diferente, outra localização em um estado diferente, outra localização em um país diferente, etc., em relação à localização do dispositivo de processamento, por exemplo, como descrito em maior deta- lhe abaixo. Em alguns casos, duas localizações estão afastadas uma da outra, se elas são separadas uma da outra por uma distância de 10 m ou mais, tal como 50 m ou mais, incluindo 100 m ou mais, por exemplo, 500 m ou mais, 1000 m ou mais, 10.000 m ou mais, etc.

[0092] Na prática dos métodos de acordo com certas modalidades, uma amostra é posta em contato com um local de aplicação da amostra de um dispositivo microfluídico (como descrito acima), a amostra passa do local de aplicação da amostra através de um componente poroso onde a amostra se mistura com um reagente de análise em uma matriz porosa e para um canal de fluxo. Tal como resumido acima, fazer passar a amostra através do componente poroso mistura a amostra com um reagente de análise. Em algumas modalidades, a amostra passa através da matriz porosa para o canal de fluxo sem a perda de qualquer um dos componentes da amostra. Pelo termo "sem perdas" se entende que a rede de poros interligados da matriz porosa não faz restringir substancialmente a passagem de componentes da amostra através do canal de fluxo, tal como em que 99% ou mais da amostra passa através da matriz porosa para o canal de fluxo, tal como 99,5% ou mais, tal como 99,9% ou mais, tal como 99,99% ou mais, tal como 99,999% ou mais, e incluindo a passagem de 99,9999% ou mais da amostra através da matriz porosa. Em certas modalidades, toda (isto é, 100%) da amostra passa através da matriz porosa. Em outras palavras, 1% ou menos dos componentes da amostra são restritos pelos poros da matriz porosa, tal como 0,9% ou menos, tal como 0,8% ou menos, tal como 0,7% ou menos, tal como 0,5% ou menos, tal como 0,1% ou menos, tal como 0,05% ou menos, tal como 0,01% ou menos, tal como 0,001% ou menos e incluindo onde 0,0001% ou menos dos componentes da amostra são restritos pelos poros da matriz porosa. Dito de outra forma, 1% ou menos da amostra permanece na matriz porosa depois da passagem da amostra para o canal de flu- xo, tal como 0,9% ou menos, tal como 0,8% ou menos, tal como 0,7% ou menos, tal como 0,5% ou menos, tal como 0,1% ou menos, tal como 0,05% ou menos, tal como 0,01% ou menos, tal como 0,001% ou menos e incluindo 0,0001% ou menos da amostra permanece na matriz porosa depois da passagem da amostra para o canal de fluxo.

[0093] Em modalidades, fazer passar a amostra através da matriz porosa fornece a mistura da amostra com um reagente de análise na matriz porosa. Em algumas modalidades, a mistura da amostra com o reagente de análise inclui a ligação de um ou mais componentes da amostra com um membro de ligação específica ao analito. Por "ligação" se entende que o componente da amostra e o membro de ligação específica ao analito formam uma ou mais ligações físicas ou químicas entre si, incluindo, mas não limitadas a ligações por interações iônica, dipolar, hidrofóbica, coordenativa, covalente, de van der Waals ou de hidrogénio de ligação ao componente da amostra com o membro de ligação específica ao analito. Em alguns casos, a ligação do componente da amostra a um membro de ligação específica ao analito inclui ligar covalentemente o componente da amostra ao membro de ligação específica ao analito. Em certos casos, a ligação do componente da amostra a um membro de ligação específica ao analito inclui a ligação não covalente (por exemplo, através de ligação de hidrogénio) do componente da amostra ao membro de ligação específica ao analito. Por exemplo a ligação entre o membro de ligação específica ao analito e o analito alvo pode ser caracterizado por uma constante de dissociação, tal como constante de dissociação de 10-5 M ou menos, 10-6 M ou menos, tal como 10-7 M ou menos, incluindo 10-8 M ou menos, por exemplo, 10-9 M ou menos, 10-10 M ou menos, 10-11 M ou menos, 10-12 M ou menos, 10-13 M ou menos, 10-14 M ou menos, 10-15 M ou menos e incluindo 10-16 M ou menos.

[0094] Como discutido acima, os membros de ligação específica ao analito podem variar dependendo da amostra a ser analisada e os analitos alvo de interesse e podem incluir, mas não estão limitados a agentes de ligação de anticorpo, proteínas, péptidos, haptenos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos. Em algumas modalidades, o membro de ligação específica ao analito é uma enzima. Exemplos de enzimas podem ser peroxidase de rábano, piruvato oxidase, oxaloacetato descar- boxilase, creatinina amidohidrolase, creatina amidinohidrolase, sarco- sina oxidase, malato desidrogenase, lactato desidrogenase, FAD, TPP, P-5-P, NADH, Amplex Red e suas combinações.

[0095] Em certas modalidades, os métodos incluem a passagem da amostra através do componente poroso para ligação de um ou mais componentes da amostra a um agente de ligação de anticorpo. O agente de ligação de anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo policlonal ou monoclonal ou um seu fragmento suficiente para se ligar ao analito de interesse. Os fragmentos de anticorpo podem ser em alguns casos, fragmentos Fab monoméricos, fragmentos Fab' monomé- ricos ou fragmentos F(ab')2 diméricos. Também dentro do âmbito do termo "agente de ligação de anticorpo" estão moléculas produzidas por engenharia de anticorpos, tais como moléculas de anticorpo de cadeia simples (scFv) ou anticorpos humanizados ou quiméricos produzidos de anticorpos monoclonais por substituição das regiões constantes das cadeias pesada e leve para produzir anticorpos quiméricos ou substituição de ambas as regiões constantes e as porções estruturais das regiões variáveis para produzir anticorpos humanizados. Em certas modalidades, um ou mais componentes da amostra são acoplados a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a um composto, tal como CD14, CD4, CD45RA e CD3 ou uma sua combinação.

[0096] Em modalidades, o agente de ligação específica do analito pode ser acoplado a um marcador detectável, tal como marcadores radioativos, marcadores detectáveis por técnicas de espectroscopia tais como ressonância magnética nuclear, bem como marcadores opti- camente detectáveis. Em algumas modalidades, a mistura da amostra com o reagente de análise na matriz porosa inclui ligação de um ou mais componentes da amostra a um membro de ligação específica ao analito conjugados com um marcador detectável opticamente. Em certos casos, o marcador opticamente detectável é detectável por espec- troscopia de emissão, como por espectroscopia de fluorescência. Nestes casos, o marcador opticamente detectável é um fluoróforo tal como o ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2,2'dissulfônico; acridina e derivados, tal como acridina, laranja de acridina, amarelo de acridina, vermelho de acridina e isotiocianato de acridina; ácido 5-(2'- aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS); dissulfonato de 4- amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 (Amarelo Lucifer VS); N-(4- anilino-1-naftil)maleimida; antranilamida; Amarelo Brilhante; cumarina e derivados tal como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cu- marina 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumaran 151); ciani- na e seus derivados, tal como cianosina, Cy3, Cy5, Cy5.5, e Cy7; 4',6- diamidino-2-fenilindol (DAPI); 5',5''-dibromopirogalol-sulfoneftaleina (Vermelho de Bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4- metilcumarina; dietilaminocoumarina; dietilenotriamina penta acetato; ácido 4,4'-diisotioianatodidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico; ácido 4,4'- diisotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico; cloreto de 5- [dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloreto de dansilo), ácido 4-(4'- dimetilaminofenilazo)-benzóico (DABCYL); 4-dimetilaminofenilazofenil- 4'-isotiocianato (DABITC); eosina e derivados, tal como eosina e isotio- cianato de eosina; eritrosina e derivados, tais como eritrosina B e isoti- ocianato de eritrosina; etídio; fluoresceína e seus derivados, tal como 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-ila)amina fluores- ceína (DTAF), 2'7'-dimetóxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), isotiocianato de fluoresceína (FITC), clorotriazinil de fluoresceína, naf- tofluoresceína, e QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; Green Fluorescent Protein (GFP); Reff Coral Fluorescent Protein (RCFP); Lissamine™; Rodamina Lissamina, amarelo de Lúcifer; isotio- cianato de Verde Malaquita; 4-metilumbeliferona; orto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Vermelho do Nilo; Verde Oregon; Vermelho de Fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdeído; pireno e derivados, tais como pireno, butirato de pireno e butirato de succinimidil 1-pireno; Reactive Red 4 (Cibacron™ Brilliant Red 3B-A); rodamina e derivados, tais como 6-carbóxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), lissami- na 4,7-diclororodamina, cloreto de sulfonilo rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sul- forodamina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonilo de sulforodamina 101 (Vermelho Texas), N,N,N',N'-tetrametil-6- carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, e isotiocianato de te- trametil rodamina (TRITC); riboflavina; derivados do ácido rosolico e quelato térbio; xanteno ou suas combinações, entre outros fluoróforos. Em certas modalidades, o fluoróforo é um corante fluorescente, tal como rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, boro diflúor-dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina, seus conjugados, ou uma sua combinação.

[0097] Na prática dos presentes métodos, depois da amostra ter sido misturada com o reagente de análise na matriz porosa e passa para o canal de fluxo (por exemplo, por ação capilar), a amostra é iluminada no canal de fluxo com uma fonte de luz. Dependendo do tipo de amostra e dos analitos alvo a serem analisados, a amostra pode ser iluminada no canal de fluxo imediatamente após a amostra ter passado através da matriz porosa e o canal de fluxo. Em outras modalidades, a amostra é iluminada após um período de tempo predeterminado depois da amostra ser colocada em contato com os reagentes da análise na matriz porosa, tal como um período de tempo no intervalo de 10 segundos a 1 hora, tal como de 30 segundos a 30 minutos, por exemplo, 30 segundos a 10 minutos, incluindo 30 segundos a 1 minuto. A amostra pode ser iluminada com um ou mais fontes de luz. Em algumas modalidades, a amostra é iluminada com uma ou mais fontes de luz de banda larga. O termo "banda larga" é aqui utilizado no seu sentido convencional para se referir a uma fonte de luz que emite luz com um intervalo amplo de comprimentos de onda, tal como, por exemplo, abrangendo 50 nm ou mais, tal como 100 nm ou mais, tal como 150 nm ou mais, tal como 200 nm ou mais, tal como 250 nm ou mais, tal como 300 nm ou mais, tal como 350 nm ou mais, tal como 400 nm ou mais e incluindo abrangendo 500 nm ou mais. Por exemplo, uma fonte de luz de banda larga adequada emite luz tendo comprimentos de onda de 400 nm a 700 nm. Outro exemplo de uma fonte de luz de banda larga adequada inclui uma fonte de luz que emite luz tendo comprimentos de onda de 500 nm a 700 nm. Qualquer protocolo de fonte de luz de banda larga adequado pode ser utilizado, como uma lâmpada halógena, lâmpada de arco de deutério, lâmpada de arco de xênon, fonte de luz de banda larga acoplada a fibra estabilizada, um LED de banda larga de espectro contínuo, diodo superlumi- nescente emissor, diodo semicondutor emissor de luz, fonte de luz branca LED de espectro largo, uma fonte de luz branca multi-LED integrada, entre outras fontes de luz de banda larga ou qualquer sua combinação.

[0098] Em outras modalidades, a amostra é iluminada com uma ou mais fontes de luz de banda estreita que emite um comprimento de onda particular ou intervalo estreito de comprimentos de onda. O termo "banda estreita" é aqui utilizado no seu sentido convencional para se referir a uma fonte de luz que emite luz que tem uma gama estreita de comprimentos de onda, tal como por exemplo, 50 nm ou menos, tal como 40 nm ou menos, tal como 30 nm ou menos, tal como 25 nm ou menos, tal como 20 nm ou menos, tal como 15 nm ou menos, tal como 10 nm ou menos, tal como 5 nm ou menos, tal como 2 nm ou menos e incluindo fontes de luz que emitem um comprimento de onda específico de luz (isto é, luz monocromática). Qualquer protocolo de fonte de luz de banda estreita adequado pode ser utilizado, tal como um comprimento de onda LED estreito, diodo de laser ou uma fonte de luz de banda larga acoplada a um ou mais filtros passa-banda, redes de di- fração óptica, monocromadores, ou qualquer sua combinação.

[0099] Em certas modalidades, métodos incluem a irradiação da amostra no canal de fluxo com um ou mais lasers. O tipo e número de lasers irá variar dependendo da amostra, bem como luz emitida desejada recolhida e pode ser um laser a gás, tal como um laser hélio- neônio, laser de árgon, laser de crípton, laser de xenon, laser de nitrogênio, laser de CO2, laser de CO, laser de excímero de fluoreto de ar- gônio (ArF), laser de excímero de fluoreto de crípton (KrF), laser de excímero de cloreto de xenon (XeCl) ou laser de excímero de fluoreto de xenon (XeF) ou uma sua combinação. Em outros casos, os métodos incluem a irradiação da amostra no canal de fluxo com um laser de corante, tal como um laser de estilbeno, cumarina ou rodamina. Em ainda outros casos, os métodos incluem de irradiação da amostra no canal de fluxo com um laser de vapor metálico, tal como um laser de hélio-cádmio (HeCd), laser de hélio-mercúrio (HeHg), laser de hélio- selénio (HeSe), laser de hélio-prata (HeAg), laser de estrôncio, laser de neon-cobre (NeCu), laser de cobre ou laser de ouro e suas combinações. Em ainda outros casos, os métodos incluem a irradiação da amostra no canal de fluxo com um laser de estado sólido, tal como um laser de rubi, um laser Nd:YAG, laser NdCrYAG, laser Er:YAG, laser Nd:YLF, laser Nd:YVO4, laser Nd:YCa4O(BO3)3, laser Nd:YCOB, laser de titânio safira, laser túlio YAG, laser itérbio YAG, laser itérbio2O3 ou laser cério dopado e suas combinações.

[00100] Dependendo do analito a ser analisado, bem como interferentes presentes na amostra biológica, a amostra biológica pode ser iluminada usando uma ou mais fontes de luz, tal como duas ou mais fontes de luz, tal como três ou mais fontes de luz, tal como quatro ou mais luz fontes, tal como cinco ou mais fontes de luz e incluindo dez ou mais fontes de luz. Qualquer combinação de fontes de luz pode ser utilizada, conforme desejado. Por exemplo, uma primeira fonte de luz pode ser uma fonte de luz de banda larga branca (por exemplo, LED de banda larga branca) e a segunda fonte de luz pode ser uma fonte de luz de banda larga próxima de infravermelho (por exemplo, LED de banda larga próxima de IV). Em outros exemplos, onde são utilizadas duas fontes de luz, uma primeira fonte de luz pode ser uma fonte de luz de banda larga branca (por exemplo, LED de banda larga de luz branca) e a segunda fonte de luz pode ser uma fonte de luz de espectro estreito (por exemplo, um LED de luz visível de banda estreita ou próximo de IV). Em ainda outros exemplos, a fonte de luz é uma pluralidade de fontes de luz de banda estreita cada emitindo comprimentos de onda específicos, tais como uma matriz de dois ou mais LEDs, tal como uma matriz de três ou mais LEDs, tal como uma matriz de cinco ou mais LEDs, incluindo uma matriz de dez ou mais LEDs.

[00101] Quando se utiliza mais de uma fonte de luz, a amostra pode ser iluminada com as fontes de luz em simultâneo ou sequencialmente, ou uma sua combinação. Por exemplo, onde a amostra é iluminada com duas fontes de luz, os métodos em causa podem incluir simultaneamente iluminar a amostra com as duas fontes luminosas. Em outras modalidades, a amostra pode ser sequencialmente iluminada por duas fontes de luz. Quando a amostra é sequencialmente iluminada com duas ou mais fontes de luz, o tempo que cada fonte de luz ilumina a mesma pode ser independentemente 0,001 segundos ou mais, tal como 0,01 segundos ou mais, tal como 0,1 segundos ou mais, tais como 1 segundo ou mais, tal como 5 segundos ou mais, tal como 10 segundos ou mais, tal como 30 segundos ou mais e incluindo 60 segundos ou mais. Em modalidades em que a amostra é sequencialmente iluminada por duas ou mais fontes de luz, o tempo que a amostra é iluminada por cada fonte de luz pode ser o mesmo ou diferente.

[00102] O período de tempo entre a iluminação por cada fonte de luz pode também variar, como desejado, sendo separado independentemente por um atraso de 1 segundo ou mais, tal como 5 segundos ou mais, tal como por 10 segundos ou mais, tal como por 15 segundos ou mais, tal como por 30 segundos ou mais e incluindo por 60 segundos ou mais. Em modalidades em que a amostra é sequencialmente iluminada por mais do que duas fontes de luz (isto é, três ou mais), o atraso entre a iluminação por cada fonte de luz pode ser o mesmo ou diferente.

[00103] Dependendo do protocolo de análise, a iluminação da amostra pode ser contínua ou em intervalos específicos. Por exemplo, em algumas modalidades, a amostra pode ser iluminada continuamente ao longo de todo o tempo que a amostra está a ser analisada. Quando a luz inclui duas ou mais fontes de luz, a amostra pode ser continuamente iluminada por todas as fontes de luz em simultâneo. Em outros casos, a amostra é iluminada continuamente com cada fonte de luz sequencialmente. Em outras modalidades, a amostra pode ser iluminada a intervalos regulares, tal como iluminar a amostra cada 0,001 microsegundos, cada 0,01 microssegundos, cada 0,1 microse- gundos, cada 1 microssegundo, cada 10 microssegundos, cada 100 microssegundos e incluindo cada 1000 microssegundos. A amostra pode ser iluminada com a fonte de luz uma ou mais vezes em qualquer determinado período de medição, tal como 2 ou mais vezes, tal como 3 ou mais vezes, incluindo 5 ou mais vezes em cada período de medição.

[00104] Dependendo da fonte de luz e as características do canal de fluxo (por exemplo, a largura do canal de fluxo), o canal de fluxo pode ser irradiado de uma distância que varia, tal como 1 mm ou mais do canal de fluxo, tal como 2 mm ou mais, tal como 3 mm ou mais, tal como 4 mm ou mais, tal como 5 mm ou mais, tal como 10 mm ou mais, tal como 15 mm ou mais, tal como 25 mm ou mais e incluindo 50 mm ou mais do canal de fluxo. Além disso, o ângulo a que o canal de fluxo é irradiado pode também variar, oscilando de 10° a 90°, tal como de 15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75° e incluindo de 30° a 60°. Em certas modalidades, o canal de fluxo é irradiado pela fonte de luz em um ângulo de 90° em relação ao eixo do canal de fluxo.

[00105] Em certas modalidades, a irradiação do canal de fluxo inclui mover uma ou mais fontes de luz (por exemplo, lasers) ao longo do eixo longitudinal do canal de fluxo. Por exemplo, a fonte de luz pode ser movida a montante ou a jusante ao longo do eixo longitudinal do canal de fluxo irradiando o canal de fluxo ao longo de um comprimento predeterminado do canal de fluxo. Por exemplo, os métodos podem incluir mover a fonte de luz ao longo do eixo longitudinal do canal de fluxo por 1 mm ou mais, tal como 2,5 mm ou mais, tal como 5 mm ou mais, tal como 10 mm ou mais, tal como 15 mm ou mais, tal como 25 mm ou mais e incluindo 50 mm ou mais do canal de fluxo. A fonte de luz pode ser movida continuamente ou em intervalos específicos. Em algumas modalidades, a fonte de luz é movida continuamente. Em outras modalidades, a fonte de luz é movida ao longo do eixo longitudinal do canal de fluxo em intervalos específicos, tal como, por exemplo, em incrementos de 0,1 mm ou mais, tal como incrementos de 0,25 mm ou mais e incluindo 1 mm e incrementos maiores.

[00106] Ao pôr em prática os métodos de acordo com aspectos da presente divulgação, a luz emitida da amostra no canal de fluxo é medida a um ou mais comprimentos de onda. Em modalidades, a luz emitida é medida em um ou mais comprimentos de onda, tal como em 5 ou mais comprimentos de onda diferentes, tal como a 10 ou mais diferentes comprimentos de onda, tal como a 25 ou mais diferentes comprimentos de onda, tal como a 50 ou mais diferentes comprimentos de onda, tais como em 100 ou mais comprimentos de onda diferentes, tais como a 200 ou mais comprimentos de onda diferentes, tais como a 300 ou mais comprimentos de onda diferentes e incluindo medição da luz emitida da amostra no canal de fluxo a 400 ou mais comprimentos de onda diferentes.

[00107] Em algumas modalidades, a medição da luz emitida da amostra no canal de fluxo inclui a medição da luz emitida ao longo de um intervalo de comprimentos de onda (por exemplo, 200 nm - 800 nm). Por exemplo, os métodos podem incluir a medição da luz emitida da amostra no canal de fluxo sobre um ou mais dos intervalos de comprimentos de onda: 200 nm - 800 nm; 400 nm - 500 nm; 500 nm - 600 nm; 600 nm - 700 nm; 700 nm - 800 nm; 550 nm - 600 nm; 600 nm - 650 nm; 650 nm - 700 nm e qualquer uma porção ou suas combinações. Em um exemplo, os métodos incluem a medição da luz emitida da amostra no canal de fluxo ao longo dos comprimentos de onda que variam de 200 nm - 800 nm. Em outro exemplo, métodos incluem a medição da luz emitida da amostra no canal de fluxo ao longo dos comprimentos de onda que variam de 500 nm - 600 nm e 650 nm - 750 nm. Em certos casos, os métodos incluem a medição da luz emitida da amostra no canal de fluxo a 575 nm, 660 nm e 675 nm, ou uma sua combinação.

[00108] A medição da luz emitida da amostra no canal de fluxo ao longo de um intervalo de comprimentos de onda, em certos casos, inclui a recolha de espectros da luz emitida ao longo do intervalo de comprimentos de onda. Por exemplo, os métodos podem incluir a recolha de espectros de luz emitida da amostra no canal de fluxo sobre um ou mais dos intervalos de comprimentos de onda: 200 nm - 800 nm; 400 nm - 500 nm; 500 nm - 600 nm; 600 nm - 700 nm; 700 nm - 800 nm; 550 nm - 600 nm; 600 nm - 650 nm; 650 nm - 700 nm e qualquer porção ou suas combinações. Em um exemplo, os métodos incluem a recolha de espectros de luz emitida da amostra no canal de fluxo ao longo dos comprimentos de onda que variam de 400 nm - 800 nm. Em um outro exemplo, os métodos incluem a recolha de espectros de luz emitida da amostra no canal de fluxo ao longo dos comprimentos de onda que variam de 500 nm - 700 nm.

[00109] Em certas modalidades, a luz emitida da amostra no canal de fluxo é detectada em um ou mais comprimentos de onda específicos. Por exemplo, os métodos podem incluir a detecção de luz emitida da amostra no canal de fluxo em 2 ou mais comprimentos de onda específicos, tal como a 3 ou mais comprimentos de onda específicos, tal como em 4 ou mais comprimentos de onda específicos, tal como a 5 ou mais comprimentos de onda específicos, tal como a 10 ou mais comprimentos de onda específicos e incluindo a detecção de luz emitida da amostra no canal de fluxo em 25 ou mais comprimentos de onda específicos. Em certas modalidades, a luz emitida é detectada a 575 nm. Em outras modalidades, a luz emitida é detectada a 660 nm. Em ainda outras modalidades, a luz emitida é detectada a 675 nm.

[00110] Dependendo do protocolo de análise específica, a luz emitida da amostra no canal de fluxo pode ser medida continuamente ou em intervalos específicos. Por exemplo, em algumas modalidades, a medição da luz emitida é contínua ao longo de todo o tempo que a amostra está a ser analisada. Quando a medição da luz emitida inclui medição de dois ou mais comprimentos de onda ou intervalos de comprimentos de onda, os comprimentos de onda ou intervalos de com- primentos de onda podem ser todos medidos simultaneamente, ou cada comprimento de onda ou intervalo de comprimentos de onda podem ser medidas sequencialmente.

[00111] Em outras modalidades, a luz emitida é medida em intervalos específicos, tais como a medição da luz emitida da amostra no canal de fluxo a cada 0,001 microsegundos, a cada 0,01 microssegun- dos, a cada 0,1 microsegundos, a cada 1 microssegundo, a cada 10 microssegundos, a cada 100 microssegundos e incluindo a cada 1000 microssegundos. A luz emitida da amostra no canal de fluxo pode ser medida uma ou mais vezes durante os métodos em causa, tal como duas ou mais vezes, tal como 3 ou mais vezes, tal como 5 ou mais vezes e que inclui 10 ou mais vezes.

[00112] A luz emitida da amostra no canal de fluxo pode ser medida por qualquer protocolo conveniente de detecção de luz, incluindo, mas não limitado a sensores ou fotodetectores ópticos, tal como sensores de pixels ativos (APS), fotodíodos de avalanche, sensores de imagem, dispositivos de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada intensificada (ICCD), diodos emissores de luz, contadores de fótons, bolómetros, detectores piroelétricos, fotoresistências, células fotovol- taicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransistores, fotocon- dutores ou fotodiodos de pontos quânticos e suas combinações, entre outros fotodetectores. Em certas modalidades, a luz emitida é medida com um dispositivo de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada semicondutora (CCD), os sensores de pixels ativos (APS), sensores de imagem semicondutores complementares de óxido metálico (CMOS) ou sensores de imagem do tipo N de semicondutor de óxido de metal (NMOS). Em certas modalidades, a luz é medida com um dispositivo de carga acoplada (CCD). Quando a luz transmitida é medida com um CCD, a área da superfície de detecção ativa do CCD pode variar, tal como de 0,01 cm2 a 10 cm2, tal como de 0,05 cm2 a 9 cm2, tal como de 0,1 cm2 a 8 cm2, tal como de 0,5 cm2 a 7 cm2 e incluindo de 1 cm2 a 5 cm2.

[00113] Em algumas modalidades, os métodos incluem ajustar opti- camente a luz emitida do canal de fluxo. Por exemplo, a luz emitida pode ser passada através de uma ou mais lentes, espelhos, furos, fendas, grelhas, refratores de luz, e quaisquer suas combinações. Em alguns casos, a luz emitida passa através de uma ou mais lentes de focagem, de modo a reduzir o perfil da luz propagada sobre a superfície ativa do detector. Em outros casos, a luz emitida passa através de uma ou mais lentes de redução, tal como para aumentar o perfil da luz propagada sobre a superfície ativa do detector. Em ainda outros casos, os métodos incluem colimar a luz. Por exemplo, a luz emitida pode ser colimada pela passagem da luz através de uma ou mais lentes de colimação ou espelhos colimados ou uma sua combinação.

[00114] Em certas modalidades, os métodos incluem a passagem da luz emitida recolhida do canal de fluxo através de fibras ópticas. Protocolos de fibra óptica adequados para propagação da luz do canal de fluxo para a superfície ativa de um detector inclui, mas não está limitado a protocolos de fibras ópticas tais como os descritos na Patente dos Estados Unidos N°. 6,809,804, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.

[00115] Em certas modalidades, os métodos incluem a passagem da luz emitida através de um ou mais separadores de comprimentos de onda. A separação de comprimentos de onda, de acordo com certas modalidades, pode incluir passar ou bloquear seletivamente comprimentos de onda ou intervalos de comprimentos de onda da luz policromática. Para separar comprimentos de onda de luz, a luz transmitida pode ser passada através de qualquer protocolo de separação de comprimentos de onda adequado, incluindo, mas não limitado a vidro colorido, filtros passa-banda, filtros de interferência, espelhos dicroi- cos, redes de difração, monocromadores e suas combinações, entre outros protocolos de separação de comprimentos de onda.

[00116] Em outras modalidades, os métodos incluem a separação dos comprimentos de onda da luz passando a luz emitida do canal de fluxo por meio de um ou mais filtros ópticos, tal como um ou mais filtros passa-banda. Por exemplo, filtros ópticos de interesse podem incluir filtros passa-banda tendo larguras de banda mínimas que variam de 2 nm a 100 nm, tal como de 3 nm a 95 nm, tal como de 5 nm a 95 nm, tal como de 10 nm a 90 nm, tal a partir de 12 nm a 85 nm, tal como de 15 nm a 80 nm e incluindo filtros passa-banda com larguras de banda mínimas que variam de 20 nm a 50 nm.

[00117] Em certas modalidades, o ensaio de fluorescência em causa pode incluir métodos de imagem de amostras nos canais capilares, tal como aqueles descritos no Pedido de Patente EUA N°s. 8.248.597; 7.927.561 e 7.738.094, bem como os descritos no Pedido de Patente co-pendente EUA N°s. 13/590,114 depositado em 20 de agosto, 2012, 61/903,804 depositado em 13 de novembro, 2013 e 61/949,833 depositado em 7 de março, 2014, cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

[00118] Em certas modalidades, os métodos incluem a captura de uma imagem do canal de fluxo. A captura uma ou mais imagens do canal de fluxo pode incluir iluminar o canal de fluxo com uma ou mais fontes de luz (como descrito acima) e a captura da imagem com um dispositivo de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada semicondutora (CCD), os sensores de pixels ativos (APS), sensores de imagem semicondutores complementares de óxido metálico (CMOS) ou sensores de imagem do tipo N de semicondutor de óxido de metal (NMOS). As imagens do canal de fluxo podem ser capturadas continuamente ou em intervalos específicos. Em alguns casos, os métodos incluem a captura de imagens continuamente. Em outros ca- sos, os métodos incluem a captura imagens em intervalos específicos, tal como a captura de uma imagem do canal de fluxo a cada 0,001 mi- lissegundos, a cada 0,01 milissegundos, a cada 0,1 milissegundos, a cada 1 milissegundos, a cada 10 milissegundos, a cada 100 milisse- gundos e incluindo cada 1000 milissegundos, ou algum outro intervalo. Onde as imagens do canal de fluxo são capturadas com um detector de câmara CCD, a área da superfície de detecção ativa do CCD pode variar, tal como de 0,01 cm2 a 10 cm2, tal como de 0,05 cm2 a 9 cm2, tal como de 0,1 cm2 a 8 cm2, tal como de 0,5 cm2 a 7 cm2 e incluindo de 1 cm2 a 5 cm2.

[00119] Toda ou parte do canal de fluxo pode ser captado em cada imagem, tal como 5% ou mais do canal de fluxo, tais como 10% ou mais, tal como 25% ou mais, tal como 50% ou mais, tal como 75% ou mais, tal como 90% ou mais, tal como 95% ou mais e incluindo 99% ou mais do canal de fluxo pode ser captado em cada imagem. Em certas modalidades, o canal de fluxo de todo é captado em cada imagem. Uma ou mais imagens podem ser captadas, conforme desejado, tal como 2 ou mais imagens, tal como 3 ou mais imagens, tal como 5 ou mais imagens, tal como 10 ou mais imagens, tal como 25 ou mais imagens e incluindo 100 ou mais imagens. Quando mais do que uma imagem é captada do canal de fluxo, a pluralidade de imagens pode ser automaticamente colocada em conjunto ou uma média por um processador com algoritmo de processamento de imagem digital.

[00120] As imagens do canal de fluxo podem ser capturadas em qualquer distância adequada do canal de fluxo, desde que uma imagem útil do canal de fluxo é capturada. Por exemplo, as imagens do canal de fluxo podem ser capturadas a 0,01 mm ou mais do canal de fluxo, tal como 0,05 mm ou mais, tal como 0,1 mm ou mais, tal como 0,5 mm ou mais, tal como 1 mm ou mais, tal como 2,5 mm ou mais, tal como 5 mm ou mais, tal como 10 mm ou mais, tal como 15 mm ou mais, tal como 25 mm ou mais e incluindo 50 mm ou mais do canal de fluxo de citometria de fluxo. As imagens do canal fluxo também podem ser capturadas em qualquer ângulo em relação ao canal de fluxo. Por exemplo, as imagens do canal de fluxo podem capturadas com um ângulo em relação ao eixo longitudinal do canal de fluxo que varia de 10° a 90°, tal como de 15° a 85°, tal como de 20° a 80°, tal como de 25° a 75°, inclusive de 30° a 60°. Em certas modalidades, as imagens do canal de fluxo são capturadas em um ângulo de 90° em relação ao eixo longitudinal do canal de fluxo.

[00121] Em algumas modalidades, captando imagens do canal de fluxo inclui mover um ou mais sensores de imagem ao longo da trajetória do fluxo. Por exemplo, o sensor de imagem pode ser movido a montante ou a jusante, juntamente com o fluxo de captura de imagens em uma pluralidade de campos de detecção. Por exemplo, os métodos podem incluir a captura de imagens da corrente de escoamento em dois ou mais domínios de detecção diferentes, tal como 3 ou mais domínios de detecção, tal como 4 ou mais campos e incluindo 5 ou mais campos de detecções de detecção. O sensor de imagem pode ser movido continuamente ou em intervalos específicos. Em algumas mo-dalidades, o sensor de imagem é movido continuamente. Em outras modalidades, o sensor de imagem pode ser movido ao longo da trajetória do fluxo em intervalos específicos, tal como, por exemplo, em incrementos de 1 mm ou mais, tal como incrementos de 2 mm ou mais e incluindo incrementos de 5 mm ou mais.

[00122] Em certas modalidades, os métodos incluem a redução do sinal de fundo de imagens captadas do canal de fluxo. Nestas modalidades, os métodos incluem a captura de uma imagem do canal de fluxo com membros de ligação específicos ao analito opticamente marcados não ligados (isto é, reagente de análise não misturado com a amostra) e redução (por exemplo, subtraindo) do sinal de fundo das imagens captadas da amostra no canal de fluxo. Em alguns casos, os métodos incluem a captura de uma imagem da amostra no canal de fluxo, determinação do sinal de fundo de membros de ligação específica ao analito opticamente marcados não ligados e redução o sinal de fundo da imagem captada da amostra no canal de fluxo. Em modalidades da presente divulgação, o sinal de fundo pode ser determinado uma ou mais vezes, tal como duas ou mais vezes, tal como 3 ou mais vezes, tal como 5 ou mais vezes e incluindo 10 ou mais vezes. Quando desejado, pode ser feita a média do sinal de fundo para fornecer uma média de sinal de fundo. Em certas modalidades, a determinação do sinal de fundo inclui a captura uma ou mais imagens do canal de fluxo na ausência de amostra.

[00123] Dependendo dos reagentes de análise, o reagente não ligado no canal de fluxo é substancialmente constante. Em outras palavras, a distribuição de reagente não ligado presente no canal de fluxo é homogéneo e a variação na quantidade de reagente não ligado em diferentes regiões do canal de fluxo varia por 10% ou menos, tal como por 5% ou menos, tal como por 4% ou menos, tal como por 3% ou menos, tal como por 2% ou menos, tal como por 1% ou menos, tal como por 0,5% ou menos e que inclui por 0,1% ou menos. Logo, o sinal de fundo varia ao longo do eixo longitudinal do canal de fluxo por 10% ou menos, tal como por 5% ou menos, tal como por 4% ou menos, tal como por 3% ou menos, tal como por 2% ou menos, tal como por 1% ou menos, tal como por 0,5% ou menos e que inclui por 0,1% ou menos. Em certas modalidades, os métodos incluem a redução do sinal de fundo da imagem captada da amostra no canal de fluxo, onde o sinal de fundo varia por 10% ou menos, tal como por 5% ou menos, tal como por 4% ou menos, tal como por 3% ou menos, tal como por 2% ou menos, tal como por 1% ou menos, tal como por 0,5% ou menos, e incluindo por 0,1% ou menos ao longo do eixo longitudinal do canal de fluxo.

[00124] Tal como ilustrado nas Figuras 1 e 2A-B, os dispositivos microfluídicos de interesse podem ser utilizados para detectar concentrações serológicos de anticorpos humanos em volumes de punção do dedo (5-50 μL) de sangue total em um formato não lavado. Em algumas modalidades específicas, os métodos incluem a aplicação de uma amostra de líquido no local de aplicação da amostra e orientar o fluxo da amostra através de força capilar para o elemento poroso. À medida que a amostra entra no elemento poroso uma preparação de reagentes se dissolve na amostra a uma taxa substancialmente contínua. A mistura de análise pode compreender um reagente opticamente ativo para a marcação específica do componente da amostra e um conjunto de componentes de tampão que fornecem a dissolução contínua do reagente na amostra. Em algumas modalidades os componentes do tampão podem compreender albumina de soro bovino (BSA), trealose (tal como trealose D+), polivinilpirrolidona (PVP) ou qualquer sua combinação. O reagente opticamente ativo pode ser qualquer marcador detectável tal como um conjugado de anticorpo marcado por fluorescência. O tampão e amostra podem ser misturados no elemento poroso através de mistura passiva através de uma rede de trajetórias tortuosas no elemento poroso resultante em reagente que está ligado a componentes da amostra e reagente não ligado. A amostra marcada com um marcador detectável pode em seguida ser avaliado como discutido acima, tal como opticamente ou magneticamente ao longo do canal capilar do dispositivo microfluídico. Em algumas modalidades, a amostra pode ser avaliada através da obtenção de um sinal ou imagem da amostra através de uma parede transmissiva. O processamento de sinal pode incluir subtrair um sinal de fundo do reagente não ligado. A quantidade de reagente não ligado ao longo da parede trans- missiva pode ser substancialmente constante. Em algumas modalida- des a quantidade de reagente não ligado varia menos do que 50%, 40%, 30%, 20%, ou 10%, ao longo da parede transmissiva, beneficamente fornecendo detecção melhorada para o reagente ligado a componentes da amostra. A detecção pode compreender subtração de sinais ópticos de fundo e observar o número, propriedades ópticas, morfológica ou configuração dos sinais para além do sinal de fundo.

SISTEMAS PARA ANÁLISE DE UMA AMOSTRA PARA UM ANALITO

[00125] Os aspectos da presente invenção incluem ainda sistemas para a prática dos presentes métodos. Em modalidades, os sistemas que incluem um ou mais dos presentes microcanais e sistema de avaliação óptica com uma fonte de luz, e um detector para detecção de um ou mais comprimentos de onda de luz emitida pela amostra no canal de fluxo são fornecidos. Em certas modalidades, os sistemas incluem adicionalmente um ou mais dos presentes microcanais integrados diretamente no sistema de avaliação óptica.

[00126] Tal como resumido acima, aspectos da presente invenção incluem análise de uma amostra para um ou mais analitos. Os sistemas incluem uma ou mais fontes de luz para avaliação de um canal de fluxo que contém uma amostra de interesse misturada com um reagente de análise. Em algumas modalidades, a fonte de luz é uma fonte de luz de banda larga, emitindo luz que tem um intervalo amplo de comprimentos de onda, tais como por exemplo, abrangendo 50 nm ou mais, tal como 100 nm ou mais, tal como 150 nm ou mais, tal como 200 nm ou mais, tal como 250 nm ou mais, tal como 300 nm ou mais, tal como 350 nm ou mais, tal como 400 nm ou mais e incluindo abran-gendo 500 nm ou mais. Por exemplo, uma fonte de luz de banda larga adequada emite luz com comprimentos de onda de 200 nm a 800 nm. Qualquer protocolo de fonte de luz de banda larga adequado pode ser utilizado, como uma lâmpada halógena, lâmpada de arco de deutério, lâmpada de arco de xênon, fonte de luz de banda larga acoplada a fibra estabilizada, um LED de banda larga de espectro contínuo, diodo superluminescente emissor, diodo semicondutor emissor de luz, fonte de luz branca LED de espectro largo, uma fonte de luz branca multiLED integrada, entre outras fontes de luz de banda larga ou qualquer sua combinação.

[00127] Em outras modalidades, a fonte de luz é uma fonte de luz de banda estreita que emite um comprimento de onda particular ou intervalo estreito de comprimentos de onda. Em alguns casos, as fontes de luz de banda estreita emitem luz com um intervalo estreito de comprimentos de onda, tais como por exemplo, 50 nm ou menos, tal como 40 nm ou menos, tal como 30 nm ou menos, tal como 25 nm ou menos, tal como 20 nm ou menos, tal como 15 nm ou menos, tal como 10 nm ou menos, tal como 5 nm ou menos, tal como 2 nm ou menos e incluindo fontes de luz que emitem um comprimento de onda específico de luz (isto é, luz monocromática). Qualquer protocolo de fonte de luz de banda estreita adequado pode ser utilizado, tal como um comprimento de onda LED estreito, diodo de laser ou uma fonte de luz de banda larga acoplada a um ou mais filtros passa-banda, redes de di- fração óptica, monocromadores, ou qualquer sua combinação. Em certas modalidades, a fonte de luz de banda estreita é um laser, tal como um laser a gás, tal como um laser hélio-neônio, laser de árgon, laser de crípton, laser de xenon, laser de nitrogênio, laser de CO2, laser de CO, laser de excímero de fluoreto de argônio (Arf), laser de excímero de fluoreto de crípton (KrF), laser de excímero de cloreto de xenon (XeCl) ou laser de excímero de fluoreto de xenon (XeF) ou uma sua combinação. Em outros casos, os métodos incluem a irradiação da amostra no canal de fluxo com um laser de vapor metálico, tal como um laser de hélio-cádmio (HeCd), laser de hélio-mercúrio (HeHg), laser de hélio-selénio (HeSe), laser de hélio-prata (HeAg), laser de es- trôncio, laser de neon-cobre (NeCu), laser de cobre ou laser de ouro ou um laser de estado sólido, tal como um laser de rubi, um laser Nd:YAG, laser NdCrYAG, laser Er:YAG, laser Nd:YLF, laser Nd:YVO4, laser Nd:YCa4O(BO3)3, laser Nd:YCOB, laser de titânio safira, laser túlio YAG, laser itérbio YAG, laser itérbio2O3 ou laser cério dopado e suas combinações.

[00128] Os sistemas em causa podem incluir uma ou mais fontes de luz, como desejado, tal como duas ou mais fontes de luz, tal como três ou mais fontes de luz, tal como quatro ou mais fontes de luz, tal como cinco ou mais fontes de luz e incluindo dez ou mais fontes de luz. Em modalidades, as fontes de luz emitem luz que têm comprimentos de onda que variam de 200 nm a 1000 nm, tal como de 250 nm a 950 nm, tal como de 300 nm a 900 nm, tal como de 350 nm a 850 nm e incluindo de 400 nm a 800 nm.

[00129] Tal como resumido acima, os presentes sistemas são configurados para receber um dispositivo microfluídico com um local de aplicação da amostra, um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra e um componente poroso que tem uma matriz porosa e um reagente de análise posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo. Nestas modalidades, os sistemas podem também incluir um suporte de cartucho para receber o microfluidos no presente sistema. Por exemplo, o suporte de cartucho pode incluir um suporte para receber o dispositivo microfluídico de cartucho e um ou mais retentores do cartucho para manter o dispositivo microfluídico de cartucho no suporte do cartucho. Em alguns casos, o suporte de cartucho inclui amortecedores de vibrações para reduzir a agitação do dispositivo microfluídico de cartucho posicionado no suporte de cartucho, bem como uma ou mais referências de presença de cartucho configuradas para indicar que um dispositivo micro- fluídico de cartucho está presente no suporte do cartucho.

[00130] Em algumas modalidades, os sistemas incluem um cartucho de transporte acoplado ao suporte do cartucho para mover o dispositivo microfluídico para dentro e para fora do sistema de avaliação. Em algumas modalidades, o cartucho de transporte é acoplado a um ou mais protocolos de conversão ou movimento lateral para mover o dispositivo microfluídico. Por exemplo, o cartucho de transporte pode ser acoplado a uma plataforma de conversão acionada mecanicamente, montagem de parafuso de avanço mecânico, dispositivo de corrediça mecânica, dispositivo de movimento lateral mecânico, dispositivo de conversão adaptado operado mecanicamente, uma plataforma de conversão acionada com motor, montagem de parafuso de avanço mecânico, dispositivo de corrediça mecânica, tais como aqueles que empregam um motor de passo, motor servo, motor eléctrico sem escovas, motor DC escovado, acionamento de motor de micro-passo, motor de passo de alta resolução, entre outros tipos de motores. Os sistemas podem também incluir um conjunto de calhas de transporte para o posicionamento do cartucho para facilitar o movimento lateral do suporte de cartucho.

[00131] Como descrito acima, a luz emitida pela amostra no canal de fluxo é recolhida e detectada usando um ou mais fotodetectores. Em certas modalidades, os sistemas incluem um ou mais lentes objetivas para recolher a luz emitida do canal de fluxo. Por exemplo, a lente objetiva pode ser uma lente de aumento com uma ampliação nominal que varia entre 1,2 e 5, tal como uma ampliação nominal de 1,3 a 4,5, tal como uma ampliação nominal de 1,4 a 4, tal como uma ampliação nominal de 1,5 a 3,5, tal como uma ampliação nominal de 1,6 a 3, incluindo a passagem da luz transmitida através de uma lente de ampliação com uma ampliação nominal de 1,7 a 2,5. Dependendo da configuração da fonte de luz, câmara de amostra e detector, as propriedades da lente objetiva podem variar. Por exemplo, a abertura numérica da lente objetiva em causa pode também variar, oscilando de 0,01 a 1,7, tal como de 0,05 a 1,6, tal como de 0,1 a 1,5, tal como de 0,2 a 1,4, tal como de 0,3 a 1,3, tal como de 0,4 a 1,2, tal como de 0,5 a 1,1 e incluindo uma abertura numérica oscilando de 0,6 a 1,0. Da mesma forma, a distância focal da lente objetiva varia, oscilando de 10 mm a 20 mm, tal como de 10,5 mm a 19 mm, tal como de 11 mm a 18 mm e incluindo de 12 mm a 15 mm.

[00132] Em algumas modalidades, a lente objetiva é acoplada a um módulo de focagem para focar a projeção do feixe em forma de fenda transmitido através da câmara de amostra para o detector para detecção. Por exemplo, um módulo de focagem automática adequado para a focagem da projeção do feixe em forma de fenda transmitido através da amostra pode incluir, mas não se limita, ao descrito na Patente dos Estados Unidos No. 6,441,894, depositada em 29 de outubro, 1999, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência.

[00133] Sistemas da presente divulgação podem também incluir um ou mais separadores de comprimento de onda. O termo "separador de comprimentos de onda" é aqui utilizado no seu sentido convencional para se referir a um protocolo óptico para a separação de luz policromática em seus elementos de comprimentos de onda de tal modo que cada comprimento de onda pode ser convenientemente detectado. Exemplos de separadores de comprimento de onda adequados nos sistemas em causa podem incluir, mas não estão limita-dos a vidro colorido, filtros passa-banda, filtros de interferência, espelhos dicroicos, redes de difração, monocromadores e suas combinações, entre outros protocolos de separação de comprimentos de onda. Dependendo da fonte de luz e a amostra a ser analisada, os sistemas podem incluir um ou mais separadores de comprimento de onda, tal como dois ou mais, tal como três ou mais, tal como quatro ou mais, tal como cinco ou mais e incluindo 10 ou mais separadores de comprimento de onda. Em um exemplo, os sistemas incluem dois ou mais filtros passa-banda. Em outro exemplo, os sistemas incluem dois ou mais filtros passa-banda e uma rede de difração. Em ainda outro exemplo, os sistemas incluem uma pluralidade de filtros passa- banda e um monocromador. Em certas modalidades, os sistemas incluem uma pluralidade de filtros passa-banda e redes de difração configurados em uma configuração de roda de filtro. Quando os sistemas incluem dois ou mais separadores de comprimento de onda, o separador de comprimento de onda pode ser utilizado individualmente ou em série para separar a luz policromática em comprimentos de onda que o compõem. Em algumas modalidades, os separadores de comprimento de onda são dispostos em série. Em outras modalidades, os separadores de comprimento de onda são dispostos individu-almente.

[00134] Em algumas modalidades, os sistemas incluem uma ou mais redes de difração. Redes de difração de interesse podem incluir, mas não se limitam a redes de difração de transmissão, dispersiva ou refletora. Espaçamentos apropriados da rede de difração podem variar oscilando de 0,01 μm a 10 μm, tal como de 0,025 μm a 7,5 μm, tal como de 0,5 μm a 5 μm, tal como de 0,75 μm a 4 μm, tal como de 1 μm a 3,5 μm e incluindo de 1,5 μm e 3,5 μm.

[00135] Em algumas modalidades, os sistemas incluem um ou mais filtros ópticos. Em certos casos, os sistemas incluem filtros passa- banda com larguras de banda mínimas que variam de 2 nm a 100 nm, tal como de 3 nm a 95 nm, tal como de 5 nm a 95 nm, tal como de 10 nm a 90 nm, tal como de 12 nm a 85 nm, tal como de 15 nm a 80 nm e incluindo filtros passa-banda com larguras de banda mínimas que variam de 20 nm a 50 nm.

[00136] Os sistemas da presente divulgação também incluem um ou mais detectores. Exemplos de detectores apropriados podem in- cluir, mas não estão limitados a sensor óptico ou fotodetectores, tais como sensores de pixel ativo (APS), fotodiodos de avalanche, sensores de imagem, dispositivos de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada intensificada (ICCD), diodos emissores de luz, contadores de fótons, bolómetros, detectores piroelétricos, fotoresistências, células fotovoltaicas, fotodiodos, tubos fotomultiplicadores, fototransis- tores, fotocondutores ou fotodiodos de pontos quânticos e suas combinações, entre outros fotodetectores. Em certas modalidades, a luz transmitida é medida com um dispositivo de carga acoplada (CCD). Quando a luz transmitida é medida com um CCD, a área da superfície de detecção ativa do CCD pode variar, tal como de 0,01 cm2 a 10 cm2, tal como de 0,05 cm2 a 9 cm2, tal como de 0,1 cm2 a 8 cm2, tal como de 0,5 cm2 a 7 cm2 e incluindo de 1 cm2 a 5 cm2.

[00137] Em algumas modalidades, os sistemas incluem uma ou mais câmaras ou sensores de câmara para capturar uma imagem do canal de fluxo. Câmaras adequadas para a captura de uma imagem do fluxo incluem, mas não estão limitadas a dispositivo de carga acoplada (CCD), dispositivos de carga acoplada semicondutora (CCD), os sensores de pixels ativos (APS), sensores de imagem semicondutores complementares de óxido metálico (CMOS) ou sensores de imagem do tipo N de semicondutor de óxido de metal (NMOS).

[00138] Em modalidades da presente invenção, os detectores de interesse são configurados para medir a luz emitida do canal de fluxo em um ou mais comprimentos de onda, tal como a 2 ou mais comprimentos de onda, tal como a 5 ou mais comprimentos de onda diferentes, tal como a 10 ou mais comprimentos de onda diferentes, tal como a 25 ou mais comprimentos de onda diferentes, tal como a 50 ou mais comprimentos de onda diferentes, tal como a 100 ou mais comprimentos de onda diferentes, tal como a 200 ou mais comprimentos de onda diferentes, tal como a 300 ou mais comprimentos de onda diferentes e incluindo a medição da luz transmitida através da câmara de amostra a 400 ou mais comprimentos de onda diferentes.

[00139] Em modalidades, o detector pode ser configurado para medir a luz continuamente ou em intervalos específicos. Em alguns casos, os detectores de interesse são configurados para medir a luz continuamente. Em outros casos, os detectores de interesse são configurados para fazer medições em intervalos específicos, tal como medição de luz a cada 0,001 milissegundo, a cada 0,01 milissegundo, a cada 0,1 milissegundo, a cada 1 milissegundo, a cada 10 milissegun- do, a cada 100 milissegundo e incluindo a cada 1000 milissegundo, ou algum outro intervalo.

[00140] Em certas modalidades, a luz emitida pela amostra no canal de fluxo é medida com um sistema de imagem tal como os descritos no Pedido de Patente EUA Nos. 8.248.597; 7.927.561; 7.738.094 e no Pedido de Patente co-pendente EUA Nos. 13/590,114 depositado em 20 de agosto, 2012, 61/903,804 depositado em 13 de novembro, 2013 e 61/949,833 depositado em 7 de março, 2014, cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

[00141] Em certos casos, os sistemas de interesse incluem um ou mais dos presentes dispositivos microfluídicos (tal como descrito acima) integrados no sistema de imagem. Logo, nestas modalidades, os sistemas em causa são não configurados para receber um dispositivo microfluídico descrito acima, mas em vez disso estão configurados para receber a amostra fluídica diretamente, a qual é subsequentemente removida após a análise da amostra. Por "removida" se entende que nenhuma quantidade da amostra permanece em contato com os sistemas em causa, incluindo qualquer canal de fluxo, local de aplicação da amostra, entrada, bem como matriz porosa. Em outras palavras, quando a amostra é removida, todos os vestígios da amostra são limpos dos componentes do sistema. Em algumas modalidades, os sis- temas podem incluir adicionalmente um ou mais dispositivos de lavagem para a limpeza do dispositivo microfluídico integrado. Por exemplo, os dispositivos de lavagem podem incluir microcondutas com ou sem bocal de pulverização para a entrega de tampão de lavagem para limpar o dispositivo microfluídico. Em certas modalidades, estes sistemas incluem um reservatório para o armazenamento de um ou mais tampões de lavagem.

KITS

[00142] Aspectos da invenção incluem adicionalmente kits, em que os kits incluem um ou mais dispositivos microfluídicos de análise. Em alguns casos, os kits podem incluir um ou mais componentes de análise (por exemplo, reagentes marcados, tampões, etc., como descrito acima). Em alguns casos, os kits podem incluir ainda um dispositivo de recolha de amostra, por exemplo, uma lança ou agulha configurada para furar a pele para se obter uma amostra de sangue total, uma pipeta, etc., como desejado. Os vários componentes de análise dos kits podem estar presentes em recipientes separados, ou alguns ou todos eles podem ser pré-combinados. Por exemplo, em alguns casos, um ou mais componentes do kit, por exemplo, os dispositivos microfluídi- cos, estão presentes em uma bolsa selada, por exemplo, uma bolsa de folha ou invólucro estéril.

[00143] Para além dos componentes acima, os kits em causa podem incluir adicionalmente (em certas modalidades) instruções para a prática dos presentes métodos. Estas instruções podem estar presentes nos kits em causa em uma variedade de formas, uma ou mais das quais podem estar presentes no kit. Uma forma na qual as instruções podem estar presentes é como informação impressa sobre um meio adequado ou substrato, por exemplo, um pedaço ou pedaços de papel no qual a informação é impressa, na embalagem do kit, em um folheto informativo, e semelhantes. Ainda outra forma destas instruções é um suporte informático, por exemplo, disquete, disco compacto (CD), unidade flash portátil, e semelhantes, em que foi gravada a informação. Ainda outra forma destas instruções que pode estar presente é endereço de um site que pode ser utilizado através da internet para aceder às informações em um local retirado.

UTILIDADE

[00144] Os métodos, dispositivos, e kits da presente divulgação encontram utilidade em uma variedade de diferentes aplicações e podem ser usados para determinar se um analito está presente em uma multiplicidade de diferentes tipos de amostras de uma multiplicidade de fontes possíveis. Dependendo da aplicação e do resultado desejado dos métodos aqui descritos, um analito pode ser detectada de um modo qualitativo ("presente" versus "ausente"; "sim, acima de um limite predeterminado" versus "não, não acima de um limite predeterminado"; etc.) ou uma forma quantitativa, por exemplo, como uma quantidade em uma amostra (tal como a concentração na amostra). Muitos tipos diferentes de analitos podem ser analitos de interesse, incluindo, mas não limitados a: proteínas (incluindo ambas as proteínas livres e as proteínas ligadas à superfície de uma estrutura, tal como uma célula), ácidos nucleicos, partículas virais, e semelhantes. Além disso, as amostras podem ser de origem in vitro ou in vivo, e as amostras podem ser amostras de diagnóstico.

[00145] Ao pôr em prática os métodos da presente divulgação, as amostras podem ser obtidas de origem in vitro (por exemplo, extrato de uma cultura de células cultivadas em laboratório) ou de origem in vivo (por exemplo, um sujeito mamífero, um sujeito humano, um animal de pesquisa, etc.). Em algumas modalidades, a amostra é obtida de uma origem in vitro. As origens in vitro incluem, mas não estão limitadas a, culturas de células procarióticas (por exemplo, bacterianas), culturas de células eucarióticas (por exemplo, mamíferos, fungos) (por exemplo, culturas de linhas de células estabelecidas, culturas de linhas de células conhecidas ou adquiridas, culturas de células imortalizadas, culturas de células primárias, culturas de levedura de laboratório, etc.), culturas de tecidos, eluentes de cromatografia de coluna, li- sados/extratos de células (por exemplo, lisados/extratos contendo proteína, lisados/extratos contendo ácidos nucleicos, etc.), sobrenadantes de empacotamento viral, e semelhantes. Em algumas modalidades, a amostra é obtida de uma origem in vivo. As origens in vivo incluem organismos multicelulares vivos e podem originar amostras de diagnóstico.

[00146] Em algumas modalidades, o analito é um analito de diagnóstico. Um "analito de diagnóstico" é um analito de uma amostra que tenha sido obtida de ou derivada de um organismo multicelular vivo, por exemplo, mamífero, a fim de realizar um diagnóstico. Em outras palavras, a amostra foi obtida para determinar a presença de um ou mais analitos de doença, a fim de diagnosticar uma doença ou condição. Logo, os métodos são métodos de diagnóstico. Uma vez que os métodos são "métodos de diagnóstico", são métodos que diagnosticam (isto é, determinam a presença ou ausência de) uma doença (por exemplo, condição de doença, diabetes, etc.) ou condição (por exemplo, gravidez) em um organismo vivo, tal como um mamífero (por exemplo, um ser humano). Como tal, certas modalidades da presente divulgação são métodos que são utilizados para determinar se um sujeito vivo tem uma determinada doença ou condição (por exemplo, a diabetes). "Métodos de diagnóstico" também incluem métodos que determinam a gravidade ou estado de uma determinada doença ou condição.

[00147] Em certas modalidades, os métodos são métodos para determinar se um analito está presente em uma amostra de diagnóstico. Como tal, os métodos são métodos de avaliação de uma amostra em que o analito de interesse pode ou não estar presente. Em alguns casos, não se sabe se o analito está presente na amostra antes da realização da análise. Em outros casos, antes de realizar o ensaio, não se sabe se o analito está presente na amostra em uma quantidade que é maior do que uma (excede a) quantidade limite predeterminada. Em tais casos, os métodos são métodos de avaliação de uma amostra em que o analito de interesse pode ou pode não estar presente em uma quantidade que é maior do que (excede) o limite predeterminado.

[00148] Amostras de diagnóstico incluem as obtidas de origens in vivo (por exemplo, um sujeito mamífero, um sujeito humano, e semelhantes) e pode incluir amostras obtidas de tecidos ou células de um sujeito (por exemplo, biópsias, amostras de tecido, sangue total, sangue fracionado, cabelo, pele e semelhantes). Em alguns casos, células, fluidos ou tecidos derivados de um sujeito são cultivadas, armazenadas ou manipuladas antes da avaliação e tal amostra pode ser considerada uma amostra de diagnóstico se os resultados são utilizados para determinar a presença, ausência, estado, ou severidade de uma doença (por exemplo, condição de doença, diabetes, etc.) ou condição (por exemplo, gravidez) em um organismo vivo.

[00149] Em alguns casos, uma amostra de diagnóstico é uma amostra de tecido (por exemplo, sangue total, sangue fracionado, plasma, soro, saliva e semelhantes) ou é obtida de uma amostra de tecido (por exemplo, sangue total, sangue fracionado, plasma, soro, saliva, pele, cabelo e semelhantes). Um exemplo de uma amostra de diagnóstico inclui, mas não está limitado a culturas de células e tecidos derivados de um sujeito (e seus derivados, tais como sobrenadantes, lisados e semelhantes); amostras de tecidos e fluidos corporais; amostras não celulares (por exemplo, eluentes de coluna; biomoléculas ace- lulares, tal como proteínas, lipídios, hidratos de carbono, ácidos nu- cleicos; misturas de reação de síntese; misturas de reação de amplifi- cação de ácidos nucleicos; reações enzimáticas ou bioquímicas in vitro ou soluções de análise; ou produtos de outras reações in vitro e in vivo, etc.); etc.

[00150] Os presentes métodos podem ser utilizados com amostras de uma variedade de diferentes tipos de sujeitos. Em algumas modalidades, uma amostra é de um sujeito dentro classe Mammalia, incluindo a ordem carnívora (por exemplo, cães e gatos), Rodentia (por exemplo, ratinhos, porquinhos da índia, e ratos), Lagomorpha (por exemplo, coelhos) e primatas (por exemplo, seres humanos, chimpanzés e macacos), e semelhantes. Em alguns casos, os animais ou hospedeiros, isto é, os sujeitos são seres humanos.

EXPERIMENTAL

[00151] O exemplo que se segue é apresentado como meio de ilustração e não a título de limitação. O exemplo é fornecido apenas para fins ilustrativos, e não se destina a limitar de qualquer forma o âmbito da presente divulgação. Têm sido feitos esforços para assegurar a precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem, é claro, ser permitidos.

[00152] Uma quantidade de punção do dedo (5-50 μL) de sangue total é carregada em um local de aplicação da amostra de um dispositivo capilar da presente invenção (mostrado nas Figs. 2A e B) onde é atraída para dentro do elemento poroso através da força capilar. O elemento poroso é uma frita porosa e mistura de análise associada. A composição da reação é um tampão preservado incluindo BSA, MES, trealose D+, EDTA, PVP e uma mistura de reagentes. A razão BSA:Trealose:PVP em um peso seco é de 21:90:1. A mistura reagente é constituída por um conjunto de conjugados de anticorpo- corante, específica para antígenos CD14, CD4, CD45RA, e CD3 na amostra de sangue. Uma vez carregada, uma tampa é colocada so- bre o local de aplicação da amostra, selando o local de aplicação da amostra e uma saída de ventilação do canal capilar. O fluxo capilar do sangue segue através do elemento poroso e ao longo do canal, desimpedido pela tampa de vedação capilar do ambiente exterior. O fluxo pode terminar em uma junção hidrofóbica. Os anticorpos anti- CD14, CD4, CD45RA e CD3 presentes no elemento poroso se dissolvem na amostra de sangue a uma taxa substancialmente constante à medida que a amostra passa através do elemento poroso e ao longo do canal capilar por cerca de 2 minutos a partir do momento em que a amostra foi aplicado. A amostra de sangue flui através do elemento poroso substancialmente desimpedido e não filtrada. Os com-ponentes específicos na amostra de sangue irão ligar-se aos conjugados anticorpo-corante, possibilitando a detecção e quantificação de analitos na amostra. A detecção é efetuada utilizando um LED para iluminar o cartucho onde a região da parede transmissiva se localiza. O sinal óptico é medido por imagem através da parede opticamente transmissiva do canal capilar utilizando um microscópio de baixa potência com um detector CCD-câmera e um filtro apropriado. Um diagrama esquemático da imagem é mostrado na Fig. 3A através da parede transmissiva 50 do canal capilar 60. Um diagrama esquemático dos resultados de análise de imagem (Fig. 3B) mostra que, após o processamento, a distribuição de sinal dos conjugados de corante- anticorpo ligado ao analito em células é mensuravelmente superior ao conjugado livre no fluxo de amostra. O processamento de imagem permite a redução do sinal de fundo 70, a fim de formar uma imagem mais clara de células marcadas com os conjugados de corante- anticorpo e determinar o número de células que testam positivas para os anticorpos CD14, CD4, CD45RA, CD3.

[00153] Não obstante as cláusulas anexas, a divulgação aqui estabelecida também é definida pelas cláusulas seguintes:

[00154] 1. Dispositivo microfluídico compreendendo:

[00155] um local de aplicação da amostra;

[00156] um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra; e

[00157] um componente poroso posicionado entre o local de aplicação da amostra e do canal de fluxo, em que o componente poroso compreende:

[00158] uma matriz porosa; e

[00159] um reagente de análise.

[00160] 2. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 1, em que a matriz porosa é configurada para ser de não filtragem com respeito à amostra para a qual o dispositivo está configurado para teste.

[00161] 3. O dispositivo microfluídico de acordo com as cláusulas 1 ou 2, em que a matriz porosa é configurada para fornecer a mistura de reagente de análise com uma amostra que flui através do mesmo.

[00162] 4. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a matriz porosa compreende poros com diâmetros entre 1 μm e 200 μm.

[00163] 5. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a matriz porosa compreende um volume de poro entre 1 μL e 25 μL.

[00164] 6. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o volume de poro se situa entre 25% e 75% do volume da matriz porosa.

[00165] 7. O dispositivo microfluídico da cláusula 6, em que o volu me de poros se situa entre 40% e 60% do volume da matriz porosa.

[00166] 8. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a matriz porosa é uma frita.

[00167] 9. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a matriz porosa compreende vidro.

[00168] 10. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a matriz porosa compreende um polímero poroso.

[00169] 11. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o componente poroso compreende ainda um tampão.

[00170] 12. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o reagente compreende um membro de ligação específica ao analito.

[00171] 13. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 12, em que o membro de ligação específica ao analito compreende um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao analito.

[00172] 14. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas 12 a 13, em que o membro de ligação específica ao analito é acoplado a um marcador detectável.

[00173] 15. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas 12 a 14, em que o membro de ligação específica ao analito se liga especificamente a um alvo selecionado de CD14, CD4, CD45RA, CD3 ou uma sua combinação.

[00174] 16. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas 14 a 15, em que o marcador detectável é um marcador detectável opticamente.

[00175] 17. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 16, em que o marcador detectável opticamente compreende um corante fluorescente.

[00176] 18. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 17, em que o corante fluorescente compreende um composto selecionado do grupo que consiste de rodamina, cumarina, cianina, xanteno, poli- metina, pireno, boro diflúor-dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina, os seus conjugados ou uma sua combinação.

[00177] 19. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas 11 a 18, em que o tampão compreende albumina de soro bovino (BSA), trealose, polivinilpirrolidona (PVP) ou ácido 2-(N- morfolino) etanossulfônico ou uma sua combinação.

[00178] 20. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 19, em que o tampão compreende BSA, trealose e PVP.

[00179] 21. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 20, em que a quantidade de BSA no tampão se situa entre 1% a 50% em peso.

[00180] 22. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas 20 a 21, em que a quantidade de trealose no tampão se situa entre 1% a 99% em peso.

[00181] 23. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas 20 a 22, em que a quantidade de PVP no tampão é entre 0,01% e 10% em peso.

[00182] 24. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a mistura de análise compreende um agente quelante.

[00183] 25. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 24, em que o agente quelante é selecionado do grupo que consiste em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido etilenoglicol bis-(beta-aminoetil éter) N,N,N',N'-tetracético (EGTA), ácido 2,3-dimercaptopropano-1- sulfônico (DMPS), e ácido 2,3-dimercaptossuccínico (DMSA).

[00184] 26. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 25, em que o agente quelante é EDTA.

[00185] 27. O dispositivo microfluídico de qualquer uma das cláusu las anteriores, em que o canal de fluxo compreende uma parede opti- camente transmissiva.

[00186] 28. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 27, em que as paredes do canal de fluxo são opticamente transmissivas a um ou mais de luz ultravioleta, luz visível e luz próxima de infravermelho.

[00187] 29. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o local de aplicação da amostra é configurado para receber uma amostra que tem um volume que varia de 5 μL a 2000 μL.

[00188] 30. O dispositivo microfluídico de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o dispositivo é configurado para portátil.

[00189] 31. Um método compreendendo:

[00190] contatar uma amostra com um local de aplicação da amostra de um dispositivo microfluídico, o dispositivo microfluídico compreendendo:

[00191] um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra; e

[00192] um componente poroso posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo, em que o componente poroso compreende uma matriz porosa e um reagente de análise;

[00193] iluminar a amostra no canal de fluxo com uma fonte de luz; e

[00194] detectar luz da amostra.

[00195] 32. O método de acordo com a cláusula 31, em que a amostra se mistura com o reagente de análise por seguir a amostra através da matriz porosa.

[00196] 33. O método de acordo com a cláusula 31, em que a mis tura da amostra com o reagente de análise compreende marcar um ou mais componentes da amostra com um marcador detectável.

[00197] 34. O método de acordo com a cláusula 33, em que a mar- cação compreende a ligação de um ou mais componentes de um membro de ligação específica ao analito.

[00198] 35. O método de acordo com a cláusula 34, em que o membro de ligação específica ao analito é conjugado com um marcador detectável opticamente.

[00199] 36. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 34 a 35, em que o membro de ligação específica ao analito é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[00200] 37. O método de acordo com a cláusula 36, em que o anti corpo ou fragmento de anticorpo se liga especificamente a um alvo selecionado de CD14, CD4, CD45RA, CD3 ou uma sua combinação.

[00201] 38. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 35 a 37, em que o marcador detectável opticamente compreende um corante fluorescente.

[00202] 39. O método de acordo com a cláusula 38, em que o co rante fluorescente compreende um composto selecionado do grupo que consiste em rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pi- reno, boro diflúor-dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina, os seus conjugados ou uma sua combinação.

[00203] 40. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 32 a 39, em que 95% ou mais da amostra passa através da matriz porosa para dentro do canal de fluxo.

[00204] 41. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 32 a 40, em que o método compreende iluminar a amostra com uma fonte de luz de espectro largo.

[00205] 42. O método de acordo com a cláusula 41, em que a fonte de luz de espectro largo compreende uma fonte de luz ultravioleta e uma fonte de luz visível.

[00206] 43. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 41 a 42, em que o método compreende iluminar a amostra com luz possuindo um comprimento de onda entre 200 nm e 800 nm.

[00207] 44. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 31 a 43, em que a detecção de luz da amostra compreende a captura de uma imagem da amostra no canal capilar.

[00208] 45. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 31 a 44, em que a amostra é um fluido biológico.

[00209] 46. O método de acordo com a cláusula 45, em que o fluido biológico é sangue completo.

[00210] 47. O método de acordo com a cláusula 45, em que o fluido biológico é plasma.

[00211] 48. Um dispositivo microfluídico compreendendo:

[00212] um local de aplicação da amostra;

[00213] um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra;

[00214] um componente poroso posicionado entre o local de aplicação da amostra e do canal de fluxo, em que o componente poroso compreende:

[00215] uma matriz porosa; e

[00216] um reagente de análise; e

[00217] uma quantidade de amostra biológica presente no dispositivo microfluídico.

[00218] 49. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 48, em que a amostra biológica é sangue total.

[00219] 50. O dispositivo microfluídico de acordo com a cláusula 49, em que a amostra biológica é plasma.

[00220] 51. Um sistema compreendendo:

[00221] uma fonte de luz;

[00222] um detector óptico para detectar um ou mais comprimentos de onda de luz; e

[00223] um dispositivo microfluídico compreendendo:

[00224] um local de aplicação da amostra;

[00225] um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra; e

[00226] um componente poroso posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal capilar, em que o componente poroso compreende uma matriz porosa e um reagente de análise.

[00227] 52. Um kit compreendendo:

[00228] um dispositivo microfluídico compreendendo:

[00229] um local de aplicação da amostra;

[00230] um canal de fluxo em comunicação de fluido com o local de aplicação da amostra; e

[00231] um componente poroso posicionado entre o local de aplicação da amostra e o canal de fluxo, em que o componente poroso compreende uma matriz porosa e um reagente de análise; e

[00232] um recipiente alojando o dispositivo.

[00233] 53. O kit da cláusula 52, em que o recipiente compreende uma bolsa.

[00234] 54. Um dispositivo microfluídico para a análise de uma amostra compreendendo um local de aplicação da amostra em comunicação com um elemento poroso e um canal capilar,

[00235] em que o elemento poroso compreende uma mistura de análise e uma frita porosa; e

[00236] em que a frita fornece uma série de microcanais que definem uma trajetória tortuosa que tem um comprimento suficiente para que a combinação da mistura de análise e da amostra e em que os microcanais fornecem o fluxo através de substancialmente todos os componentes da amostra.

[00237] 55. O dispositivo da cláusula 54, em que a frita porosa tem um volume médio de vazio entre 40-60% do volume total da frita.

[00238] 56. O dispositivo da cláusula 54, em que a mistura de análi- se compreende um reagente e um conjunto de componentes do tampão e em que o conjunto dos componentes do tampão prevê a dissolução substancialmente contínua do reagente na amostra durante um período de tempo predeterminado.

[00239] 57. O dispositivo da cláusula 54, em que o conjunto dos componentes do tampão é selecionado do grupo compreendendo albumina de soro bovino, trealose, polivinilpirrolidona e ou qualquer sua combinação.

[00240] 58. O dispositivo da cláusula 54, em que o conjunto dos componentes do tampão compreende albumina de soro bovino, trealo- se e polivinilpirrolidona.

[00241] 59. O dispositivo da cláusula 54, em que o peso total dos componentes do tampão está compreendido entre 0,01 e 2 gramas por μL de volume de vazio da frita na frita porosa.

[00242] 60. O dispositivo da cláusula 54, em que o conjunto dos componentes do tampão compreende ácido 2-(N-morfolino) etanossul- fônico.

[00243] 61. O dispositivo da cláusula 54, em que a mistura de análi se compreende o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

[00244] 62. O dispositivo da cláusula 54, em que o reagente com preende um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpo conjugados com um ou mais marcadores detectáveis.

[00245] 63. O dispositivo da cláusula 62, em que o anticorpo ou fra gmento de anticorpo é específico para um alvo selecionado de CD14, CD4, CD45RA, CD3 ou qualquer sua combinação.

[00246] 64. O dispositivo da cláusula 62, em que o marcador detec- tável é um corante fluorescente selecionado do grupo compreendendo rodamina, cumarina, cianina, xanteno, polimetina, pireno, boro diflúor- dipirrometeno, naftalimida, ficobiliproteína, proteínas de clorofila peridinina, seus conjugados, e suas combinações.

[00247] 65. O dispositivo da cláusula 54, em que os microcanais têm um diâmetro médio de poros de passagem entre 5 e 200 mícrons.

[00248] 66. O dispositivo da cláusula 54, compreendendo adicio nalmente uma amostra.

[00249] 67. O dispositivo da cláusula 66, em que a amostra é san gue.

[00250] 68. O dispositivo da cláusula 66, em que a amostra é plas ma.

[00251] 69. O dispositivo da cláusula 54, compreendendo adicio nalmente uma parede opticamente transmissiva ao longo de pelo menos uma porção do canal capilar.

[00252] 70. Um método para analisar uma amostra de um líquido compreendendo:

[00253] aplicar uma amostra de líquido a um local de aplicação da amostra, em que o local de aplicação da amostra se encontra em comunicação de fluido com um elemento poroso e um canal;

[00254] dirigir o fluxo da amostra do local de aplicação da amostra, através do elemento poroso para o canal, em que o canal compreende uma parede opticamente transmissiva e em que o elemento poroso compreende um reagente opticamente ativo e um conjunto de componentes do tampão;

[00255] dissolver o reagente na amostra em que a dissolução do reagente é substancialmente constante ao longo de um período de tempo predeterminado;

[00256] misturar a amostra e o reagente no elemento poroso, em que o elemento poroso compreende uma frita porosa que fornece uma série de microcanais que definem uma trajetória tortuosa de fluxo que tem um comprimento suficiente para que a mistura da amostra e reagente e que a mistura prevê a ligação do reagente à amostra; e

[00257] avaliar opticamente a amostra através da parede transmis- siva.

[00258] 71. O método da cláusula 70, em que a amostra flui através de uma força de ação capilar através do elemento poroso e através do canal.

[00259] 72. O método da cláusula 70, em que o período de tempo predeterminado é entre 5 segundos e 5 minutos.

[00260] 73. O método da cláusula 72, em que a avaliação óptica compreende:

[00261] obter uma imagem da amostra através da parede transmis- siva;

[00262] determinar um sinal de fundo, em que o sinal de fundo corresponde a pelo menos ao sinal do reagente não ligado; e

[00263] reduzir um sinal de fundo da imagem, em que o sinal de fundo varia menos do que 75% ao longo da parede transmissiva.

[00264] 74. O método da cláusula 70, em que o diâmetro médio dos microcanais é de 5-200 mícrons.

[00265] 75. O método da cláusula 70, em que a amostra flui através do elemento poroso substancialmente não filtrada.

[00266] 76. O método da cláusula 70, em que a amostra é uma amostra de sangue.

[00267] 77. O método da cláusula 70, em que o reagente optica- mente ativo compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo marcados fluorescentemente e fornece a mistura para a formação de uma amostra marcada fluorescentemente.

[00268] Embora a invenção supracitada tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplos para fins de clareza de entendimento, é facilmente evidente para os vulgares peritos na especialidade à luz dos ensinamentos da presente divulgação que certas alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito ou âmbito das reivindicações anexas.

[00269] Logo, o anterior meramente ilustra os princípios da invenção. Será apreciado que os peritos na especialidade sejam capazes de conceber diferentes arranjos que, embora não explicitamente descritos ou mostrados no presente documento, incorporam os princípios da invenção e estão incluídos dentro do seu espírito e âmbito. Além disso, todos os exemplos e linguagem condicional aqui citados são destinados principalmente a auxiliar o leitor a compreender os princípios da invenção isto sendo sem limitação a estes exemplos e condições especificamente enumeradas. Além disso, todas as afirmações aqui enumerando princípios, aspectos e modalidades da invenção, bem como exemplos específicos dos mesmos, se destinam a englobar ambos os equivalentes estruturais e funcionais dos mesmos. Além disso, se pretende que tais equivalentes incluam ambos os equivalentes atualmente conhecidos e equivalentes desenvolvidos no futuro, isto é, quaisquer elementos desenvolvidos que realizem a mesma função, independente da estrutura. O âmbito da presente invenção, portanto, não se destina a ser limitado às modalidades exemplificativas mostradas e aqui descritas. Em vez disso, o âmbito e espírito da presente invenção é realizado pelas reivindicações anexas.

Claims (19)

1. Dispositivo microfluídico (100), caracterizado pelo fato de que compreende: um local de aplicação (10) da amostra; um canal de fluxo (30) em comunicação fluida com o local de aplicação (10) da amostra; e um componente poroso (20) posicionado entre o local de aplicação (10) da amostra e o canal de fluxo (30), em que o componente poroso (20) compreende: uma matriz porosa não filtrante compreendendo poros; e um reagente de análise livre posicionado dentro dos poros da matriz porosa, em que a matriz porosa está configurada para: ser de não filtragem em relação à amostra para a qual o dispositivo está configurado à análise; e fornecer uma mistura uniforme do reagente de análise com uma amostra que flui através do mesmo.

2. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz porosa compreende poros com diâmetros entre 1 mm e 200 mm.

3. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a matriz porosa compreende um volume de poro entre 1 mL e 25 mL.

4. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o volume do poro é entre 25% e 75% do volume da matriz porosa.

5. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a matriz porosa é uma frita.

6. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o componente poroso (20) compreende adicionalmente um tampão.

7. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o tampão compreende albumina do soro bovino (BSA), trealose, polivinilpirrolidona (PVP) ou ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico ou uma combinação dos mesmos.

8. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o reagente compreende um elemento específico de ligação ao analito.

9. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o elemento específico de ligação ao analito é acoplado a um marcador detectável.

10. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dispositivo é configurado para ser portátil.

11. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz porosa compreende um polímero orgânico poroso.

12. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo está configu rado para analisar uma amostra de sangue total.

13. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo está configu rado para analisar proteínas ligadas à superfície de uma célula.

14. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente poroso (20) preenche uma região que se estende do local de aplicação (10) da amostra ao canal de fluxo (30).

15. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz porosa está configurada para ser não filtrante em relação às células de uma amostra celular.

16. Dispositivo microfluídico (100), de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a frita compreende um sólido granulado sinterizado.

17. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: entrar em contato com uma amostra para um local de aplicação (10) da amostra de um dispositivo microfluídico (100) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e 16; iluminar a amostra no canal de fluxo (30) com uma fonte de luz; e detectar luz a partir da amostra.

18. Sistema, caracterizado pelo fato de que compreende: uma fonte de luz; um detector óptico para detectar um ou mais comprimentos de onda de luz; e um dispositivo microfluídico (100) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e 16.

19. Kit caracterizado pelo fato de que compreende: um dispositivo microfluídico (100) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e 16; e um recipiente que aloja o dispositivo.

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