SE530244C2 - Förfarande och system för kvantitativ hemoglobinbestämning - Google Patents

Description

25 30 530 244 2 framgång så som kan ses i t ex artikeln av von Schenk, H., Falkesson, M. och Lundberg, B., ”Evaluation of 'HemoCue', a new device for determining Hemoglobin", Clinical Chemistry, vol. 32, Nr 3, sidorna 562-529, 1986, eftersom metoden ger likvärdiga eller till och med överlägsna resultat i jämförelse med de resultat som erhölls med standardiserade våta metoder för bestämning av Hb. Reagenset som används innefattar natrium-deoxicholat som hemolyserar de röda blodkropparna, natriumazid och natriumnitrit, som omvandlar hemoglobin till azidmethemoglobin.

På grund av de hygroskopiska egenskaperna hos de använda reagensen så är hållbarheten begränsad och lagringen av kyvetterna i förslutna förpackningar som inkluderar ett torkmedel erfordras. Ännu mera besvärande är det faktum att kyvetterna, i klimat med hög luftfuktighet, måste användas inom några få minuter efter att de avlägsnats från förpackningen, eftersom reagensen annars kommer att förstöras och mätningen inte kommer bli tillräckligt noggrann och således oanvändbar.

Problemen som stammarfrån de hygroskopiska egenskaperna hos reagensen som används kan dock undanröjas eftersom det har visat sig att dessa reagens inte behöver användas, såsom visas i US-patentet 6 638 769, i enlighet med vilket den första absorptionsmätningen utförs inom ett våglängdsintervall på 490-520 nm direkt på provet i mikrokyvetten. l enlighet med uppfinningen som visas i denna patentansökan så är det dock nödvändigt att blodet hemolyseras innan mätningen utförs. Kyvettkaviteten måste således inkludera ett hemolyseringsmedel för sönderdelning av de röda blodkropparna och frisättning av hemoglobinet som dessa celler innehåller. Nödvändigheten av att använda ett hemolyseringsmedel när man utför fotometriska absorptionsmätningar avseende hemoglobin i ett blodprov visas även i t ex US-patentet 5 064 282 (Artel).

Kvantitativa metoder för optisk bestämning av hemoglobin i helblod utan användning av hemolyseringsmedel är kända men dessa metoder har det gemensamt att de alla är förhållandevis komplicerade. Detta beror framför allt på att blodet inte är homogent som ett resultat av den höga koncen- trationen av röda blodkroppar, varvid en konsekvens av detta är att ljus sprids vid interaktion med dessa partiklar hos blodprov som inte är homogena. 10 15 20 25 30 530 244 3 Följaktligen så transmitteras inte ljuset direkt genom provet utan deflekteras i en mångfald olika spridningsvinklar. En annan faktor som orsakar problem är det faktum att blod kan innehålla så många som fem olika sorters hemo- globin. Patentpublikationer som inriktar sig på dessa problem är bl. a. US- patentet 6 262 798 (Shepherd) och WO 01/53806 (Radiometer).

I enlighet med den uppfinning som visas i US-patentet 6 262 798 så erfordras en mångfald våglängder i avsikt att åstadkomma en korrekt mätning. Det faktum att flera våglängder erfordras gör spektrofotometern förhållandevis komplicerad. våglängderna väljs på grundval av deras fömåga att särskilja mellan de olika sorterna av hemoglobin vid ett minimum av ljusspridning och maximal absorption. Patentet visar även användningen av en stor detektor som reducerar problemet med spriding bortom detektions- intervallet.

WO 01/53806 visar en apparat som är särskilt tillämpbar för optiska mätningar på helblod. Denna apparat innefattar ett absorptionsfilter eller ett interferensfilter, vilket åstadkommer justering för variationer avseende detektorns känslighet och avseende den effektiva optiska våglängden såsom observerad vid varierande grad av spridning. Apparaten använder en stor detektor för detektion av spritt ljus som transmitterats genom absorptionsfiltret eller interferensfiltret. l US-patentet 6 831 733 har det visats att en noggrann bestämning av den totala mängden hemoglobin kan göras inte enbart utan användning av ett hemolyseringsmedel, utan även utan användning av en mångfald våglängder såsom visas i US-patentet 6 262 798. l enlighet med US-patentet 6 831 733 så kan den totala mängden hemoglobin i helblod bestämmas genom att man utförde två absorptionsmätningar, vid en första våglängd inom intervallet 490- 520 nm, och vid en andra våglängd vid vilken absorptionen är avsevärt mindre än vid den första våglängden. Koncentrationen av hemoglobin i provet kan sedan bestämmas genom att man bearbetar resultaten av de första och andra absorptionsmätningarna. Skillnaden i absorbans mellan den första och den andra absorptionsmätningen är huvudsakligen beroende på skillnaden i hemoglobinets absorption. Det finns dock andra faktorer som påverkar skillnaden i absorption. Den viktigaste av dessa andra faktorer är skillnaden i 10 15 20 25 30 530 244 4 Ijusspridning i provet. l enlighet med US-patentet 6 831 733 så betraktas effekten av spridning såsom varandes beroende av den uppmätta absorbansen vid den andra absorptionsmätningen. Således har man överraskande funnit att hemoglobinets koncentration i provet kan mätas som skillnaden med avseende på absorption mellan enbart två absorptions- mätningar, genom att man använder en term för att kompensera för spridning.

Kompensationstermen är beroende av resultatet av den andra absorptions- mätningen.

Sammanfattninq av uppfinnißeg Det är ett syfte med föreliggande uppfinning att tillhandahålla ett snabbt, kvantitativt förfarande för bestämning av hemoglobin i oförändrat helblod.

Ett andra syfte är att tillhandahålla ett förfarande för bestämning av hemoglobin i oförändrat helblod vilket kan utföras i en mikrokyvett som även kan användas till att förvärva ett blodprov.

Ett tredje syfte är att tillhandahålla ett enkelt förfarande för bearbetning av resultat från absorptionsmätningar för bestämning av hemoglobin i oförändrat helblod.

Ett fjärde syfte är att tillhandahålla ett system för verkställande av förfarandena för bestämning av hemoglobin i oförändrat helblod.

Ytterligare syften kommer att bli uppenbara utgående från den följande beskrivningen och de efterföljande kraven.

I enlighet med en aspekt av föreliggande uppflnning så innefattar ett förfarande för åstadkommande av en sådan hemoglobinbestämning: att man förvärvar ett prov av oförändrat helblod in i en kapillär kyvett; att man introducerar nämnda kyvett för en uppställning för en absorptionsmätning; att man fördröjer absorptionsmätning under en bestämd tidsperiod; att man utför en första absorptionsmätning vid en första våglängd inom intervallet 490- 520 nm direkt på provet i kyvetten; att man vidare utför en andra absorptionsmätning vid en andra våglängd som skiljer sig från den första våglängden och vid vilken absorptionen är avsevärt mindre än vid den första våglängden; och att man bearbetar resultat av den första och den andra 10 15 20 25 30 530 244 5 absorptionsmätningen i avsikt att bestämma hemoglobinkoncentrationen i provet.

I enlighet med en annan aspekt av föreliggande uppfinning så innefattar ett system för åstadkommande av en sådan hemoglobinbestäm- ning: organ för emission av ljus vid en första våglängd i ett första intervall på 490-520 nm och vid en andra våglängd i ett andra intervall vid vilken absorption av ljus i blod är avsevärt mindre än vid den första våglängden; en kyvetthållare som är anordnad att mottaga en kapillär kyvett, vilken håller ett prov av oförändrat helblod; en detektor för detektion av ljus som transmitterats genom provet vid en första absorptionsmätning med avseende på ljus inom nämnda första intervall och vid en andra absorptionsmätning med avseende på ljus inom nämnda andra intervall; en styrenhet för skapande av en fördröjning på en bestämd tidsperiod mellan placering av kyvetten i kyvetthållaren och utförande av absorptionsmätningar; och en bearbetningsenhet för bearbetning av resultat från den första och andra absorptionsmätningen i avsikt att bestämma hemoglobinkoncentrationen i provet. l enlighet med uppfinningen har det överraskande visat sig att kvantitativa bestämningar av hemoglobin inte bara enkelt kan utföras direkt på ett oförändrat, dvs outspätt och ohemolyserat, prov av helblod, utan kan även åstadkommas genom att man helt enkelt utför två absorptionsmätningar vid olika våglängder och bearbetar dessa resultat.

Bestämningen kan utföras på ett blodprov utan användning av hygroskopiska reagens, eller ett hemolyseringsmedel. Således baseras hemoglobinbestämningen på absorptionsmätningar medan hemoglobinet är bundet inuti röda blodkroppar. Hemoglobinhalten kan således bestämmas utan att man lyserar de röda blodkropparna i avsikt att frisätta hemoglobinet.

Vidare så har det nu överraskande visat sig att det inte ens är nödvändigt att kompensera för spridningsverkan av de röda blodkropparna.

En skillnad mellan två absorptionsmätningar återspeglar både en effekt som beror på ljusabsorption i hemoglobin och en effekt som beror på ljusspridning av de röda blodkropparna. Genom att använda sig av en fördröjning av utförandet av absorptionsmätningarna så kan det dock styras vid vilken tid 10 15 20 25 30 530 244 6 absorptionsmätningarna utförs. Vid utarbetandet av uppfinningen så har det observerats att resultaten av absorptionsmätningarna varierar över tiden i relation till förvärvandet av blodprovet. Resultatet av den första absorptions- mätningen varierar i större grad. Detta betyder att skillnaden mellan de två absorptionsmätningarna varierar beroende på vid vilken tidpunkt som mätningarna utfördes. Således kan fördröjningen vad gäller absorptionsmät- ningarna styra vid vilken tidpunkt som absorptionsmätningarna utförs och bearbetningen av resultaten kan kalibreras i enlighet därmed i avsikt att ge ett korrekt värde på hemoglobinkoncentrationen i blodprovet.

Särskilt så minskar skillnaden mellan resultaten av absorptionsmät- ningarna kraftigt under den första tidsperioden efter att blodprovet förvärvats.

Därefter så är skillnaden förhållandevis stabil under en tidsperiod och efter ett tag så börjar skillnaden att öka igen. Fördröjningen kan således anpassas till att medge att mätningar utförs vid en tidpunkt när mätresultaten är förhållandevis stabila. Detta medför att resultaten av den bestämda hemoglobinkoncentrationen är ganska okänslig för den exakta tidpunkten vid vilken bestämningen utförs. Således så är inte resultatet beroende av huruvida det förvärvade provet introduceras i mätapparaten omgående eller om det går en minut innan det förvärvade provet introduceras i mätapparaten.

Det antas att variationen vad gäller mätresultat åtminstone delvis är beroende på rörelse inom provet när provet förvärvas in i kyvetten. Efter ett tag så har rörelserna fått avstanna och mätresultaten är mer stabila. Även de röda blodkropparnas spridningsverkan minskar då och, således, behöver bearbetningen av resultaten av absorptionsmätningarna inte beakta effekterna av att de röda blodkropparnas ljusspridning är olika för den första och den andra absorptionsmätningen. Mätresultaten kan senare börja öka igen när de röda blodkropparna börjar sedimentera i bottendelen av kyvetten.

De röda blodkropparna kommer således att samlas i botten på kyvetten, vilket förhöjer spridningesverkan. l enighet med uppfinningen utförs således hemoglobinbestämningen på ett enkelt sätt. Enbart två absorptionsmätningar erfordras vid användning av ett prov av oförändrat helblod. Vidare så kan hemoglobinlnnehållet bestämmas med användning av en enkel algoritm för bearbetning av 10 15 20 25 30 530 244 7 resultaten av de två absorptionsmätningarna. Detta innebär att det är lätt att kalibrera ett instrument så att det visar korrekt resultat med algoritmen. Den lätta kalibreringen åstadkoms dock på bekostnad av en något längre tid för erhållande av ett analysresultat eftersom analysen måste fördröjas för att säkerställa att verkan av ljusspridning inte behöver beaktas.

Vad gäller föreliggande ansökan så ska begreppet ”absorptions- mätning” tolkas som en mätning som står i relation till provets absorption. Vid en absorptionsmätning så jämförs ljusintensiteten som detekteras efter interagering med ett prov med ljusintensiteten som provet bestrålats med. Det detekterade ljuset motsvarar transmittansen genom provet. Ljuset som inte når detektorn anses absorberat. Således kan, i mätresultaten, transmittansen användas istället för absorptionen. Eftersom transmittansen är inversen av absorptionen så är detektionen av transmittansen fortfarande en absorptionsmätning. Den uppmätta absorptionen motsvarar dock inte enbart det ljus som verkligen absorberats i provet, eftersom en del av ljuset har spritts i provet så att det inte när detektorn.

Vidare så ska begreppet ”bestämning” tolkas som en mätning som inte nödvändigtvis erhåller ett absolut exakt värde på hemoglobinkoncentrationen i provet. Således så ”bestäms” hemoglobinkoncentrationen inom rimliga felmarginaler på så sätt att resultatet inte enbart ger en storleksordning, medan det inte nödvändigtvis ger ett absolut värde.

Bearbetningen kan utföras med hjälp av en förbestämd algoritm. Detta innebär att algoritmen kan programmeras in i ett instrument och att instrumentet direkt kan ge tillbaka analysresultat efter att absorptions- mätningar utförts.

Bearbetningen kan bestämma hemoglobinkoncentrationen i provet genom att beräkna följande formel: [Tot Hb] = (Abs1 -Abs2) >< k1 + k; varvid [Tot Hb] är den totala hemoglobinkoncentrationen i provet, Abs1 är den uppmätta absorbansen vid den första absorptionsmätningen, Absg är den 10 15 20 25 30 53Ü 244 8 uppmätta absorbansen vid den andra absorptionsmätningen, och kl och k; är kalibreringskoefficienter, vilka beror på mätuppställningen.

Detta innebär att den totala hemoglobinkoncentrationen i ett prov enkelt bestäms genom att man beräknar en skillnad mellan de två absorptionsmätningarna. Det förekommer endast ett behov av två kalibreringskoefficienter vilka kan hantera kurvans lutning och förskjutningen av kurvan från origo. Således är det endast nödvändigt att bestämma två värden på kalibreringskoefficienter, varigenom kalibreringen av instrument kan åstadkommas på ett enkelt sätt. introduktionen kan innefatta att man placerar kyvetten i en hållare hos ett instrument för utförande av absorptionsmätningar. Detta innebär att kyvetten kan föras till en korrekt position för absorptionsmätningar inuti instrumentet. l enlighet med en utföringsform så utförs fördröjningen med en förbestämd tidsperiod som förinställts före förvärvning av provet. Således kan en mätapparat förinställas i avsikt att fördröja utförandet av absorptions- mätnlngarna under en förbestämd tidsperiod. Mätapparaten kan kalibreras i enlighet härmed. Denna förbestämda tidsperiod kan styras med hjälp av en timer som möjliggör att absorptionsmätningarna utförs efter att tidsperioden gått ut.

Den förbestämda tidsperioden kan startas när kyvetten placeras i hållaren. Således kan instrumentet styra så att analysen fördröjs så kort tid som möjligt så att de röda blodkropparnas spridningsverkan är oväsentlig. instrumentet kan således anordnas så att det möjliggör absorptionsmätningar vid en specifik tid efter att det mottagit en kyvett i hållaren.

Den förbestämda tidsperioden är åtminstone 30 s, och mer företrädes- vis inom intervallet 60-90 s. Detta ger provet en möjlighet att avstanna på lämpligt sätt så att de röda blodkropparnas spridningsverkan inte påverkar analysresultatet. l enlighet med en annan utföringsform så utförs fördröjningen genom att man övervakar resultaten av absorptionsmätningar, och när resultaten är huvudsakligen konstanta så medger man att den första och den andra absorptionsmätningen utförs i avsikt att bestämma hemoglobinkoncentra- 10 15 20 25 30 530 244 9 tionen i provet. Detta innebär att en första koll utförs för att försäkra sig om att absorptionsmätningarna utförs vid en tidpunkt när verkan av ljusspriding i blodprovet inte avsevärt påverkar bestämningen av hemoglobinkoncentra- tionen. När detta fastslagits så utförs absorptionsmätningarna. Alternativt så kan den första kollen utföras på något annat sätt för att fastställa att rörelserna inom blodprovet avstannat.

Den första absorptionsmätningen kan utföras vid en våglängd inom intervallet 500 - 510 nm, mer företrädesvis vid 506 nm. Inom våglängdsintervallet 490 - 520 nm, och särskilt 500 - 510 nm, så är absorptionen från de fem olika hemoglobintyperna, dvs oxi-, deoxi-, karboxi-, met-, och sulfhemoglobin, betydande och likartad. Således kommer absorptionen inom detta våglängdsområde enbart i mindre utsträckning bero på distributionen mellan de olika typerna av hemoglobin i blodet. Särskilt, vid 506 nm, så är skillnaden mellan absorbansen av oxi- och deoxihemoglobin nära noll. Eftersom dessa typer av hemoglobin dominerar i normalt blod så kan absorptionen av oxi- och deoxihemoglobin med fördel användas för bestämning av en absorptionskoefficient för att sätta en uppmätt absorption i relation till hemoglobinkoncentrationen vid 506 nm. Följaktligen görs vissa antaganden vad gäller förekomsten av olika hemoglobintyper i blodprovet.

Således kommer inte hemoglobinbestämningen att vara så precis, eller bearbetningen av resultaten måste modifieras, ifall en mätning görs på ett blodprov som har en kraftigt avvikande distribution av hemoglobintyperna.

Vidare så kommer mätningarna enbart att bestämma den totala hemoglobin- koncentrationen och inte koncentrationerna av de specifika hemoglobin- typerna.

Den andra absorptionsmätningen kan utföras vid en våglängd inom intervallet 650 - 1200 nm, mer företrädesvis inom intervallet 850 - 910 nm, helst inom intervallet 860 - 900 nm. Inom dessa våglångdsintervall så är absorptionen av hemoglobin avsevärt lägre än vid den första våglängden, Vidare så bör våglängden väljas på så sätt att absorptionen av andra substanser i blodprovet i huvudsak är densamma vid den första och den andra våglängden. Detta innebär att skillnaden vad gäller absorption kan relateras till hemoglobinkoncentrationen i provet. Den andra våglängden kan 10 15 20 25 30 530 244 10 med fördel väljas inom intervallet 860 - 900 nm, varvid absorptionen av andra substanser inte påverkar analysresultatet.

Kyvetten kan ha en optisk våglängd på mindre än 1 mm, mer före- trädesvis mindre än 0,2 mm. Detta säkerställer att en tillräcklig ljusintensitet kan transmitteras genom provet så att absorptionsmätningen blir statistiskt signifikant. En kortare optisk längd skulle medge att högre ljusintensiteter detekteras.

Kyvetten kan ha en optisk våglängd inom intervallet 0,05 - 0,2 mm.

Detta innebär att ljus transmitteras genom en tillräcklig mängd blod för att möjliggöra bestämning av hemoglobinkoncentration, samtidigt som tillräckliga ljusintensiteter kan detekteras utan användning av en stark ljuskälla.

Nämnda organ för ljusemission, kyvetthållaren och detektorn kan vara anordnade i en fotometer. Fotometem tillhandahåller därmed en anpassad uppställning för utförande av analysen. Fotometern kan enkelt bäras så att analysen kan utföras där den behövs, tex vid vårdstället.

Bearbetningsenheten kan vara inbyggd i fotometern. Således kan fotometern ge analysresultat på en bildskärm hos fotometern och det finns inget behov av att använda ytterligare utrustning. Bearbetningsenheten kan dock alternativt anslutas till fotometern. Detta innebär att bearbetningsenheten kan anordnas i en dator, till vilken fotometern kan anslutas. Detta skulle medge att en användare analyserar resultaten av absorptionsmätningarna mer i detalj.

Detektorn kan ha en detektionsyta med en area sådan att i huvudsak endast direkt transmitterat ljus detekteras. Detta innebär att ljus som spridits i en avsevärt olik riktning inte detekteras, varigenom absorptionsmätningen bestämmer mängden ljus som transmitteras utan att ha spridits eller absorberats. Således kan mätningen anta att allt ljus som spridits i andra riktningar inte detekteras.

Detektorn kan anordnas närmare än 10 mm från provhållaren. Detta innebär ytterligare att enbart ljus som sprids i små vinklar detekteras.

Nämnda organ för ljusemission kan innefatta en ljuskälla, vilken är anordnad att emittera ljus vid den första våglängden och att emittera ljus vid den andra våglängden. Då kan filter användas för att säkerställa att provet 10 15 20 25 30 530* 244 11 belyses med den korrekta våglängden. Alternativt så kan nämnda organ för ljusemission innefatta en första ljuskälla, vilken är anordnad att emittera ljus vid den första våglängden, och en andra ljuskälla, vilken är anordnad att emittera ljus vid den andra våglängden. De olika ljuskällorna kan då på lämpligt sätt sättas på och stängas av för att belysa provet med korrekt våglängd.

Kortfattad beskrivning av ritnindarng Uppfinningen kommer nu beskrivas i mer detalj med hjälp av exempel och med hänvisning till de bifogade ritningarna.

Fig. 1 är ett flödesschema för ett förfarande i enlighet med uppfinningen.

Fig. 2 är ett schematiskt diagram över hemoglobins absorbans.

Fig. 3 är ett diagram som åskådliggör hur resultaten av en algoritm för bestämning av hemoglobinkoncentrationen varierar över tiden efter att ett prov erhållits.

Fig. 4 är en schematisk vy av ett system i enlighet med uppfinningen.

Detaljerad beskrivninggv en för närvarande föredraqen utförinqsform Med hänvisning till Fig. 1 kommer nu ett förfarande för hemoglobinbestämning enligt uppfinningen beskrivas. Först så fylls en kapillär kyvett av engångstyp med ett prov av oförändrat helblod, steg 1.

Således erhålls ett prov för analys. Analysen av blodprovet fördröjs , steg 2.

Detta kan åstadkommas med hjälp av ett instrument för utförande av analys är anordnat att påbörja analysen vid en förbestämd tidsperiod efter att kyvetten placerats i en hållare hos instrumentet. Denna fördröjning medger att rörelser inuti provet avstannar, varigenom verkan av röda blodkroppars ljusspridning minskar. Sedan utförs en första absorptionsmätning på provet vid en våglängd inom intervallet 490 - 520 nm, steg 3. Vidare så utförs en andra absorptionsmätning på provet, steg 4. Den andra absorptions- mätningen väljs så att skillnaden i absorbans mellan de två absorptions- mätningarna kan relateras enbart till hemoglobinkoncentrationen i provet, såsom kommer att beskrivas mer i detalj nedan. Slutligen så bearbetas 10 15 20 25 30 530 244 12 mätresultaten, steg 5, med användning av en förbestämd algoritm för bestämning av hemoglobinkoncentrationen i provet.

Mikrokyvetten av engångstyp som används i enlighet med föreliggande uppfinning kan vara av den typ som visas i US-patentet 4 088 448 eller företrädesvis i US-patentet 5 674 457 vilka härmed införlivas genom hänvisning. Kyvetten kan definieras som en enhetlig stomme som inkluderar minst en (1) kavitet med ett optiskt fönster (mätzon) varvid två, plana eller böjda, ytor som är vända mot kaviteten är placerade vid ett förbestämt avstånd från varandra och därigenom deflnierar en förbestämd optisk väglängd. Detta avstånd mellan ytorna som definierar mätzonen är en kritisk parameter när det gäller att tillhandahålla den korrekta optiska våglängden för hemoglobinmätning. Den optiska våglängden bör vara kortare än 1 mm för att säkerställa att intensiteten hos ljus om transmitterats genom ett prov i kyvetten är tillräckligt för att möjliggöra bestämning av hemoglobin i provet.

Enligt en föredragen utföringsform så är detta avstånd mindre än 0,2 mm, och mer företrädesvis mellan 0,05 och 0,2 mm. Avståndet mellan de inre ytorna hos resten av kaviteten är företrädesvis i storleksordningen 0,1 - 2 mm som är verksamt till att medge att provet kommer in i kaviteten genom kapillärkraft genom kavitetens inlopp, vilket står i förbindelse med stommens utsida.

Vidare så har kaviteten en förbestämd fix volym på mindre än cirka 25 pl. inga aktiva tillsatsmedel, såsom reagens eller hemolyseringsmedel, är nödvändiga för bestämning enligt det uppfinningsenliga förfarandet.

Kyvetterna enligt föreliggande uppfinning kan formas av vilket som helst lämpligt material, vilket medger skapandet av de nödvändiga snäva toleransgränserna. Företrädesvis tillverkas kyvetten genom formsprutning av ett genomskinligt polymermaterial.

I avsikt att undanröja problemen som är relaterade till det kapillära fyllandet av kyvetten så kan det vara nödvändigt att förbehandla kyvettens inre ytor för att ge dem en hydrofil karaktär. Detta kan åstadkommas genom att man ytbelägger ytorna med en lämplig detergent, såsom Brij 35. En annan möjlighet är att välja ett hydrofilt material för tillverkning av kyvetten.

En egenskap hos det uppfinningsenliga förfarandet är absorptionsbestämningen bör utföras vid en våglängd inom intervallet 490 - 10 15 20 25 30 530 244 13 520 nm, mer företrädesvis inom intervallet 500 - 510 nm, och helst vid 506 nm. Den sekundära absorptionsmätningen utförs med fördel vid en våglängd inom intervallet 650 - 1200 nm, mer företrädesvis inom intervallet 850 - 910 nm, och helst inom intervallet 860 - 900 nm.

Absorptionsmätningarna utförs direkt på helblodet i provet, dvs blodet är oförändrat (outspätt och ohemolyserat). lnom våglängdsintervallet 490 - 520 nm så är absorptionen från de fem olika hemoglobintyperna. dvs oxi-, deoxi-, karboxi-, met-, och sulf- hemoglobin, betydande och likartad. Således kommer absorptionen inom detta våglängdsintervall endast i liten utsträckning bero på distributionen mellan de olika hemogloblntyperna i blodet. Särskilt vid 506 nm så är skillnaden vad gäller absorbans mellan oxi- och deoxihemoglobin nära noll.

Eftersom dessa typer av hemoglobin dominerari normalt blod så kan absorptionen av oxi- och deoxihemoglobin med fördel användas för bestämning av en absorptionskoefficient för att sätta en uppmätt absorption i relation till hemoglobinkoncentrationen vid 506 nm. Följaktligen görs vissa antaganden vad gäller förekomsten av olika hemoglobintyper i blodprovet.

Således kommer inte hemoglobinbestämningen inte att vara så precis, eller bearbetningen av resultaten måste modifieras, ifall en mätning görs på ett blodprov som har en kraftigt awikande distribution av hemoglobintyperna.

Vidare så kommer mätningarna enbart att bestämma den totala hemoglobin- koncentrationen och inte koncentrationerna av de specifika hemoglobin- typerna.

En andra absorptionsmätning utförs vid en våglängd där ljus- absorptionen i blod är avsevärt mindre. En sådan absorptionsmätning kan lämpligen utföras vid en våglängd inom intervallet 650 - 1200 nm. Skillnaden mellan absorptionsmätningarna kan sedan antas bero på absorptionen av hemoglobin.

Ljusspridningen varierar dock med hemoglobinkoncentrationen i provet, men ljusspridningen är inte enbart beroende av hemoglobinkoncentra- tionen. Ljusspridningen beror på ljusets interaktion med partiklari blodet, såsom röda blodkroppar, vita blodkroppar och lipidpartiklar. l enlighet med uppfinningen så har man funnit att genom att fördröja analysen så kommer 10 15 20 25 30 530 244 14 rörelser i provet att avstanna och verkan av ljusspridning i provet kommer att minska. Således har det överraskande visat sig att kalibrering av ett mätinstrument kan användas för att hantera spridningsverkan och att hemoglobinkoncentrationen i ett prov direkt kan relateras till skillnaden vad gäller absorption mellan de två absorptionsmätningarna.

Principen med en algoritm för bestämning av hemoglobinkoncentra- tionen kommer nu att beskrivas med hänvisning till det schematiska dia- grammet i Fig. 2. I Fig. 2 så illustrerar den heldragna linjen schematiskt uppmätt absorption hos ett första prov som har en hög hemoglobinkoncentra- tion. Absorptionen inkluderar både verklig absorption och ljus som spridits så att det inte når en detektor. Den streckade linjen i Fig. 2 illustrerar schematiskt uppmätt absorption hos ett andra prov som har en lägre hemoglobinkoncentration. De uppmätta absorptionerna utförs efter en fördröjning på åtminstone en bestämd tidsperiod efter det att provet förvärvades in i en kyvett, varvid rörelser inuti provet har fått avstanna. Det bör noteras att det schematiska diagrammet i Fig. 2 endast betonar de huvudsakliga egenskaperna för absorption hos helblodsprov, och inte illustrerar absorption hos verkliga prov. Såsom kan ses i Fig. 2 så före- kommer det för båda proven en avsevärd skillnad i absorption mellan en första våglängd vid 506 nm och en andra våglängd vid 880 nm. Såsom beskrivs ovan så beror denna skillnad på hemoglobinkoncentrationen i provet och graden av ljusspridning i provet. När cellrörelserna inuti provet har fått avstanna så reduceras verkan av ljusspridning. Således beror sedan absorptionsskillnaden huvudsakligen på hemoglobinkoncentrationen i provet.

Det har nu visat sig att godtagbara resultat vad gäller bestämning av hemoglobinkoncentrationen i ett prov kan erhållas genom att man helt enkelt använder skillnaden i absorption mellan de två absorptionsmätningarna och relaterar den till hemoglobinkoncentrationen med hjälp av kalibrerings- konstanter.

I enlighet med vad som nämnts ovan så bör resultaten av absorptions- mätningarna bearbetas för bestämning av hemoglobinkoncentrationen i provet. Denna bearbetning kan utföras med hjälp av en förbestämd algoritm. 10 15 20 25 30 530 244 15 Denna algoritm beräknar hemoglobinkoncentrationen i enlighet med den ovan beskrivna modellen.

Bearbetningen kan bestämma hemoglobinkoncentrationen i provet genom att beräkna följande formel: [Tot Hb] = (AbS1 - Absg) >< k1 + kg varvid [Tot Hb] är den totala hemoglobinkoncentrationen i provet, Abs1 är den uppmätta absorbansen vid den första absorptionsmätningen, Absz är den uppmätta absorbansen vid den andra absorptionsmätningen, och k1 och k; är kalibreringskoefficienter, vilka beror på mätuppställningen. Kalibreringskoeffi- cienterna k1 och kg kan vara specifika för varje instrument som används för hemoglobinbestämning.

Kalibreringskoefficienterna kan bestämmas genom att man genomför absorptionsmätningar på en uppsättning av blodprov som har kända hemoglobinkoncentrationer. Dessa kalibreringsmätningar kan utföras vid ett instruments tillverkning. Vidare så kan kalibreringsmätningar utföras med regelbundna mellanrum i avsikt att säkerställa att instrumentet ger korrekta analysresultat. Sedan kan kaIibreringsmätningaruppdateras regelbundet i avsikt att hantera eventuella skillnader i instrumentets prestanda. l Fig. 3 visas tidsberoendet för analysens utförande. Fig. 3 visar hur resultaten av hemoglobinkoncentration, med användning av algoritmen som visas ovan, varierar beroende på den tidsperiod som passerar mellan det att man förvärvar blodprovet in i kyvetten och utför absorptionsmätningarna.

Fig. 3 visar resultaten för flera olika prov som har olika värden på hemoglobinkoncentrationen. Den tjocka linjen representerar ett genomsnittligt värde på hemoglobinkoncentrationen för samtliga prov. det värde som ges av algoritmen minskar tämligen avsevärt under de första sekunderna. Detta beror på att värdena på absorptionsmätningarna driver. Således är värdet på hemoglobinkoncentrationen stadigt när absorptionsmätningen fördröjs i minst 30 s, och algoritmen kan kalibreras till att ge korrekta resultat.

Absorptionsmätningarna kan med fördel fördröjas med 60 - 90 s i avsikt att 10 15 20 25 30 5130 244 16 erhålla förutsägbara resultat för algoritmen och möjliggöra att instrumentet blir korrekt kalibrerat.

Fördröjningen kan åstadkommas genom att man helt enkelt inte medger att absorptionsmätningen utförs förrän en förinställd tidsperiod passerat från placering av kyvetten i en hållare hos instrumentet. Fördröj- ningen kan dock alternativt åstadkommas genom att man medger att absorptionsmätningar utförs efter att det bekräftats att värdet på absorptions- mätningarna slutat driva. Detta kan åstadkommas genom att man övervakar värdet för åtminstone en av absorptionsmätningarna under en tidsperiod och bestämmer resultaten av absorptionsmätningarna som skall användas för bearbetning när värdet slutat driva.

Med hänvisning till Fig. 4 så kommer nu ett system som implementerar det ovan beskrivna förfarandet beskrivas. Systemet innefattar organ 10 för ljusemission vid en första våglängd inom ett första intervall på 490 - 520 nm och vid en andra våglängd inom ett andra intervall på 650 - 1200 nm. Detta organ 10 för emission av ljus kan realiseras av en kombination av en ljuskälla som emitterar vid flera olika våglängder eller inom breda våglängdsintervall tillsammans med filter. Således är ljuskällan anordnad att emittera ljus både vid den första våglängden och vid den andra våglängden. Med användning av filtret kan den emitterade våglängden styras selektivt till att hamna inom ett av dessa intervall. Alternativt så kan en första och en andra ljuskälla användas till att emittera den första respektive den andra våglängden. Lysdioder kan användas som ljuskällor. Sedan kan organ 10 för ljusemission, genom att man slår av och på de två ljuskällorna, styras selektivt till att emittera ljus vid den första eller vid den andra våglängden.

Företrädesvis emitteras den första våglängden av organ 10 för ljusemission inom intervallet 500 - 510 nm, mer företrädesvis vid 506 nm.

Vidare så emitteras den andra våglängden av organ 10 för ljusemission företrädesvis inom intervallet 850 - 910 nm, mer företrädesvis inom intervallet 860 - 900 nm.

Systemet innefattar vidare en kyvetthållare 12 anordnad att mottaga en kapillär kyvett, vilken har en optisk väglängd på mindre än 1 mm och håller ett prov av oförändrat helblod. När en kyvett placeras i hållaren 12 så kommer 10 15 20 25 30 530 244 17 det optiska fönstret positioneras korrekt så att det bestrålas med ljuset från ljuskällan. Företrädesvis så är hållaren 12 anordnad att mottaga en kyvett, vilken har en optisk våglängd på mindre än 0,2 mm, och mer företrädesvis inom intervallet 0,05 - 0,2 mm.

Systemet innefattar även en styrenhet 13 för skapande av en fördröjning på en förbestämd tidsperiod mellan det att kyvetten placeras i kyvetthållaren och man utför absorptionsmätningarna. Styrenheten 13 kommer således att säkerställa att det går en tillräcklig tidsperiod från det att ett prov förvärvas in i kyvetten och absorptionsmätningarna utförs på provet.

Detta kan åstadkommas med hjälp av en timer som åstadkommer en fördröjning med en förbestämd tidsperiod. Timern 13 kan mottaga indata från en sensor 13a som detekterar när en kyvett placeras i kyvetthållaren 12.

Timern 13 kan anordnas i en bearbetningsenhet i systemet l avsikt att mottaga en klocksignal för bestämning av fördröjningstidsperioden. När den förbestämda tidsperioden gått så kan timern 13 sända en signal till styrenheten 13b, vilken styr ljuskällans 12 verkan. Styrenheten 13b är sålunda aktiverad på så sätt att absorptionsmätningar kan påbörjas.

Alternativt så innefattar styrenheten en analysator som övervakar resultat av absorptionsmätningar. Analysatorn kan mottaga indata från en detektor 14 som detekterar ljus som transmitterats genom provet. När analysatorn identifierar att resultatet från detektorn 14 blivit i huvudsak konstant så kan analysatorn dra slutsatsen att den erforderliga tidsperioden har gått. Således kommer nu resultaten av absorptionsmätningarna vara stabila och styrenheten kan aktivera styrenheten 13b på så sätt att absorptionsmätningar som ger resultat som skall bearbetas kan påbörjas.

Ljuset som transmitteras genom provet kommer att detekteras av en detektor 14 så att en första absorptionsmätning kan erhållas för ljus inom det första intervallet och en andra absorptionsmätning kan erhållas för ljus inom det andra intervallet.

Systemet innefattar vidare en bearbetningsenhet för bearbetning av resultat av den första och den andra absorptionsmätningen i avsikt att bestämma hemoglobinkoncentrationen i provet i enlighet med algoritmen som beskrivs ovan. 10 15 20 25 530 244 18 Systemet kan lämpligen implementeras i en fotometer som innefattar organ 10 för ljusemission, kyvetthållaren 12, och detektorn 14. Fotometrar som är lämpade för att utföra dessa mätningar kan erhållas genom användning av fotometrar som är modifierade med lämpliga våglängdsfilter och lysdioder. l enlighet med en föredragen utföringsform av uppfinningen så mäter en fotometer absorbansen vid de två våglängderna och en inbyggd mikroprocessor beräknar, i enlighet med en programmerad algoritm, den totala hemoglobinkoncentrationen i blod. Således behövs inga särskilda absorptions- eller interferensfilter som justerar för variationer i detektorns känslighet och i den verksamma våglängden såsom visas i WO 01/53806.

I fallet ovan så är bearbetningsenheten 16 inbyggd i fotometern.

Bearbetningsenheten 16 kan dock även vara ansluten till fotometern, och således förekomma utanför fotometern. T ex kan en dator som är ansluten till fotometern användas.

Detektorn 14 kan anordnas att detektera väsentligen enbart direkt transmitterat ljus, eftersom det spridda ljuset inte behöver detekteras. Detta innebär att detektorn 14 detekterar ljus som i huvudsak är inom diametern hos den ljusstråle som bestrålar provet och transmitteras direkt genom provet. Självklart kan en del ljus spridas samtidigt som det fortfarande förekommer inom denna diameter. I enlighet med en föredragen utföringsform kan diametern hos en detektionsyta hos detektorn 14 typiskt vara cirka 2 mm.

Detektorn 14 är företrädesvis anordnad närmare än 10 mm från provhållaren.

Detta innebär att ljus som har spridits i små vinklar detekteras.

Det föregående harvarit en beskrivning av en särskild föredragen utföringsform av föreliggande uppfinning, men det är inte avsett att på något sätt begränsa uppfinningen. l själva verket kan många modifikationer, variationer, och förändringar av detaljer göras inom föreliggande uppfinnings omfång.

Claims (29)

10 15 20 25 30 530 244 1 9 PATENTKRAV

1. Förfarande för kvantitativ hemoglobinbestämning i outspätt, ohemolyserat helblod innefattande: att man förvärvar ett prov av oförändrat helblod in i en kapillär kyvett; att man introducerar nämnda kyvett för en uppställning för en absorptionsmätning; att man fördröjer absorptionsmätning under en bestämd tidsperiod; att man utför en första absorptionsmätning vid en första våglängd inom intervallet 490-520 nm direkt på provet i kyvetten; att man vidare utför en andra absorptionsmätning vid en andra våglängd som skiljer sig från den första våglängden och vid vilken absorptionen är avsevärt mindre än vid den första våglängden; och att man bearbetar resultat från den första och den andra absorptions- mätningen i avsikt att bestämma hemoglobinkoncentrationen i provet.

2. Förfarande enligt krav 1, varvid nämnda fördröjande utförs under en förbestämd tidsperiod som är förinställd innan provet förvärvas.

3. Förfarande enligt krav 2, varvid nämnda introducerande innefattar att man placerar kyvetten i en hållare hos ett instrument för utförande av absorptionsmätningar.

4. Förfarande enligt krav 3, varvid nämnda förbestämda tidsperiod påbörjas när kyvetten placeras i hållaren.

5. Förfarande enligt något av kraven 2-4, varvid nämnda förbestämda tidsperiod är minst 30 s, mer företrädesvis inom intervallet 60-90 s.

6. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid nämnda bearbetning utförs med hjälp av en förbestämd algoritm.

7. Förfarande enligt krav 5, varvid nämnda bearbetning bestämmer hemoglobinkoncentrationen i provet genom beräkning av följande formel: [Tot Hb] = (AbS1 -Abs2) x k1 + kg varvid [Tot Hb] är den totala hemoglobinkoncentrationen i provet, Absj är den uppmätta absorbansen vid den första absorptionsmätningen, Abs2 är den 10 15 20 25 30 530 244 20 uppmätta absorbansen vid den andra absorptionsmätningen, och k1 och kg är kalibreringskoefficienter, vilka beror på mätuppställningen.

8. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid den första absorptionsmätningen utförs vid en våglängd inom intervallet 500 - 510 nm. merföreträdesvis vid 506 nm.

9. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid den andra absorptionsmätningen utförs vid en våglängd inom intervallet 650 - 1200 nm, mer företrädesvis inom intervallet 850 - 910 nm, helst inom intervallet 860-900 nm.

10. Förfarande enligt något av de föregående kraven, varvid nämnda kyvett har en optisk väglängd på mindre än 1 mm, mer företrädesvis mindre än 0,2 mm.

11. Förfarande enligt krav 10, varvid nämnda kyvett har en optisk våglängd inom intervallet 0,05 - 0,2 mm.

12. Förfarande enligt krav 1, varvid nämnda fördröjning utförs genom att man övervakar resultat av absorptionsmätningar och att man, när resultaten är i huvudsak konstanta, medger att den första och den andra absorptionsmätningen utförs i avsikt att bestämma hemoglobinkoncentra- tionen i provet.

13. System för kvantitativ hemoglobinbestämning i outspätt, ohemolyserat helblod innefattande: organ för emission av ljus vid en första våglängd i ett första intervall på 490-520 nm och vid en andra våglängd i ett andra intervall vid vilken absorption av ljus i blod är avsevärt mindre än vid den första våglängden; en kyvetthållare som är anordnad att mottaga en kapillär kyvett, vilken håller ett prov av oförändrat helblod; en detektor för detektion av ljus som transmitterats genom provet vid en första absorptionsmätning med avseende på ljus inom nämnda första intervall och vid en andra absorptionsmätning med avseende på ljus inom nämnda andra intervall; en styrenhet för skapande av en fördröjning på en bestämd tidsperiod mellan det att kyvetten placeras i kyvetthällaren och absorptionsmätningar utförs; och 10 15 20 25 30 530 244 21 en bearbetningsenhet för bearbetning av resultat från den första och den andra absorptionsmätningen i avsikt att bestämma hemoglobinkoncentra- tionen i provet.

14. System enligt krav 13, varvid nämnda organ för emission av ljus, kyvetthållare och detektor är anordnade i en fotometer.

15. System enligt krav 14, varvid nämnda bearbetningsenhet är inbyggd i fotometern.

16. System enligt krav 14, varvid nämnda bearbetningsenhet är ansluten till fotometern.

17. System enligt något av kraven 13-16, varvid en detektionsyta hos detektorn har en storlek sådan att i huvudsak endast direkt transmitterat ljus detekteras.

18. System enligt något av kraven 13-17, varvid detektorn är anordnad närmare än 10 mm från provhållaren.

19. System enligt något av kraven 13-18, varvid nämnda organ för emission av ljus innefattar en ljuskälla, vilken är anordnad att emittera ljus vid den första våglängden och att emittera ljus vid den andra våglängden.

20. System enligt något av kraven 13-18, varvid nämnda organ för emission av ljus innefattar en första ljuskälla, vilken är anordnad att emittera ljus vid den första våglängden, och en andra ljuskälla, vilken är anordnad att emittera ljus vid den andra våglängden.

21. System enligt något av kraven 13-20, varvid den första våglängden som emitteras av nämnda organ för emission av ljus är inom intervallet 500 - 510 nm, mer företrädesvis vid 506 nm.

22. System enligt något av kraven 13-21, varvid den andra våglängden som emitteras av nämnda organ för emission av ljus är inom intervallet 650 - 1200 nm, mer företrädesvis inom intervallet 850 - 910 nm, helst inom intervallet 860 - 900 nm.

23. System enligt något av kraven 13-22, varvid kyvetthållaren är anordnad att mottaga en kyvett, vilken har en optisk våglängd på mindre än 1 mm, mer företrädesvis mindre än 0,2 mm.

24. System enligt krav 23, varvid kyvetthållaren är anordnad att mottaga en kyvett som har en optisk väglängd inom intervallet 0,05 - 0,2 mm. 10 15 20 530 244 22

25. System enligt något av kraven 13-24, varvid nämnda bearbetningsenhet använder en förbestämd algoritm för utförande av nämnda bearbetning.

26. System enligt krav 25, varvid nämnda bearbetning bestämmer hemoglobinkoncentrationen i provet genom beräkning av följande formel: [Tot Hb] = (Abs1 - Absg) x k1 + kg varvid [Tot Hb] är den totala hemoglobinkoncentrationen i provet, Abs1 är den uppmätta absorbansen vid den första absorptionsmätningen, Abs2 är den uppmätta absorbansen vid den andra absorptionsmätningen, och k1 och kg är kalibreringskoefficienter, vilka beror på mätuppställningen.

27. System enligt något av kraven 13-26, varvid nämnda styrenhet innefattar en timer för skapande av en fördröjning på en förbestämd fidspeflod.

28. System enligt krav 27, varvid timern är anordnad att orsaka en fördröjning på minst 30 s, merföreträdesvis inom intervallet 60-90 s.

29. System enligt något av kraven 13-26, varvid nämnda styrenhet innefattar en analysator för övervakning av resultat av absorptionsmätningar och varvid nämnda styrenhet möjliggör utförande av absorptionsmätningarna som svar på att analysatorn identifierar att de övervakade resultaten är i huvudsak konstanta.