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Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Präparaten
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für die Mikroskopie, insbesondere Elektronenmikroskopie aus nativen
histologischen Objekten sowie physikochemisch ähnlichen Frodukten durch Kryofixation
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und eine zu dessen Durchführung besonders
geeignete Anordnung zur Kryofixation von nativen histologischen menschlichen, tierischen
oder pflanzlichen Objekten sowie von physikochemisch ähnlichen Praparaten mit hohem
Wassergehalt und im wässerigen Ledium kolloid und/oder molekular dispergierten Inhaltsstoffen.
Die Erfindung zielt insbesondere darauf ab, für die Zwecke der Elektronenmikroskopie
ein reproduzierbares rapides Einfrieren bestimmter Objektzonen zu ermöglichen, ohne
daß hierfür eine besondere Geschicklichkeit oder Übung der Bedienungsperson bzw.
eine chemische Vorbehandlung des Objektes mit Gefrierschutzmitteln und/oder durch
chemische Fixation nötig wäre.
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Nach dem Stande der Technik werden native, d.n. in keiner Weise vorbehandelte
histologische Objekte für licht- oder elektronenoptischs Unmtersuchungen immer häufiger
dadurch fixiert, daß sie einer rapiden Abkühlung untervorfen werden, die die Lebensprozesse
schlagartig zum Stillstand bringt und das Objekt damit in einem Zustand stabilisiert,
der dem Lebenszustand sehr nahe kommt ("Kryofixation"). Die Qualität dieser Kryofixation
ist dabei primär im weiten Umfang von der Geschwindigkeit
der
Abkühlung ("Abkühlungsrate") abhängig. Nur bei Abkühlungsraten in der Größenordnung
von 10.000°/sec resultiert ein 'glasartiges" Erstarren ("Vitrifizieren") des Objektes,
welches insbesondere für eine nachfolgende elektronenoptische Untersuchung sowie
für eine damit gekoppelte Elektronenstrahl-Mikroanalyse hoher Auflösung eine unabdingbare
Voraussetzung darstellt. Sinkt die Abkühlungsrate erheblich unter 10.000°/sec, so
tritt eine Entmischung der wasserigen plasmatischen Mischphasen ein, welche zur
Bildung von störenden Eiskristallen führt, was bereits aus der Tieftemperaturkonservierung
von lebensmitteln und Blut bekannt ist und eine sinnvolle morphologische oder cnemische
nalyse der Ultrastruktur vollkommen ausschließt. Diese Eiskristallbildung läßt sic
nur durch die schon erwähnte chemische Vorbehandlung der Objekte tritt Gefrierschutz-
und/oder Fixationsniedien vorhindern, welche abcr ihrer.ieits die Objekte in einen
Zustand überführen, der vom Lebenszustand erheblich abweicht.
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Neuerdings ist man daher bestrebt, die Objekte ohne jede Vorbehandlung,
also "nativ" einzufrieren. Für die Bildung von Eiskristallen in derartigen nativen
Geweben ist nicht in jedem Fall eine zu niedrige Abkühlrate die Ursache. Es können
sich vielmehr in einem bei einer Kühlrate über 10.000°/sec primär glasig erstarrten
Objekt sekundär Eiskristalle im Wege eines Rekristallisationsprozesses bilden, z.B.
wenn das eingefrorene Objekt für längere Zeit auf Temperaturen über 180°K erwärmt
wird. Es müssen also beide Bedingungen, nämlich eine hohe Abkühlungsrate von rund
10.000°/sec sowie weitere Präparation unterhalb 130°C, strikt eingehalten werden,
wenn man Eiskristallartefakte vermeiden und damit geeignete Objekte für eine morphologische
und/oder chemische Analyse hoher oder höchster Auflösung erhalten will.
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Da sich beim Abkühlen eines Objektes der Temperaturgradient zwischen
seiner unmittelbaren Umgebung und der Front der in das Objektinnere vordringenden
"Kältewelle" sehr rasch verringert, können aus naturgesetzlichen Gründen nur in
einer äußeren Randzone von rund 50 µm diejenigen hohen Abkühlungsraten in der Größenordnung
von 10.000°/sec erzielt werden, welche primär für ein glasartiges Erstarren erforderlich
sind. Die exakte Breite dies er gut erhaltenen Randzone ist dabei sowohl vom Objekt
wie von der Kühlmethode abhängig. Methodisch entscheiden vor alle des Wärmeleitvermögen
und die Wärmekapazität des Nühlmediums ("Kryogen") über die zeitliche Veränderung
des Temperaturgradienten und dairit er die Akühlungsraten von Zonen, welche verschieden
weit von der Objektoberfläche entfernt sind.
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Beim Einwerfen der Objekte in ein verflüssigtes, in der Regel auf
Siedetemperatur befindliches Gaz (beispielsweise N2fl), tritt das Leidenfrost'sche
Phänomen, d.i. eine Isolationswirkung durch einen sofort entstehenden Gasmantel,
auf. Dies läßt sich zwar durch teilweises Verfestigen von H2fl im Wege einer kurzfristigen
Druckminierung oder durch Verwenden eines Kryogens mit höherem Siedepunkt (beispielsweise
tiefgekühltes Propan) ausschalten, nicht zu beseitigen @ i@@ en das schlechte Wärmeleitvermogen,
insbesondere auch @e geringe Wärmekapazität aller flüssigen Kryogene. Diese @ide@
Eigenschaften bewirken, daß die dem Objekt eben entzogene Wärme zu einer Temperaturerhöhung
im unmittelbar angrenzenden Kryogen führt und ihrerseits einen noch rascheren Asfall
der Abkühlungsraten bzw. eine noch geringere Breite der brauchbaren, glasartig erstarrten
Randschicht des Objektträgers zur Folge hat.
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Diesem Nachteil kann nach einer in jüngster Zeit bekannt gewordenen
Methode dadurch begegnet werden, daß man, wie in Fig.1 der angeschlossene @e@ @nung
dargestellt ist, de zu unterzuchende Objekt 1 mit relativ großer Geschwind. @t auf
die hochganzpolierte freie Oberfläche eines tiefgekühlten Metallblockes 2 aufbringt.
Eine derar @ @orin@ @ zur Kryofixation auf tiefgekuhlten @@nl@@@ @@@ e @ @wargefäß
3 auf, das mit einem fläche, @@ beispielsweise
N2fl, gefüllt ist,
in welches der metallblock bzw. Metallzylinder 2 eintaucht. Dieser Zylinder ist
in eine Hülse eine gehangt, die ihrerseits in einem Kunststoffdeckel 6 montiert
ist. Die durch die polierte Oberflache des Blockes 2, die Innenwand der Hülse 5
sowie des Deckels 6 begrenzte Kühlkammer 7 wird mit einem Künststoffplätchen 8 abgedeckt,
das erst unmittelbar vor der Injektion des an einem Stempel 9 befestigten Objektes
1 in die Kühlkammer entfernt wird. Auf diese Weise wird in der Kühlkammer 7 eine
hinreichend tiefe Temperatur erzielt, ohne daß sich Luftfeuchtigkeit niederschlägt
und die Küiilfläche mit einer isolierenden Eisschicht überzieht. Diese "Frostfreiheit"
wird in bekannter gleise bei N2fl-Eühlung zusätzlich dadurch gewährleistet, daß
man das laufend durch den Siedeprozeß gebildete Gas (N2g) durch entsprechend in
der Hülse 5 sowie im Kunststoffplättchen 8 angeordnete Bohrungen in Pfeilrichtung
ableitet, wodurch die Kiihlkammer 7 stets r.iit einem "Kältesee" kalten Stickstoffgases
gefüllt bleibt, welches auf Grund seiner Dichte das Eindringen der leichteren warmfeuchten
Luft verhindert.
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Die einwandfreie Funktion der in Fig.1 dargestellten .nordnung ist
allerdings davon abhängig, daß einige Bedingungen eingehalten werden. So ist es
- insbesondere bei harten oder inhomogenen Objekten - wichtig, daß die Oberfläche
FF' des Objektes 1 exakt plan sowie.planparallel zur Kühlfläche KK' des Metallblockes
2 ausgerichtet ist, weil im Falle einer Neigung der beiden Flächen zueinander nur
eine sehr schmale Kontaktzone bei der ersten Berührung einwandfrei fixiert wird.
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Ebenso wichtig ist, daß das Objekt vor dem Auftreffen auf der tiefgekühlten
Fläche KK' des Metallblockes 2 keiner vorzeitigen langsamen Abkühlung unterliegt,
weil es sich hierdurch im "Kälteschock" bekanntlich sehr rasch verändern kann. Das
Einbringen des Objektes 1 in die Kühlkammer 7 in Pfeilrichtung, d.i. der "Injektionsprozeß",
muß daher sehr rasch erfolgen.
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Dabei soll aber das Objekt 1 wiederum nicht zu stark auf die Kühlfläche
KK' aufgepreßt werden, weil hieraus Quetschungen resultieren, welche die Feinstruktur
erheblich verändern
können; der Stempel 9 darf daher keine zu große
träge Masse aufweisen.
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Die größten Probleme treten jedoch vor der eigentlichen Kryofixation,
nämlich schon beim Entnahmen, Anschneiden und axakt orientierten Befestigen des
Objektes am Stempel ein.
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Diese Probleme erscheinen nach dem gegenwärtigen Stande der Technik
nach nicht befriedigen gelöst, obschon sie von entscheidender Bedeutung für den
Erfolg oder Mißerfolg sowie die Reproduzierbarkeit der Kryofixation sind. Hierbei
ist zu berücksicktigen, daßdie meisten menschlichen und tierischen sowie viele pflanzliche
Objekte, wie Muskelfleichen und tierischen Leber, wiere, Lung oder Knorpel, im natürlichen
Zustand infolge iher gallertig-elastisch-schlüpfrigenKonsistenz ausgesarocken schwer
reproduzierbar zu schneiden und an einem sind Stempel zu befestiger. Des weiteren
mässen an des Schneideprozeß selbst, an die Kalterung beim Schneiden und am Stempel
sowie an das Herstellen der planen Flächen FF' für die Kryofixation höchrte Ansprüche
hinsichtlich Objektschonung und Geschwindigkeit der Arbeit gestellt werden. So ist
es bekanntlich nur durch extrem "ziehendes Schneiden" sowie durch extrem niedrig
schaltene Flächenbelastungen beim Andrücken und Haltern möglich, solche Quetschungen
zur vermeiden, welche die Feinstruktur verändern. Anderseits läßt sich, insbesndere
bei der Kryofixation der vorwiegend interessierenden Organe und Gewebe von Warmblütern,
nur dann die gewönschte lebensgetreue Darstellung der Ultrastruktur bzw. der Anordnung
der verschiedenen chemischen Substanzen realisieren, wenn zwischen dem Unterbrechen
des Blutkreislaufes bzw. der Entnahme des Objektes und der Kryofixation nur eine
kurze Zeitspanne verstreicht. Maximal stehen für die gesamte Vorpräparation (Objektentnahme,
Zuschneiden und Befestigen des Objektes) bis zur Kryofixation etwa 5 sec zur Verfügung.
Die gebotene Eile erschwert daher die genaue Einhaltung der verstehend erläuterten
Bedingungen.
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Ein im unmittelbaren Zusammenhang mit der angestrebten Herstellung
von Präparaten für die Mikroskopie, insbesondere Elektronenmikroskopie stehendes,
nach dem derzeitigen Stande der Technik ebenfalls noch ungelöstes Problem ist im
sogenannten "Krystransfer" gelegen. Das eingefrerene Objekt muß im Anschluß an die
Kryofization zur weiteren Präparation entweder in eine Gefrierätzenlage, in ein
Kryoultramikrotom, in eine Gefriertrocknungsanlage oder in eine tiefgekühlte Flüssigkeit
zur Gefriersubstitution überführt werden. Da nur die im direkten Kontakt mit der
MEtalloberfläche "glasig" erstarrte äußerste Randschicht des Objektes für die nachfolgende
Untersuchung im Elektronenmikroskop bzw. im Elektronenstrahl-Mikroanalysator von
Interesse ist, ist das Problem besonders schwer lösbar, weil sich derart dünne Wandschichten
in einer Umgebung hüherer Temperatur extrem rasch aufwärmen. Auch ein sehr schneller
Transfer durch Luft bei Raumtemperatur würde daher durch eine sekundäre Rekristallisation
zur Bildung von Eiskristallen und damit zur irreversiblen Zerstörung der intreessierenden
Randzone führen.
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im Rahmen der Erfindung, ist schließlich, sofrno die vorstehend geschilderten
vorrangigen Probleme gelöst sind, auch eine weitere Reduktion der Temperatur der
Kühlfläche technisch sinnvoll. Es wurde bereits empfehlen, tellweise im Vakuum verfestigten
Stickstoff als Kryogen zum Kühlen des Metallblockes 2 zu verwenden, doch vermag
die relativ geringe Temperaturdifferenz zwischem dem Festpunkt und Siedepunkt des
Stickstoffs den damit verbundenen erhuhten apparativen Aufwand, bei einer nur schwierig
erfaßbaren größeren Breiteder glasartig erstarrten Randzone des Objektes, nicht
zu rechtfertigen. Demgegenüber wäre es von großem Interesse, die Temperatur der
metallischen Kühlfläche auf eine Temperatur abzusenken, welche dem absoluten Nullpunkt
relativ nahekommt. Alle Versuche, hierfür flüssiges helium als Kryogen einzusetzen,
scheiterten bislang an der extrem geringen Dichte und Wärmekapazität des Hefl, so
daß auch nach dem gegenwärtigen Stand der Technik für eine derartige Verbesserung
der Kryofixation noch keine apparative Lösung bekannt Geworden ist. Ein Fortschritt
in dieser Richtung
erschiese vor allem deshalb von besonderem Interesse,
weil sich die andre mögliche alternative zu einer Verbreiterung der Masig erstarrten
Re@lzens von größeren nativen und frisch angeschnittenen biologischen Objekten durch
extrem erhöhte Drucke praktisch nur scher nutzen läßt. Abgeschen von der Frage der
druckbedingten Objektveränderungen ("Druckschuock") erscheint dabei die freie der
Objektentnahme und der Abkühlung sowie überhaupt eines tragbaren apparativen Aufwandes
ungelöst.
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Zweck der Erfindung ist es zunächst, die auf die Entnahme des Untersuchungsgutes
aus dem größeren Organismus folgenden Präparationnschritte bin zur Kryofixation
sowie den anschliessend zur weitere Präparation gewünschten Kryotransfer verfahrensmäßig
so zu gestalten, daß die Arbeitsschritte bis zur Kryofixation unter einwandfrei
reproduzierbaren Bedingungen rausch, sowie ohne Schädigung der Objektes durch quetschungen
oder das Risiko einer Verschiebung nicher durchgeführt werden können und daß das
kryofixierte Objekt anschließend ohne die Gefahr einer schädlichen Erwärmung seiner
äußersten Randzone in die Geräte bzw. Lösungen überführt werden kann, in denen die
weitere Präparation stattfindet.
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Die Erfindung berüht im Prinzip auf einer besonders nützlichen Verknüpfung
mhrerer Veraurensschritte, wobei zunächst das entnommene Objekt in ein, zweckmäßig
seiner Form entsprechendes Aufnachmelement eingelegt und in diesem infolge der großen
Auflagefläche bei geringen Auflagedrucken sicher gehalten wird, aus dem so gelagerten
Objekt durch eine einseitig mit einer Ringschneide versehene zylindrische Hülse
("Bohrhülse"), vorzugsweise unter drehender Bewegung um ihre Längsachse, ein Zylinder
entnommen wird, wobei die Bohrhülse sowohl der Entnahme des interessierenden Objektteiles
wie seiner Halterung dient, worauf der entnommene Zylinder aus der ihn halternden
Hülse, z.B. mittels eines Stempels, zum Teil vorgeschoben und d,,nach mittels eines
Messers unterhalb der Bohrhülse so abgeschnitten wird, daß die interessierenden
Objektstrukturen
freigelegt werden. Die Erfindung sieht des weiteren
vor, daß bei Abschluß dieser Schneidebewegung automatisch die Kühlkammer geöffnet
und eine Injektionsbewegung der Bohrhülse in Richtung auf den Boden der Kühlkammer
ausgelöst wird, auf deren tiefgekühlter metallischer Kühlfläche der Objektzylinder
rapid aufgefroren wird. Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist darin gelegen,
daß in der Kühlfläche eine öffnung vorgesehen wird, durch welche der eingefrorene
Objektzylinder ohne Verlassen der Kühlkammer direkt in das zur Kühlung der Metallfläche
verwendete flüssige Kryogen abgeworfen wird, wodurch ebenso eine sichere lagerung
des eingefrorenen Objektes während weiterer nachfolgender Kryofixationen wie ein
sicherer Kryotransfer unter flüssigem Kryogen ("Kühlkette") ermöglicht wird.
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Eine vortellhafte weitere Ausgetaltung der Erfindung beruht schließlich
darauf, daß die Kühlung des Objektes innerhalb der Kühlkammer auf einem speziellen
kleinen metallischen Kühlkörper erfolgt, dessen metallische Kühlfläche und Wärmekapazität
im Vergleich zu dem verhältnismäßig großen, in das Kühlmedium eintauschenden metallischen
Kühlelement erheblich reduziert ist und welcher Kühlkörperseinerseits thermisch,
bis auf den zur Kryofixation verwendeten polierten Oberflächenabschnitt, durch eine
teil geeignete Isolationsmasse zum Haupt/ umschlossen ist, deren äußere Oberfläche
möglichst weitgehend durch einen auf die Temperatur von N2fl gekühlten metallischen
Mantel abgedeckt wird. Dieser eingeschlossene kleine Kühlkörperkann dabei entweder
nach N2fl-Vorkühlung mit lIefl weiter abgekühlt oder, in einer Variation dieser
zweistufiger Kühlung, über ein Peltier-Kühlelement an dns N2fl-gekühlte Metallelement
angekoppelt werden, das in jedem Fall zur Vorkühlung sowie zur Aufrechterhaltung
einer niederen Umgebungstemperatur für den, die Kühlfläche für die Kryofixation
aufweisenden kleinen Kühlkörperim Sinn eines zweistufigen Kryosystems dient.
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Das erfindun0sgemäße Verfahren zur erstellung von Präparaten für
die Likroskopie, insbesondere für die Elektronenmikroskopie sowie Histochemie, insbesondere
Zytochemie, durch Kryofixation auf tiefgekühlten Metallflächen ist im wesentlichen
durch die folgenden, vorzugsweise sehr rasch aufeinander folgenden Verfahrensschritte
gekennzeichnet: (a) Ausstanzen eines Zylinders aus einer frisch entnommenen und
mit ausgedehntem Flächenkontakt gelagerten Probe des zu untersuchenden Objektes
mittels einer Bohrhülse, vorzugsweise unter mehrfach reversierender drehender Bewegung
der Hülse um ihre Längsachse, und Herstellen einer frischen Anschnittfläche senkrecht
zur Längsachse des Objektzylinders in unmittelbarer Nähe der Bohrhülsenschneide;
(b) Injektion der Bohrhülse samt Objektzylinder in eine Kühlkammer bis zum Auftreffen
der frischen Anschnittfläche des Objektzylinders auf einer planparallel zu ihr liegenden
tiefgekiihlten hochglanzpolierten l.;etallfläche der Kühlkammer, sofortiges Auffrieren
auf der metallischen Kühlfläche, Abziehen der Bohrhülse von dem einseitig aufgefrorenen
Objektzylinder und vollständiges Durchfrieren des Objektzylinders bei verschlossener
Kühlkammer; (c) Abtrennen des auf gefrorenen Objekt zylinders von der metallischen
Kühlfläche durch leichtes Kippen und Abwerfen des Objektzylinders durch eine in
unmittelbarer Nähe zur Auffrierstelle vorgesehene Öffnung in der metallischen Kühlfläche
in ein darunter befindliches flüssiges Kühlmedium, beispielsweise verflüssigter
Stickstoff; (d) Kryotransfer der einzelnen oder mehrerer, beispielsweise in ein
und derselben Kryofixationsserie hergestellten und bis zum Abschluß der Verfahrensschritte
(a) bis (c) im flüssigen Kühlmedium gelagerten gefrorenen Objektzylinder in andere
Kryosysteme oder tiefgekühlte Lösungen zum Zweck der weiteren Verarbeitung unter
flüssigem Kühlmedium, beispielsweise verflüssigtem Stickstoff.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorteilhaft
in der Weise vorgegangen, daß ein frisch entnommenes Objekt zunächst in eine wanne
eingelegt und durch einen Deckel fixiert wird; dabei sollen die Formen der Wanne
einem Abdruck der Objektform in der Weise entsprechen, daß eine große Auflagefläche
entsteht und die zum Haltern notwendigen Kräfte infolge dieser großen Fläche nur
zu relativ geringen und äußerst gleichmäßigen Auf lagedrucken führen. In weiterer
Folge wird hierauf durch die Bohrhülse unter drehender Bewegung, entsprechend einem
Korkbohrer,mit "ziehendem Schnitt" aus dem in der beschriebenen Weise gehalterten
Objekt ein Zylinder entnommen, der mit der nun als Halterung dienenden Hülse aus
dem Objekt herausgezogen wird. Der so ausgestanzte Objektzylinder wird danach mittels
eines Stempels etwas aus der Hülse herausgeschoben, so daß mit Hilfe eines schräg
angestellten ljlessers, wiederum in "ziehendem Schnitt", unmittelbar unter der Bohrhülsenschneide
und planparallel zu der durch diese Schneide definierten Ebene eine frische Anschnittfläche
hergestellt wird, welche wiederum planparallel zu der in der Kiihlkammer befindlichen
tiefgekühlten Metallfläche für die Kryofixation liegt, so daß Anschnittfläche und
Kuhlfläche genau senkrecht zur Längsachse der Bohrhülse bzw. des Objektzylinders
verlaufen. Unmittelbar nach dem Herstellen dieser frischen Anschnittfläche wird,
zweckmäßig durch die Messerbewegung, ein Mechanismus in Gang gesetzt, der die Kühlkammer
öffnet und die Injektionsbewegung der Bohrhülse mit dem frisch angeschnittenen Objektzylinder
in die Kühlkammer bis zum Auffrieren des Ob-.
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jektzylinders auf der metallischen Kühlfläche samt dem Abziehen der
Bohrhülse von dem Objekt zylinder sowie das Wiederverschließen der Kühlkammer auslöst.
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Als besonders vorteilhaft im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens
erweist sich, daß das eingefrorene Objekt nach dem Loslösen von der metallischen
Kühlfläche einfach durch eine neben dem zur Kryofixation genutzten Flächenabschnitt
gelegene Bohrung in der Kühlfläche unmittelbar in das zur Tiefkühlung verwendete
flüssige Kryogen abgeworfen werden kann, wodurch eine Erwärmung der gut-erhaltenen,
glasig erstarrten Randzone des Objektes über 18001, mit sicherheit ausgeschlossen
wird.
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Anschließend an dieses direkte Abwerfen kann sowohl eine längere Lagerung
bei tiefer Temperatur erfolgen, wie auch ein gewünschter oder notwendiger Kryotransfer
unter flüssigem Kühlmedium nun auf einfache Weise rnoglich ist.
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Schließlich kann in eiterr Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens
eine Kryofixation bei weiter gesenkter Kühlflächentemperatur dadurch herbeigeführt
werden, daß anstelle der einstufig mit N,fl gekühlten Metallfläche im Ausinaß von
etwa 3 cm² oder mehr,unter Bibehaltung aller anderen Verfahrensschritte und der
dazu dienenden Anordnungen, ein zweistufiges Kühlsystem verwendet wird, wobei in
der ersten, auf höherem Temperaturniveau liegenden Stufenweiterhin mit N2fl abgekühlt
wird und in einer zweiten Kühlstufe ein von der Kühlkammer umgebener und von ihr
durch einen Isolationsmantel isolierter zweiter Kühlkörperkleinerer Wärmekapazität
mit einer freien Kühlfläche unter 1 cm² für weiter die Kryofixation/asbgeküphlt
wird.
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Dies kann in der Weise geschehen, daß der In der Kühlkammer befindliche
kleinere Kühlkörpernach der in der ersten Stufe erfolgten N2fl-Vorkühlung nun mittels
flüssigen Heliums oder eines gegen die mit flüssigem Stickstoff gekühlte Lletallfläche
der ersten Stufe arbeitenden Peltier-Kühlelementes auf Temperaturen im Bereich von
10°K abgekühlt wird.
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Bei der Arbeit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird sowohl durch
die einzelnen Verfahrensschritte wie durch ihre sinngemäße Verknüpfung im gesamten
Verfahrens ablauf eine solche Geschwindigkeit und Sicherheit bei der Präparation
erreicht, die eine Kryofixation empfindlicher Objekte, insbesondere solcher mit
starkem Stoffumsatz, überhaupt erst ermöglicht und für alle
übrigen
einfacheren Arbeiten einen entscheidenden Vorteil gegenüber allen bisher bekannten
Verfahren erbringt.
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Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders
geeignete Vorrichtung, die ein das flüssige Kühlmedium aufnehmendes Dewargefäß,
ein in das Kühlmedium eintauchendes metallisches Kühlelement und einen isolierenden
Deckel umfaßt, in welchem eine Kühlkammer mit hochglanzpolierter metallischer Kühlfläche,
die mit dem Kühlelement in Verbindung steht, für die Kryofixation ausgebildet ist,
ist im Prinzip gekennzeichnet durch eine einseitig mit einer Schneide versehene,
vertikal orientierte Bohrhülse für das Ausstanzen eines Zylinders aus aus dem zu
untersuchenden Objekt, welche Bohrhülse in Längsrichtung bewegbar und vorzugsweise
um ihre Längsachse drehbar ist sowie einen in Richtung ihrer Längsachse verschiebbaren,
den lichten Querschnitt der Bohrhülse zum Hauptteil abschließenden Stempel aufnimmt;
eine Halterung für das zu untersuchende Objekt, wobei für die Bohrhülse und/oder
die Objekthalterung eine vertikale Relativbewegung in bezug aufeinander ausführbar
ist; eine Anordnung zum Bewegen der Bohrhülse in eine Position über der Objekthalterung
und in eine andere Position über der zur Kryofixation vorgesehenen Kühlfläche.unter
Beibehaltung der vertikalen Orientierung der Bohrhülse und Fixierung in der jeweiligen
Position; ein Liesser mit waagrechter Schneide zum Herstellen einer frischen Anschnittfläche
senkrecht zur Längsachse des ausgestanzten Objektzylinders sowie eine relativ zur
Bohrhülse bewegbare Messerhalterung zur Führung der Messerschneide unmittelbar unter
der Schneide der Bohrhülse, wobei Mesaerbahn und Messerschneide vorzugsweise einen
Winkel kleiner als 450 einschließen;
und nindestens eine in der
Kühlfläche der Kühlkaulmer vorgesehene Öffnung zum direkten Abwerfen eines gefrorenen
Objektzylinders in das im Dewargefäß befindliche flüssige Kühlmedium sowie gegebenenfalls
zum Nachfüllen von flüssigem Kühlmedium.
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In weiterer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind
spezielle Anorduungen für die Objekthalterung, die Bewegungssysteme von Bohrhülse
und LIesser, die Ausbildung der Kühlkanimer bei einstufiger und zweistufiger Kühlung
sowie für die Lagerung und den Kryotransfer der präparierten Objektzylinder vorgesehen,
wie dies nachstehend im einzelnen beschrieben ist.
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Das erfindungsgeuiäP.e Verfahren, dessen prinzipielle whirkungsweise
und zu seiner Verwirklichung bevorzugte Vorrichtungen sind in der Zeichnung anhand
nicht beschränkender Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 die
Prinzipanordnung einer bekannten Vorrichtung zur Kryofixation nativer histologischer
Objekte auf einer tiefgekühlten etallfläche; Fig. 2a - 2g die erfindungsgemäße Verfahrensweise
zur Kryofixation auf einer tiefgekühlten Metallfläche, wobei die einzelnen Phasen
des Verfahrens schematisch dargestellt sind; Fig. 3 eine erste Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Vorrichtung,in der Draufsicht Fig. 4 die gleiche Vorrichtung in
Seitenansicht; Fig. 5 eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
für das Arbeiten bei der Siedetemperatur von N2fl, im Vertikalschnitt; eine Fig.
6 - 6c/dritte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit zweistufigem
Kühlsystem unter Verwendung von Heft' im Vertikalschnitt; Fig. 7 eine vierte Ausführungsform
der erfindungsgeuäßen Vorrichtung, ebenfalls mit zweistufigem Kühlsystem unter Verwendung
einer Peltier-Kaskade, im Vertikalschnitt; Fig. 8
fünfte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit abgeänderter Bohrhülsen-
und Messerführung, in der Draufsicht und in Schnittansicht nach der Linie IX-IX
in Fig.8.
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In den Fig. 2a bis 2g sind die verschiedenen Phasen des im Rahmen
der Erfindung ablaufenden Präparationsganges in Vorderansicht, teilweise im Schnitt,
dargestellt. Das Objekt 10, beispielsweise die Niere eines Laboratoriums-Versuchstieres,
wird nach Fig. 2a sofort nach ihrer Entnahme aus dem Tier in eine auf einem Objekttisch
11 befindliche Schale 12 gelegt, welche einen in bekannter Weise hergestellten Abguß
eines analogen Organes eines anderen Tieres aus der gleichen Zucht darstellt. Sie
wird sofort mit einem Schalenoberteil 13 bedeckt und mittels zweier Bolzen 14 am
Tisch befestigt. Damit ist das Objekt einerseits in seiner Lage eindeutig fixiert,
anderseits ohne große Kräfte einwandfrei gehaltert. Unmittelbar anschliessend kann
eine Bohrhülse 16 abgesenkt oder der Objekttisch 11 angehoben oder in anderer geeigneter
Weise die relative Entfernung zur Ringschneide 15 der Bohrhülse. 16 so lange verringert
werden, bis die Bohrhülse durch die Öffnung im Schalenoberteil 13 durchtritt und
die Baut des Organes berührt. Bei weiterer Fortsetzu:g dieser Bewegungen wird nunmehr
die Bohrhülse 16 unter Drehen um ihre Achse A1A1 bei dauernd echselndem Drehsinn
in das Objekt hineingebohrt, bis sie auf die etwas härtere Kunststoffschale 12 bzw.
einenin Tisch 11 vorgesehenen RunststoffeinSat 17 auftrifft. Die reversierende Drehbewegung
der Bohrhülse wird durch Drehen eines Rändelknopfes 18 von Hand aus wie bei einem
Korkbohrer realisiert. Nach restlosem Abtrennen des ausgebohrten Objektzylinders
10' wird sofort die Bohrhülse 16 angehoben und/oder der Tisch 11 abgesenkt, siehe
Fig. 2b. Der Objektzylinder 10' verbleibt hierbei in der Bohrhülse 16. Unmittelbar
anschließend wird nun der Objektzylinder 10' durch Absenken des z.B. durch eine
Nut 19 belüfteten Steinpels 19 mittels Andrücken des Knopfes 20 aus der Bohrhülse
vorgeschoben, so daß seine untere Begrenzung um die gewünschte Lange a aus der Bohrhülse
herausragt. Anstelle der Längsnut 19' kann auch der Stempel 19 mit einer Längskerbe
oder mit einer Längsbohrung versehen sein, so daß der lichte Querschnitt der Bohrhülse
nur zum Hauptteil, aber nicht ganz abgeschlossen ist, weil sonst ein genaues Aufnehmen
und reproduzierbares Vorschieben des ObJektzylinders wegen Ausbildung eines Luftpolsters
umnoglich w-re.
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Das Bohrhülsensystem wird nun gemäß Fig.2d mittels einer hierfür
vorgesehenen mechanischen Anord ung in seine Position über jenem Abschnitt der Kühlfläche
KK' eines tiefgekühlten Metallblockes 21 gebracht, der unmittelbar anschließend
für die Kryofixation der jetzt herzustellenden frischen Anschnittfläche FF' verwendet
wird. Dieser wichtige Verfahrensschritt erfolgt mittels eines "Schrägmessers", beispielsweise
mittels einer an einem Halter 22 befestigten Rasierklinge 23, welche in Pfeilrichtung
parallel zur Flähe KK' bewegt wird und den Objektzylinder 10' etwa 0,5 min unterhalb
der Bohrhülsenschneide 15 mit ziehendem Schnitt durchtrennt. Bereits während des
Schneidens schiebt ein Fortsatz 24 des 4alters 22 das als Abdeckung dienende Kunststoffplättchen
8 weg und öffnet damit automatisch die Kühlkammer 7. Unmittelbar nach dem Ende dieses
Schneideprozesses berührt ein ebenfalls asl Rasierklingenhalter 22 befestigter Beizen
25 einen an einem Sperrhebel 27 befestigten Gegenbolzen 26 und löst bei weiterer
Bewegung des pasierklingenhalters durch seitliches Verschieben des Sperrhebels 27
die Injectionsbewegung der Bohrhülse 10 in die Kühlkammer 7 aus, vgl. Fig. 2e.
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Die Bohrhülse 16 bewegt sich nun in freien Fall in Richtung ihrer
Achse A1A1' so lange abwärts, bei gemäß Fig. 2f die eben hergestellte plane Anschnittfläche
FF' auf die planparallel orientierte Kühlfläche KK' auftritt. Die entscheidende
Zeitspanne zwischen dem Herstellen er frischen Anschnittfläche mi1 der Rasierklinge
23 und den Be?'nn der Kryofixation liegt damit unter einer Sekunde, wobei absolute
Gewehr für die Parallelität der beiden Flächen FF' und KK' besteht, soweit erfindungsgemäß
die Bohrhülsenachse A1A1 senkrecht zu diesen beiden Ebenen justiert ist. Diese wichtige
Phase der Kryofixation ist binnen 50 msec abgeschlossen . sofort nach dem Auftreffen
und ersten Anfreieren kann daher die Bohrhülse 16 nach oben vom Objektzylinder 10'
abgezogen und die Kühlkammer 7 für die Zeitspanne bis zum endgültigen Durchfreien
des Zylinders mit der Abdeckung 8 verschlossen werden. Nach @@@ser Einfrenperiode
wird der Objektizylinder 10' besitzt durch Anfreien eines kleinen numerierten Zettels
markiert, nach Fig. 2g mit einer,
z.B. in N2fl vorgekühlten Kunststoffpinzette
in Pfeilrichtung gekippt und dadurch von der hochglanzpolierten Kühlfläche getrennt
und unmittelbar danach durch eine im Metallblock 21 vorgesehene Öffnung 28 in das
flüssige Kryogen 4abgeworfen.
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Soweit man laufend für einen entsprechenden Kryogenstand im Dewargefäß
3 Sorge trägt, können nunmehr in unmittelbarer Folge weitere Kryofixationen nach
dem gleichen Verfahrensgang durchgeführt werden. Nach Abschluß der Fixationsreihe
wird einfach der Deckel 6 vom Dewargefäß 3 abgehoben, worauf die kryofixierten,
tiefgekühlten Objektzylinder mit kleinen Kunststoffschöpfern unter N2fl in andere
Kryoapparaturen bzw. in tiefgekühlte Iösungsmittel zur weiteren Präparation transferiert
werden können (Kryotransfer in Kühlkette"), ohne daß das Risiko einer Erwärmung
der tiefgekühlten Oberflächenschicht des Objektzylinders auf über 180°E bestünde.
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Der vorstehend anhand von Fig. 2a bis 2g geschilderte Verfahre ns
ablauf kaun in mehreren Ausführungsarten im erfindungsgemäßen Sinn apparativ realisiert
werden.
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Eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die
eine sehr nützliche konstruktive Verwirklichung ermöglicht, ist in Fig.3 und 4 der
Zeichnung dargestellt. Die notwendige rasche Folge der einzelnen Verfahrensschritte
wird in diesem Beispiel dadurch herbeigeführt, daß alle instrumentellen Hilfsvorrichtungen
auf einer gemeinsamen Grundplatte 29 befestigt und sinngemäß zueinander justiert
sind und daß sowohl die Bohrhülse 16 wie die Rasierklinge 23 um Achsen schwenkbar
angeordnet sind, welche die Grundplatte exakt senkrecht durchstoßen, wobei sich
ihre Kreisbahnen über der Kühlkammer 7 bzw.
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deren Abdeckung 8 schneiden. Im einzelnen wird der Objekttisch, der
hier in einer vereinfachten Bauart, bestehend aus dem eigentlichen Tischelement
11 samt Kunststoffeinsatz 17 sowie einer an der Unterseite geriffelten, mittels
der Bolzen 14 befestigten Andruckplatte 30, dargestellt ist, in bekannter Weise
durch einen Triebkasten 31 mittels eines Rändelknopfes
32 angehoben
und abgesenkt. Ein die Bohrhülse 16 tragender Arm 33 ist nach Fig.4 auf einer vertikalen
Welle 34 um deren Achse A2A2, schwenkbar angeordnet. Eine Kugelraste 35 bewirkt
in bekannter reise eine hinreichende Fixierung zumindest der Position der Bohrhülse
16 über dem Objekttisch 11 zur Entnahme des Objektzylinders 10' sowie über der Kühlkammer
7 zum Herstellen der frischen Anschnittfläche FF' und zur Injektio, Der Rasierklingenträger
22'ist an einer um ihre Achse A3A3, drehbaren Welle 36 befestigt, welche ihrerseits
über ein Kegelzahnradpaar sowie über die in einem Lagerbock 37 gelagerte Antriebswelle
38 durch ein Handrad 39 verdrehbar ist.
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Das i der bereits geschilderten Form ausgebildete Dewargefäß samt
Kunststoffdeckel 6 ist durch ein JAontageelement 40 mit der Grundplatte 29 verbunden.
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die Eine für/diffizile praktische Arbeit besonders vorteilhafte Ausgestaltung
besteht darin, daß im Bohrhülsenträger 33 eine oder zwei Liiniatur-Kaltlichtröhren
41, vgl. Fig.4, angeordnet werden, welche ein blendfreies Kaltlicht ausstrahlen
und damit stets eine optimale Beobachtung des Arbeitsablaufes ermöglichen. Sehr
zweckmäßig ist es auch, wenn die Abdeckung 8 über der ILühlkammer 7 direkt oder
über Zwischenelemente starr, gelenkig oder federnd mit dem Rasierklingenträger 22'verbunden
wird, so daß sie stets durch Zurückdrehen des Rasierklingenträgers wieder in ihre
Ausgangsstellung zurückkehrt und die Kammer schließt. Diese Rückführanordung kann
auch so variiert werden, daß die Abdeckung 8, statt mit dem Rasierklingenträger,
mit dem Kunststoffdeckel6 des Dewargefäßes 3, z.B. gelenkig, verbunden ist.
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Das erfindungsgemäße System kann in unterschiedlichen Varianten ausgeführt.
werden, welche von dem Ausführungsbeispiel der Fig. 3 und 4 erheblich abweichen,
ohne dabei den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Dem Stande der Technik gegenüber
ist die Anwendung auch nur eines Einzelschrittes des erfindungsgemäßen Verfahrens
durchaus vorteilhaft. Auf welcher Bahn die Rasierklinge 23 oder die Bohrhülse 16
bewegt werden,
ist minder wichtig, denn anstelle der beschriebenen
Kreisbahn können mit gleichem Vorteil im Sinn der Erfindung beispielsweise geradlinige
Bahnen vorgesehen werden. Ebenso ist es nicht entscheidend, in welcher speziellen
Weise die zur Entnanme des Objektzylinders 10' erforderliche Relativbewegung zwischen
der Bohrhülse 16 und dem Objekt 10 realisiert wird.
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Es ist auch belanglos, auf welche eise und durch welche mechanischen
oder elektrischen Elemente die Injektionsbewegung der Bohrhülse 16 ausgelöst bzw.
die Abdeckung 8 von der Kühlkammer entfernt wird. Ähnliches gilt für die anderen
weiter oben beispielhaft erläuterten Verfahrensschritte und Konstruktionselemente.
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Eine sehr vorteilhafte weitere Ausgestaltung der Erfindung ist in
der in Fig. 5 dargestellten Vorrichtung veranschaulicht.
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Diese Vorrichtung stellt eine zweite Ausführungsform dar, die sich
u.a. durch eine geänderte Bauart des Kiihlblockes, eine geteilte Ausführung des
Dewargefäßdeckels und durch eine Anzahl zusätzlicher Vorrichtungeu von der nach
den Fig. 3 und 4 in Verbindung mit Fng.2a bis 2g beschriebenen Vorrichtung unterscheidet.
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So sind bei dieser Ausführungsform in einem Fühler 82 Registrier elemente
42, 43, 44 im Verein mit entsprechenden elektrischen Leitungen vorgesehen, die in
bekannter Weise dazu dienen, an Konrolleuchten 45, 46, 47 den Füllstand des Dewargefaßes
3 anzuzeigen. Außerdem kann im oder am Kühlblock 21 ein Thermofühler, Thermoelement,
Widerstandsthermometer oder eine temperaturabhänglg arbeitende Diode 48 angeordnet
sein, welche Aufschluß über die jeweils erreichte Blocktemperatur gibt. Die hieran
angeschlossene Anzeige kann sich im einfachsten Fall darauf beschränken, daß ein
Kontrollicht 49 nufleuchtet, wenn der Metallblock 21 die für eine Kryofixation notwendige
Temperatur erreicht hat. Für das Sammeln und/oder zum Kryotrans fer der Objektzylinder
10' kann des weiterenn eine Auffan¼\rorrichtung 50 dienen, die sich unterhalb des
Flüssigkeitsspiegels des Kryogens befindet und beispielsweise den in das flüssige
Kryo-4 gen/ eintauchenden Kühlfinger 55 des Kühlblockes 21 umgibt. Zusätzlich zum
Einfällen bzw. Nachfüllen von N2fl durch die Abwurföffnun-r 28 ist in Kühlblock
21 noch eine Entlüftungsöffnung 83 vorgesehen.
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Eine weitere Ausgestaltung kann darin bestehen, daß Heiz-oder Kühlelemente
bekannter Art vorgesehen sind, welche die Bohrhülse 16, die Objekthalterung 11,
12, 13, 17 oder 11, 17, 30 und die Rasierklinge 23 auf eine Temperatur erwärmen
oder abkühlen, die beispielsweise der normalen Körpertemperatur des Versuchstieres
oder seinem Zustand in gezielter Hypothermle entspricht, wobei diese Elemente als
Zusatzelemente, beispielsweise in Form eines aufsteckbaren Heizblockes, ausgebildet
oder in die angeführten Elemente des Gerätes integriert sein können. Schließlich
ist es im Hinblick auf die meistens in Laboratorien vorhandene Luftfeuchtigkeit
zum Vermeiden einer Eisbildung sowie zum besseren Abdichten des Deckels 6 für das
Dewargefäß 3 nützlich, den Gefäßdeckel aus zwei Elementen zu fertigen, wobei ein
Ring 51 aus gut Wärmeleitenden etall, wie Aluminium, die äußere Schale bildet, welche
durch Heizelemente 52 in einer eise erwärmt wird, daß ei- zur Auflage auf dem Rand
de Dewargefäßes 3 bestimmte Gummidichtung 53 stets flexibel bleibt und dabei einwandfrei
auf dem stets etwas unregelmäßigen Glasrand aufliegt. Demgegenüber kann der Innenteil
54 des Deckels aus einer thermischen gut isolierenden Kunststoff bestehen, in der
zweck@@@@@ @@@dent die elektrischen Leitungen für die Meßeinsatzes eine Halterung
81 für den metallischen Kühlblock 21 eingegossen sind. Auch für die Art und Ausführung
der erwähnten Ausgestaltungen gibt, daß weitgehende Variationen und Kombinationen
Rahmen des erfindungsgemäßen Konzepts sinnvell und möglich sind. Insbesondere können
Derwagefaße verschiedenster Art beispielsweise aus Glas, Metall oder Kunststoff,
zur Verwirklichung der Erfindung dienen.
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Besondere Bedeutung für die Kryofixation ker'n.t im Rahmen der Erfindung
jener Ausgestalten zu welche praktische Lösungsmöglichkeiten zur Realisierung@@@@@@@@@
ltemperaturen im Wege einer zweistufigen Kühlssystems aufzeigen. Den diesbezüglichen,
in den Fig. 6 und 7 veranschaulichen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist @ein am, daß ein abgeänderter metallischen Kühlblock @@@@@@@ehen ist der über
den Kühlfinger 55 durch das flass@@@ @@@@gen 4, in der Regel
N2fl,
abgekühlt wird und als erste Kühlstufe fast vollständig ein kleineres Kühlelement
bzw. Kühlkörper der zweiten Stufe, welcher auf einen Temperaturbereich in der Größenordnung
Von 100K abgekühlt werden soll, umgibt.
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In Fig.6 ist als dritte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung
im Wege eines nicht beschränkenden Beispieles ein solcher tWhAikörper der zweiten
Stufe dargestellt, gegebenenfalls nur welcher, kurzfristig, mit Hefl aul die gewunsonte
Temperatur abgekühlt wird. Hierbei ist in den Metallblock 21' ein gut isolierenderKunststoffeinsatZ
56, vorzugsweise aus geschäumtem Kunststoff wie Polyurethanschaum oder Styropor,
eingesetzt, welcherdie Abwurföftnung 28 im Kühlblock 21' in Form einer Öffnung 28'
fortsetzt, so daß auch hier eine durchgehende öffnung 28, 28' zum Abwurf des eingefrorenen
Objektzylinders 10' in das Kryogen 4 vorliegt. Der Kunststoffeinsatz 56 weist außerdem
eine nach oben offene, beispielsweise zylindrische Ausnehmung 57 auf, in welche
ein Aluminiumkörper 58 eingesetzt ist, dessen Oberfläche mit dem Ziel eines raschen
Wärmeaustausches in an sich bekannter Art möglichst groß gehalten wird. Dies kann
beispielsweise durch Ausbildung von vertikalen oder horizontalen Rippen bzw. durch
Anbringen von vertikalen Bohrungen im Aluminiumkörper erreicht werden, vgl. Fig.
6a - 6c. In jedem Falle muß es die Form des Körpers 58 gestatten, daß die zylindrische
Ausnehmung 57 mit flüssigem Helium 59 gefüllt werden kann. Da flüssiges Helium bekanntlich
eine extrem geringe Dichte und Wärmekapazität aufweist, läßt sich diese Füllung
nur vorübergehend realisieren.
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Aus Gründen der Wärmekapazität ist nur ein kleiner Teilkörper 60 der
zweiten Kühlstufe aus einem Metall höherer Dichte, vorzugsweise Kupfer oder Silber,
ausgebildet, wobei dieser Teilkörper die hochglanzpolierte Kühlfläche KK' aufweist
und eine (Temperaturfühler) Temperaturmeßvorrichtung/, beispielsweise ein Thermoelement
bl, trägt, an welchem in bekannter Weise ein geeichtes Millivoltmeter 62 mit Vergleichselement
angeschlossen ist. Die beiden Metallteile, nämlich Aluminiuskörper 58 und Teilkörper
60, sind streng ineinander gepaßt und entweder durch eine Kunststoffklebung
oder
durch eine Konatktflüssigkeit bzw. -paste thermisch gekoppelt . Die relativ große
öffnung der Kühlkammer 7' im Kunststoffdeckel 6' wird durch einen Stopfen 63 aus
hydrophobem Kunststoff, beispielsweise aus Teflon, verschlossen, welcher Stopfen
neben einer etwas größeren Einfüll- und Injektionsöffnung 64 eine weitere Öffnung
65 aufweist und an seiner Unterseite mit einem beidseitig hochgölanzpolierten Metallblech
66 in kleinem Abstand als reflektierendem Strahlenschutz bedeckt ist. Dieser Stopfen
reduziert das Volumen der Kühlkammer 7' auf ein Minimum und bewirkt durch seine
isolierenden und reflektierenden Eigenschaften eine Reduktion des Kryogenverbrauches
für die Kühlung der zweiten Stufe.
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Bei Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der vorstehend
beschriebenen Vorrichtung kann nun den technisch so vorteilhaften speziellen Eigenschaften
wie auch dem hohen Preis von flüssigem Helium durchaus Rechnung getragen werden.
Das Abkühlen beginnt zunächst mit dem Abkühlen in der ersten KiNhlstufe des zweistufigen
Systemes ins Kühlblock 21' durch flüssiges Kryogen 4, z.B. N2fl. In unmittelbarer
Folge wird der aus den Teilkörpern 58 und 60 zusammengesetzte Kühlkörper der zweiten
Stufe mit N2fl vorgekühlt, das wie üblich durch einen in die größere Öffnung 64
des Stopfens 63 eingesetzten dünnwandigen hochglaiizpolierten Metalltrichter 67
eingefüllt wird. Sobald beide Kühlstufen im Rahmen dieser Vorkühlung den Bereich
des N2fl-Siedepunktes erreicht haben, wird durch einen speziell für Hefl geeigneten
Injektor 79 in an sich bekannter Weise in den durch die zylindrische Ausnehmung
57 in dem Kunststoffeinsatz 56 gebildeten Behälter flüssiges Helium 59 injiziert,
welches diesen Behälter jeweils nur vorübergehend füllt und in Zuge der Abkühlung
der zweiten Kühl stufe sehr rasch wieder abdampft. Die aus dieser Verdampfung resultierende
Abkühlung des zweiteiligen Kühlkörpers 58, 60 wird am ttillivoltmeter 62 registriert.
Der Abkühlungsprozeß kann hierbei durch einen Regelkreis gesteuert werden, der den
Temperaturfühler 61 und ein Ventil im Injektorrohr 79 einschließt. Man setzt dieses
Abkühlen in jedem Fall solange fort, bis man die gewünschte Temperatur erreicht
hat und injiziert danach möglichst rasch durch die Öffnung
64
den inzwischen entnommenen und mit der frischen Anschnittfläche versehenen Objekt
zylinder 10', der nun auf der Kühlfläche KK' des tiefstgekühlten Teilkörpers 60
auftrifft.
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Gerade im vorliegenden Falle ist eine rasche Arbeit extrem entscheidend
und die Notwendigkeit der Verknüpfung des weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen
Verfahrensablaufes mit dem soeben beschriebenen Vorgang der Hefl-Kühlung der zweiten
Kühlstufe besonders deutlich, weil die Injektion des Objektzylinders 10' im Hinblick
auf die hohen Kosten einer Heliumkühlung unmittelbar nach Erreichen der gewünschten
Temperatur durchgeführt werden soll. Die Heliumzufuhr wird aus dem gleichen Grunde
unmittelbar nach der Injektion unterbrochen. Da nunmehr als Folge der Tiefkühlung
des Objekt zylinders 10' die Temperatur des Teilkörpers 60 sehr rasch ansteigt und
dabei die Gefahr besteht, daß die im Hinblick auf sekundäre Rekristallisationsprozesse
kritische Grenze von rund 1800K überschritten wird, wird die Bohrhülse 16 sofort
nach der Injektion wieder abgezonen. Die weitere Kühlung erfolgt nun durch N2fl,
der im Uberdurch den Trichter 67 schuß/eingegossen wird. ch dem hiermit realisierten
Tieffrieren des gesamten Objektzylinders 10' werden Stopfen 63 saat Trichter 67
abgenommen, wonach das Präparat markiert, von der Kühlfläche KK' durch Kippen getrennt
und durch die Öffnung 28, 28' in das flüssige KryoÔ^en 4 abgeworfen wird. In der
beschriebenen Weise ist es erfindungsgemäß möglich, mit einem minimalen Aufwand
an Heff die Kryofixation bei tifster Semperaturen zu vollziehen, wobei die Kühlfläche
KK' am Teilkörper 60 nur vorübergehend auf die tiefere Temperatur abgekühlt wird.
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Eine Variation des zweistufigen Kühlsystemes ist in Fig. 7 als vierte
Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung veranschaulicht. Bei dieser Bauart
wird durch den Einsatz einer oder mehrerer hintereinander geschalteter Peltier-Kaskaden
das Erreichen einer tieferen Kühltemperatur auf längere Dauer ermöglicht. Auch in
diesem Falle umgreift der metallische Kühlblock 21' der ersten Kühlstufe einen kleineren
Kühlkörper der zweiten Kühlstufe. Dabei wird an die Bodenfläche des Kühlblockes
21' die warme Seite einer Peltier-Kaskade 68 thermisch gekoppelt, wogegen die kalte
Seite der Kaskade an die zweite Kühlstufe bzw. deren 69 Kühlelement/ abgeschlossen
ist. Der thermische Kontakt der Peltier-Kaskade erfolgt beispielsweise über Glimmerzwischenlagen
70, 71 unter Verwendung von Kontaktflüssigkeiten oder -pasten, der elektrische Anschluß
an ein entsprechendes Gleichrichterelement 72. Unterschiedlich zum Kühlkörper 58,
60 für die Heff-Kühlung ist das Kühlelement 69 im Hinblick auf dem vorgesehenen
Dauerbetrieb ilseltig, bis auf die Kühlfläche KK' für die Kryofixationen in einen
Einsatzteil 73 aus isolierenden Kunststoff @@ @gessen oder eingeschäumt.
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Das Kühlelement kann zum Gän@ @ dem Metall höherer Dichte ausgeführt
sein, weil eine größ @@@n@aufzeit bis zu Erreichen eines stationären Zustandes vertretbar
erscheint, im stationären Austand aber kein Unterschließ zwischen der Verwendung
eines spezifisch leichteren oder Schwereren Materialsa besteht.
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Analog dem Kunststoffeinsatz 56 für den Hefl-Kühlkörper nach Fig.
6 weist der Kunststoffeinsatz 73 der Peltier-Kaskade nach Fig. 7 wiederum eine Abwurföffnung
28' auf welche durch die Abwuföffnung 28 im Kühlblock 21' fortgesetzt wird. Gegenüber
der Heliumkühlung nach Fig. 6 muß jedoch Im Peltier-System nach FIg. eine Vorkehrung
gegen die Bildung eines Niederschlages aus festem Stickstoff auf der Kühlfläche
KK' getroffen werden Ohne spezielle Vorkehrung würde sich diese Kühlfläche in einer
N2g-Atmosphäre befinden, wogegen ja der Hrfl-Kühlkörper während der Abkühlung auf
tiefere Temperaturen durchgehens in einer Heliumgasatmosphäre vorliegt. Zur Vermeiden
@@@e@es solchen störenden
N2f-Niederschlages auf der Kühlfläche
ist daher nach Fig.7 zunächst eine gesonderte oeffnung 74 im Kunststoffdeckel 6'
vorgesehen, durch welche das laufend entstehende N2-Gas entweichen kann. Der Stopfen
63' weist in diesem Fall neben der großen Injektionsöffnung 64' einen Anschluß 75
zum Einleiten von Heliumgas aus einer Flasche auf, welches in weiterer Folge in
einem als Doppelrohr ausgebildeten, in das Kryogen 4 eintauchenden Wärmeaustauscher
76 bekannter Bauart auf N2fl-Temperatur vorgekühlt wird, bevor es durch eine Öffnung
77 in die Kühlkainmer 7' entweicht. Der zylindrische. Wärmeaustauscher 76 verschließt
während der gesamten Vorkühlperiode und Kryofixation die Abwurföffnung 28, 28',
so daß in dieser Zeit kein N2-Gas in die Kühlkammer 7' gelangen kann. Der Heliumgasdurchfluß
wird so eingestellt, daß die.Heliumspülung bei einem Durchsatz minimaler Blengen
keine spürbare Erhöhung der Sühlflächentemperatur bewirken kann. Nach Abschluß der
in bereits beschriebener Weise vollzogenen Kryofixation wird der Stopfen 63' mit
dem Wärmeaustauscher 76 nach oben abgezogen und damit die Abwurföffnung 28, 28'
freigegeben. Der eingefrorene Objektzylinder 10' wird nun markiert, von der Kühlfläche
KK durch Kippen abgetrennt und durch die Öffnungen 28, 28' in das Kryogen 4 abgeworfen.
Ein Niederschlag aus verfestigtem Stickstoff, Wasserdampf, Kohlendioxid oder Sauerstoff
auf der Kühlfläche KK' kann durch Umpolen der Peltier-Kaskade 68 mittels eines Schalters
78 auf einfachste Weise beseitigt werden. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten der
in Fig.7 dargestellten Vorrichtung wird auf die Beschreibung der entsprechendeir
Bauteile von Fig.6 Bezug genommeii.
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Die in den beschriebenen Ausführungsformen nach Fig.6 und 7 realisierte
Kühlung bei tieferen Temperaturen kann durch Anwendung bekannter Verfahren und/oder
Konstruktionselemente aus der Kryotechnik variiert und in verschiedener Kombination
verwirklicht werden. Dabei kann von den verschiedenartigsten Temperaturmeßelementen,
Wärmeaustauschern, Isolationseinrichtungen und elektrischen Schaltungen im Rahmen
der Erfindung Gebrauch gemacht werden.
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Entsprechend einer vorteilhaften Weiterbildung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung kann die Führung der Bohrhülse und der Rasierklinge in einer technisch
vereinfachten Weise'ohne Beeinträchtigung der angestrebten Wirkung realisiert werden.
Ebenso kann eine spezielle Hubvorrichtung für den Objekttisch entfallen.
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Bei dieser fünften Ausführungsform ist, wie die Draufsicht auf ein
solches Gerät gemäß Fig. 8 bzw. dieSchnittansicht in Fig.9 zeigt, der Rasierklingenträger
22' um die gleiche Welle 34' drehbar wie der Bohrhülsenträger 33, so daß die Bohrhülse
16 und die Rasierklinge 23 nunmehr um die gleiche Achse A2A2, verschwenkbar sind.
Uber der vertikalen, in diesem Fall gestuft ausgebildeten Welle 34', an der der
Bohrhülsenträger 33 angelenkt ist, befindet sich eine Hohlwelle 36', welche starr
mit dem Xasierklingenträger 22' verbunden ist. Der i?asierklingenträger 22' ist
seinerseits als Klemmzange ausgebildet, deren beweglicher Arm 84 durch eine Druckfeder
85 vorgespannt ist und mittels eines Knopfes 86 zum Wechseln der Rasierklinge gelöst
werden kann. Unter der Rasierklinge 23 befindet sich ein Auffangblech 87, welches
ein lierabfallen der abgeschnittenen Objektzylinder nach dem Abtrennen verhindert.
Da bei dieser Anordnung, abweichend von dem in Fig.3 und 4 dargestellten System,
kein Schneiden zweier Kreisbahnen stattfindet-, kann in diesem Fall auf spezielle
Justierungen der beiden Kreisbahnen zueinander sowie zur Kühlfläche am Metallblock
21 verzichtet werden, wodurch sich der Herstellungsaufwand erheblich reduziert.
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Wichtig bleibt lediglich die Abstimmung des Radius der Bohrhülsenschwenkbewegung
auf den Radius der Rasierklingenbahn.
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Der Arbeitsablauf beim Herstellen der frischen Anschnittfläche kann
in verschiedener Weise erfolgen. Einerseits kann die Rasierklinge nach Fig.8 in
einer stetigen Bewegung etwa um 900 aus der dargestellten OW-Lage in eine NS-Position
geschwenkt werden. Hierbei können itnehmerstifte in der bereits dargestellten Weise
die Offnung der Abdeckung 8 und die Entriegelung des Sperrhebels 27 bewirken. Im
Hinblick auf die durch die Rasierklingenschneide hierbei gegebene Verletzungsgefahr
ist
jedoch ein anderer Arbeitsablauf besonders vorteilhaft: In diesem Falle wird der
Rasierklingenträger 22', wie aus Fig.8 zu erkennen ist, lediglich zur denjenigen
Winkel a aus seiner OW-Ruhelage geschwenkt, der zum kompletten Abtrennen des Objektzylinders
10' ausrcicht. Danach wird der Drehsinn gewechselt und der Rasierklingenträger 22'
zurück in seine 0W-AusgangslaÕe geschwenkt. Die Rasierklinge 23 befindet sich danach
unter der Gehäuseabdeckung, wodurch die Verletzungsgefahr auf ein iniun reduziert
wird. Der abgetrennte Objektzylinder 10' wird hierbei von einem am Dewargefäßdeckel
oder Chassis befestigen Abstreifer 88 abgestreift und kann danach auf einfache Weise,
z.B. für eine vergleichende chemische Fixation, aufgenommen werden. Bei der Rückführung
des Rasierklingenträgers 22' wird durch Mitnehmerelemente 89, 90 die Abdeckung 8
geöffnet bzw. über einen Zwischenhebel (nicht dargestellt) die Injektion der Bohrhülse
16 ausgelöst, wobei die Abdeckung 8 beispielsweise um eine Gelenkschraube 80 od.dgl.
drehbar an den Dewargefäßi"eckel'6 angelenkt ist. Die Gelenkschraube 80 kann durch
eine Rückholfeder sowie ein Dämpfungselement (beide nicht dargestellt) ergänzt werden.
Dabei bewirkt die Rückholfeder im Verein mit dem Dämpfungselement, daß nach Öffnen
der Abdeckung 8 (gemäß Fig.8 in Pfeilrichtung) und nach Wegfall der Mitenhmerbewegung
ein selbständiges Schließen der Abdeckung 8 in einer langsamen Bewegung entgegen
der Pfeilrichtung erfolgt.
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Sie stößt hierbei auf die inzwischen injiziert Boiirhülse 16 und verharrt
zunächst in der hierdurch vorgegebenen Stellung.
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Nach dem Abziehen der Bohrhülse von dem auf gefrorenen Objektzylinder
10' und Anheben aus der Kühlkammer kehrt hierauf die Abdeckung 8 durch die Federkraft
der Rückholfeder automatisch in einer gedämpften Drehbewegung in die abgebildete
Verschlußstellung zurück. Die Abdeckung 8 kann statt der" exzentrische Bohrung 8'
eine Öffnung in abgewinkelter Form wie in Fig.? aufweisen, wodurch vermieden wird,
daß kaltes Gas aus der Kühlkammer vor der Injektion auf die Objektoberfläche gelangt.
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Ebenso kann in weiter abgewandelter Form der Austritt seitlich aus
der Kühlkammer durch den Dewargefäßdeckel 6 erfolgen (nicht dagestellt).
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Als weitere Vereinfachung kann gemäß Fig.8 und 9 der Hub des Objekttisches
30 entfallen. Zur Entnahme des Objektzylinders 10' aus dem Objekt 10 wird vielmehr
die Bohrhülse 16 von Hand aus ausgelöst und auf das Objekt abgesenkt, wodurch die
erfindungsgemäße Relativbewegung zwischen dem Objekt 10 und der Schneide 15 der
Bohrhülse 16 in vereinfachter Weise verwirklicht wird.
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Über die vorstehend im einzelnen beschriebenen Ausführungsformen
hinaus kann die erfindungsgemäße Vorrichtung in verschiedenen Punkten weiter ausgestaltet
werden. So ist es beispielsweise möglich und technisch sInnvoll, jene Teile der
Vorrichtung, die mit dem Objekt vor der Kryofixation in Berührung kommen, durch
ein ansteckberes, sie zeitweise umgebendes oder in sie selbst eingebautes Eihl-
oder Heizelement auf eine bestimmte erniedrigte oder erhöhte Temperatur zu bringen,
bzw.
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die so erzielte Temperatur durch thermostatische Regelung in an sich
bekannter Weise auf einem vorgewählten Wert konstant zu halten. Die hiefür in Betracht
kommenden Vorrichtungsteile sind insbesondere das Objekt is t Objekthalterung, die
Bohrhülse samt Stempel und Halterung » e Rasierklingenhalterung.
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Dadurch wird insbesondere die Übernahme von besonders temperaturepfindlichen
Warmblütergeweben oberhalb der Raumtemperatur sowie umgekehrt die Präparation von
Objekten ermöglicht, welche in gezielter Hypothermie präpariert oder bei Temperaturen
kultiviert worden sind, welche unter der Raumtemperatur liegen. Durch die beschriebene
Ausgestaltung wird daher in jedem Fall jeder wie immer geartete "Temperaturschock"
in der interessierenden Objektzone vermieden.
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Für den Einsatz der Bohrhülse erweist sich die Einhaltung einer gewissen
Normhöhe als zweckmäßig, auf welcher sich die Bohrhülsenschneide, mit Ausnahme des
Ausstanzens des Objektzylinders und der Injektionsbewegung in die Eühlkammer, ständig
befinden soll. Zu diesem Zwecke kann die Bohrhülse in ihrem Träger durch eine Sperrklinke,
einen Sperrhebel oder ein anderes mechanisches, elektriscb'a' oder magnetisches
Element
auf dieser Norinhöhe gehalten werden, die ohn Lösen der genannten Sperrelemente
nicht unterschritten werden kann. Dabei wird t"orteiihaft die Höhe der waagrechten
Wesserbahn zur waagrechten Bohrhülsenbahn so justiert, da;3 sie um einen kleinen,
vorgewählten und/oder vorjustierten Betrag unterhalb der Normhöhe der Bohrhülsenschneide
verläuft.
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Zum Auslösen der Bohrhülse kann von einer Auslöseanordnung Gebrauch
gemacht werden, bei welcher das Sperrelement in Wirkverbindung mit einem Steuerelement
für die Messerbewegung steht, wobei dieses Steuerelement bei Erreichung einer vorgewählten
und/oder vorjustierten Messerposition das Sperrelement freigibt und damit die Injektionsbewegung,
z.B. den freien bzw. in gewünscht er Weise beschleunigten oder gedämpften Fall der
Bohrhülse 16 in die Kühlkammer 7 auslöst.
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Die Öffnungs- und Schließbewegung der Abdeckung 8 fiir die Kühlkammer
7 bzw. 7' kann in unterschiedlicher Weise von den einzelnen Bewegungssystemen der
erfindungsgemäßen Vorrichtung abhängig gemacht werden. So kann diese Bewegung mit
der Messerbewegung gekoppelt werden, wobei die Messerhalterung oder ein mit ihr
direkt oder indirekt verbundenes mechanisches, elektrisches oder magnetisches Element
dazu dient, die Abdeckung 8 von der Kühlkammer v:egzuschi.eben. Dabei kann dieses
Abdeckplättchen direkt oder über Zwischenelemente starr, ge-Kenkig oder federnd
mit dem Messerträger verbunden sein, so daß das Öffnen und Schließen der Kühlkammer
synchron mit der Messerbewegung erfolgt.
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Die unterhalb des Flüssigkeitsspiegels des Kryogens im Dewargefäß
befindliche Auffangvorrichtung für die tiefgefrorenen Objektzylinder eignet sich,
gegebenenfalls zusammen mit entsprechenden Hilfselementen, für den Kryotransfer
der aufgefangenen gefrorenen Objekte in andere Kryogeräte oder Kryoflüssigl.citen
für eine weitere Präparation, wobei die Objekte bei diesem Kryotransfer vollständig
von flüssige Kryogon umgeben bleiben können.
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L e e r s e i t e