DE102013112604A1

DE102013112604A1 - Einrichtung und Verfahren zum Schneiden von Bioproben und Zellbeobachtungs-Verfahren

Info

Publication number: DE102013112604A1
Application number: DE102013112604.9A
Authority: DE
Inventors: wird später genannt werden Erfinder
Original assignee: Dastech Inc
Current assignee: Dastech Inc
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-11-15
Publication date: 2014-06-05
Also published as: JP2014102147A; US20140137713A1; JP6189031B2; GB2509368A; GB201319330D0

Abstract

Einrichtung zum Schneiden einer Bioprobe als Werkstück in einen Schnitt während der lebende Zustand der Zellen erhalten wird, auf einer Platte, auf der das Werkstück platziert ist, eine Vorrichtung zum Einfrieren und Fixieren des Werkstücks auf der Platte und ein Messer zum Schneiden des gefrorenen Werkstücks, das auf der Platte fixiert ist, in einen Schnitt mittels einer Drehbewegung in einer vorgegebenen Drehrichtung. Das Profil einer Schneidkante des Messers ist eine Krümmung, die eine monotone Zunahme der Abstände von der Drehachse zu Punkten aufweist, die bei einem am nächsten gelegenen Punkt beginnen, welcher der kürzeste Abstand von der Achse ist, und bei einem am weitesten entfernt gelegenen Punkt enden, welcher der längste Abstand von der Achse ist. Der am weitesten entfernt gelegene Punkt ist in der Drehrichtung hinter dem am nächsten gelegenen Punkt und die Krümmung, die entgegengesetzt zur Drehachse im Bezug auf eine Gerade liegt, welche den am nächsten gelegenen Punkt und den am weitesten entfernt gelegenen Punkt verbindet, konvex ist.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Einrichtung und ein Verfahren zum Schneiden einer gefrorenen Bioprobe, die Zellen und Gewebe enthält, in einen Schnitt (in ein Schnittteil) oder eine dünne Scheibe und ein Verfahren zur Zellbeobachtung.
Hintergrund der Erfindung und Erklärung zum zugehörigen Stand der Technik
Normalerweise ist in einem technischen Gebiet der Biologie und medizinischen Wissenschaften eine Einrichtung zum Einfrieren und Schneiden einer Bioprobe in einen Schnitt bekannt. Eine Bioprobe ist beispielweise Material, entnommen aus Menschen, Tieren oder Pflanzen, das Teil eines inneren Organs oder eines Körpers ist und normalerweise ein oder mehrere Gewebe enthält. Ein derartiges Gewebe weist eine bestimmte Struktur auf, gebildet durch eine Ansammlung verschiedenartiger Zellen.
Die Japanische Offenlegungsschrift Nr. 2011-232299 offenbart eine Fertigungseinrichtung für Gefrierdünnschnitte zur Diagnose einer Läsionsstelle in einer kurzen Zeit während der Operation. Die Einrichtung ist mit einem rotierenden Mikrotom (Werkzeug zum Schneiden dünner Schnitte) in einem Kühlschrank bei einer Temperatur von ungefähr –10 °C bis –30 °C. Um die Gewebezerstörung, die durch die Volumenausdehnung des Wassers verursacht wird, zu verhindern, wird die Feuchtigkeit in der Einrichtung mittels Mikrowellenbestrahlung unterkühlt und anschließend durch Aufrechthalten der Bestrahlung unmittelbar eingefroren. Das durch das vorangehend beschriebene unverzügliche Einfrieren der Zellen erhaltene Gewebe wird mit dem rotierenden Mikrotom in einen Dünnschnitt, wie beispielsweise 5 µm bis 10 µm, geschnitten und für die Diagnose mit dem Mikroskop zugänglich gemacht.
Auf der anderen Seite sind auf dem technischen Gebiet der Bearbeitung, das zu dem obigen vollkommen unterschiedlich ist, Einrichtungen und Verfahren zum Einfrieren und Fixieren eines Werkstücks, das durch Fräsen und
Schleifen bearbeitet werden soll, bekannt. Die Japanischen Offenlegungsschriften Nr. 2007-30059 und Nr. 2007-237376 offenbaren ein Verfahren, bei dem eine Flüssigkeit oder ein dickflüssiges Koagulationsmittel (z. B. wasserlösliches Polymer) zwischen einem Werkstück und einer Platte angeordnet ist und das Werkstück mit einem Bearbeitungswerkzeug nach Einfrieren und Fixieren mit dem gefrorenen Koagulationsmittel bei einer Temperatur von 5 °C bis 15 °C bearbeitet wird.
Die in dem ersten zugehörigen Stand der Technik offenbarte Einrichtung ist darauf ausgerichtet, Schritte vom Entnehmen über das Schneiden bis hin zum Diagnostizieren einer Bioprobe in einer derartig kurzen Zeit wie etwa ein paar Minuten bis zu einigen zehn Minuten abzuschließen. Allerdings ist diese Einrichtung nicht auf alle Bioproben anwendbar (einige Bioproben werden für lange Zeitspannen konserviert). Auch kann dieses Verfahren aufgrund der speziellen Geräteausstattung, die für die Mikrowellenbestrahlung benötigt wird, nicht allgemein verwendet werden.
Ein Mikrotom, das eine wohlbekannte Schneideinrichtung ist, wie sie in dem ersten zugehörigen Stand der Technik verwendet wird, benötigt üblicherweise Temperaturen bis zu ungefähr –50 °C im Höchstfall für das Gefrieren. Es wird angenommen, dass die Zellen in einer Bioprobe annähernd auf Dauer nur konserviert werden können, ohne eine Schädigung hervorzurufen, wenn sie bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff gehalten werden und dass die Schädigung von Zellen bei Temperaturen fortschreitet, die höher als die von flüssigem Stickstoff sind. Darüber hinaus sind in der Mikrotomie das Einbetten und Einfrieren unter Verwendung von Paraffin usw. vor dem Schneiden der Bioproben notwendig, was weitgehend von der Erfahrung des Durchführenden abhängt. Das hat zur Folge, dass nicht jeder so einfach eine Probe in einem guten Zustand für die Betrachtung präparieren kann. Auch wird bei der Mikrotomie die Zellfunktion, die aktiv ist, wenn die Zelle sich in einem lebenden Körper befindet, geschädigt, wodurch das verursacht wird, was als tote Zellen bezeichnet wird Dies ist auf die Vorbehandlung (z. B. Formalin-Behandlung oder Paraffin-Behandlung nach Entwässerung) zurückzuführen, die für die Fixierung notwendig ist. Im Allgemeinen benötigt die Anwendung der Mikrotom-Technologie Zeit, beispielsweise fünf Tage vom Beginn der Präparation über das Schneiden der Proben bis zur Betrachtung der Zellen, was erhebliche Personal- und Zeitkosten erforderlich macht.
Bezüglich einer Gefrier- und Schneidvorrichtung auf dem Gebiet der Bearbeitung, wie sie in dem zweiten und dritten zugehörigen Stand der Technik angeführt wird, werden bei deren Anwendung auf das Schneiden von Bioproben nach Lage der Dinge die Zellen aufgrund einer höheren Gefriertemperatur und der Verwendung eines Scheibenmessers, welches gewöhnlicherweise beim Bearbeiten eingesetzt wird, geschädigt. Dies bedeutet, dass, nachdem die Bioprobe durch die Schneidkante einer Scheibenmessers geschnitten worden ist, der länger währende Kontakt zwischen der Schnittfläche der Bioprobe und der Seite des Messers Reibung erzeugt wird, welche die Schnittfläche erwärmt, wodurch eine Beschädigung oder Verformung der Zellen hervorgerufen wird. Dies gilt für den Fall, in dem eine Bioprobe mit einer linearen Bewegung einer rasiermesserartigen Kante geschnitten wird.
Die vorliegende Erfindung behandelt die vorangehend diskutierten Probleme und verfolgt das Ziel, eine Einrichtung und ein Verfahren zum Schneiden einer Bioprobe in einen Schnitt bereitzustellen, in der die Probe in einen Schnitt mit beispielsweise mehrere µm bis einige zehn µm geschnitten wird, während das Gewebe und die Zellen in der Bioprobe in demselben Zustand gehalten werden, wie sie in dem ursprünglichen lebenden Körper waren, ohne eine Schädigung oder Verformung zu verursachen. Darüber hinaus ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Bioprobe, unabhängig davon, ob es sich um eine frische Bioprobe handelt, die gerade entnommen wurde, oder eine alte Probe, die für eine lange Zeit konserviert worden war, nur mit einer einfachen Vorbehandlung, die innerhalb einer kurzen Zeit durchgeführt wird, sicher zu schneiden.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die folgende Einrichtung zum Erreichen der vorangehend angegebenen Ziele bereit. Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung weist eine Einrichtung zum Schneiden einer Bioprobe als Werkstück in einen Schnitt folgendes auf: eine Platte, auf die das Werkstück platziert wird; eine Vorrichtung zum Einfrieren und Fixieren des Werkstücks auf der Platte; und ein Messer zum Schneiden des gefrorenen Werkstücks, das auf der Platte fixiert ist, in einen Schnitt mittels einer Drehbewegung in einer vorgegebenen Drehrichtung. In dieser Einrichtung ist das Profil einer Schneidkante des Messers eine Krümmung, die an einem zu einer Drehachse am nächsten gelegenen Punkt startet und an einem am weitesten von der Achse entfernt gelegenen Punkt endet, wobei der Abstand von der Achse zu jedem der Punkte auf der Krümmung von dem am nächsten gelegenen Punkt zu dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt monoton ansteigt; der am weitesten entfernt gelegene Punkt ist hinter dem nächstgelegenen Punkt in der Drehrichtung; und die Krümmung ist gegenüber der Drehachse im Bezug auf eine Gerade, welche den am nächsten gelegenen Punkt und den am weitesten entfernt gelegenen Punkt verbindet, konvex.
In dem ersten Aspekt ist es bevorzugt, dass eine kryogene Flüssigkeit in der Vorrichtung für das Einfrieren und Fixieren verwendet wird. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die kryogene Flüssigkeit dem Werkstück während des Schneidvorgangs mit dem Messer zugeführt wird und das eine derartige kryogene Flüssigkeit flüssiger Stickstoff ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung weist ein Verfahren zum Schneiden einer Bioprobe als Werkstück in einen Schnitt folgendes auf: Platzieren des Werkstücks auf eine Platte; Einfrieren und Fixieren des Werkstücks auf der Platte; und Schneiden des gefrorenen Werkstücks, das auf der Platte fixiert ist, in einen Schnitt mittels einer Drehbewegung in einer vorgegebenen Drehrichtung. In diesem Verfahren ist das Profil einer Schneidkante des Messers eine Krümmung, die an einem zu einer Drehachse am nächsten gelegenen Punkt startet und an einem am weitesten von der Achse entfernt gelegenen Punkt endet, wobei der Abstand von der Achse zu jedem der Punkte auf der Krümmung von dem am nächsten gelegenen Punkt zu dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt monoton ansteigt; der am weitesten entfernt gelegene Punkt ist hinter dem nächstgelegenen Punkt in der Drehrichtung; und die Krümmung ist gegenüber der Drehachse im Bezug auf eine Gerade, welche den am nächsten gelegenen Punkt und den am weitesten entfernt gelegenen Punkt verbindet, konvex.
In dem zweiten Aspekt ist es bevorzugt, dass eine kryogene Flüssigkeit in dem Schritt für das Einfrieren und Fixieren verwendet wird. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die kryogene Flüssigkeit dem Werkstück während des Schneidvorgangs mit dem Messer zugeführt wird und das eine derartige kryogene Flüssigkeit flüssiger Stickstoff ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Schnitt, der aus der Bioprobe unter Verwendung des Verfahrens zum Schneiden gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung aus der Bioprobe herausgeschnitten wurde.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Zellbeobachtung die Schritte des Präparierens eines Schnittes der Bioprobe unter Verwendung des Verfahrens zum Schneiden einer Bioprobe gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung und das Beobachten der Zellen, die in dem Schnitt enthalten sind, mit einem Phasenkontrastmikroskop, während der Schnitt in einem Gewebekultur-Wachstumsmedium eingetaucht ist. Es wird bevorzugt, dass die Beobachtung ferner den Schritt der Beobachtung von Zellen, die in dem Schnitt enthalten sind, mit einem Phasenkontrastmikroskop umfasst, wobei während der Fortführung der Kultur mit dem Gewebekultur-Wachstumsmedium, welches den eingetauchten Schnitt enthält, dieses in einem Kohlendioxid-Inkubator aufbewahrt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren für die Zellbeobachtung die Schritte des Präparierens eines Schnittes der Bioprobe unter Verwendung des Verfahrens zum Schneiden gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung und das Beobachten der Zellen, die in dem Schnitt enthalten sind, nachdem sie aus dem Gewebekultur-Wachstumsmedium nach dem Eintauchen herausgenommen und anschließend angefärbt wurden.
Gemäß der Schneideinrichtung und dem Verfahren zum Schneiden der vorliegenden Erfindung wird eine als Werkstück auf der Platte fixierte Bioprobe durch die Rotation eines Messers mit einem spezifischen Profil geschnitten. Im Unterschied zu einem Scheibenmesser macht es eine Kombination aus dem Profil des Messers und der Drehbewegung möglich, längere Kontaktzeiten zwischen der Schnittfläche des Werkstücks und dem Messer zu vermeiden. Dementsprechend ist es möglich, zu verhindern, dass die Zellen in der Bioprobe durch die Reibung von dem Messer beschädigt oder verformt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Werkstück geschnitten, nachdem es unmittelbar eingefroren und auf der Platte unter Verwendung einer Flüssigkeit zum Einfrieren und Fixieren fixiert worden ist, wobei es keine Vorbehandlung benötigt, die herkömmlich erforderlich gewesen ist, dabei allerdings die Funktion der Zellen in der Bioprobe geschädigt hat. Dementsprechend werden in der Bioprobe, die in einen Schnitt durch die Anwendung der vorliegenden Erfindung geschnitten wurde, die Zellen oder Gewebe in demselben Zustand (bezüglich ihrer Position und Funktion) gelassen, wie er in einem lebenden Körper vorliegt. Das bedeutet, dass die Position der Zellen, wenn die in dem lebenden Körper gebildete Gewebe so erhalten wird, wie sie ist und die Funktionen einschließlich Proliferation, Reparatur, Metabolismus und Signaltransduktion zwischen den Zellen so erhalten bleiben, wie sie sind. Zellen in diesem Zustand werden in dieser Beschreibung als “lebende Zellen” definiert. Um diesen Zustand aufrecht zu halten, wird eine Bioprobe als Werkstück bei einer Temperatur einer Flüssigkeit zum Einfrieren und Fixieren während des Schneidvorgangs gehalten und das Werkstück unter Verwendung einer drehenden Bewegung eines Messers mit einem spezifischen Profil geschnitten.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Verwendung einer Bioprobe, die zu einem Schnitt geschnitten wurde, zum Beispiel mehrere µm oder einige zehn µm dick, als eine Probe für die Zellbeobachtung in der Forschung oder als ein Produkt oder ein Material davon in verschiedenen Gebieten wie beispielsweise Biologie, Biochemie, Medizin und pharmakologische Wissenschaften, da derartige Bioproben aus lebenden Zellen gebildet sind.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Zeit von der Präparation bis zur Beobachtung der Bioprobe auf ungefähr eine Stunde zu verkürzen, während hingegen die herkömmliche Zellbeobachtung mehrere Tage benötigte. Dies führt zu einer signifikanten Verringerung der Zeit und der Personalkosten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A zeigt eine schematische Vorderansicht, die einen Hauptbestandteil einer Schneideinrichtung für Bioproben gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. 1B zeigt eine schematische Seitenansicht, die einen Hauptbestandteil einer Schneideinrichtung für Bioproben gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
2A zeigt eine schematische Ansicht einer Zeitreihe, die ein Messer beim Schneiden eines Werkstücks, das in der Ausführungsform in 1 gezeigt ist, bildlich darstellt. 2B zeigt ein Beispiel von Querschnitt A, der in 2A dargestellt ist.
3 zeigt eine schematische Ansicht, die ein Profil einer Schneidkante eines Messers in einer Schneideinrichtung bildlich darstellt.
4 zeigt verschiedene Beispiele von Profilanforderungen für die Schneidkante des in 3 bildlich dargestellten Messers.
5 zeigt verschiedene Beispiele von Profilanforderungen für die Schneidkante des in 3 bildlich dargestellten Messers.
6 zeigt verschiedene Beispiele von Profilanforderungen für die Schneidkante des in 3 bildlich dargestellten Messers.
7 zeigt einen Arbeitsablauf eines Verfahrens zum Schneiden von Bioproben gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
8 zeigt eine allgemeine Vorderansicht eines Beispiels einer vollständigen Einrichtung für das Verfahren zum Schneiden von Bioproben, das in 7 bildlich dargestellt ist.
9 zeigt eine schematische Seitenansicht, die einen Schnitt einer Bioprobe bildlich darstellt, der unter Verwendung einer Schneideinrichtung und eines Schneidverfahrens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung herausgeschnitten worden ist.
10 zeigt eine mikroskopische Aufnahme eines 25-µm dicken Schnittes, der aus einer Rattenleber mit einer Einrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung herausgeschnitten wurde.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Die Bezeichnung “Bioprobe”, wie hierin verwendet, soll ein Material definieren, das Zellen oder Gewebe enthält, welches aus Menschen, Tieren oder Pflanzen entnommen wurde. Wenn die vorliegende Erfindung auf eine Bioprobe angewendet wird, die lebende Zellen enthält, verbleiben die Zellen, die in einem aufgetauten Schnitt nach dem Schneiden enthalten sind, trotzdem in demselben Zustand, in dem sie ursprünglich in der Bioprobe waren, d. h., sie behalten einen lebenden Zustand. Es sollte allerdings beachtet werden, dass die vorliegende Erfindung nicht nur auf eine Bioprobe angewendet werden kann, in der Zellen in einem lebenden Zustand sind, sondern auch auf eine Bioprobe, in der Zellen in einem nicht-lebenden Zustand oder in verschiedenen anderen Zuständen sind.
Eine Bioprobe, auf welche die vorliegende Erfindung angewendet wird, ist zum Beispiel eine Bioprobe kurz nach ihrer Entnahme aus einem lebenden Körper oder eine Bioprobe, die entsprechend für eine vorgegebene Zeitspanne konserviert worden ist. Im letzteren Fall ist keine Beschränkung auf ein spezifisches Konservierungsverfahren gegeben. Eine bevorzugte Bioprobe ist eine, die nach unmittelbarem Einfrieren mit flüssigem Stickstoff konserviert worden ist, von dem gesagt wird, dass er in der Lage ist, Zellen annähernd auf Dauer zu konservieren. Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls auf eine Bioprobe anwendbar sein, die mit einer anderen kryogenen Flüssigkeit als flüssigem Stickstoff eingefroren sein. Es wird gesagt, dass es möglich ist, eine Bioprobe, auf die die vorliegende Erfindung anwendbar ist, bei einer Temperatur von ungefähr –80 °C für Monate bis zu einem Jahr zu konservieren.
Die vorangehend beschriebenen Bioproben sind definiert als ein „Werkstück (ein Gegenstand, der zu bearbeiten ist)“, das in einer Schneideinrichtung und mit einem Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zu schneiden ist.
1A zeigt eine schematische Vorderansicht, die einen Hauptbestandteil einer Schneideinrichtung für Bioproben gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht und 1B zeigt eine schematische Seitenansicht, die einen Hauptbestandteil einer Schneideinrichtung für Bioproben gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
1 zeigt ein Werkstück W, das mit einem Messer 1 geschnitten wird. In 1 ist das Werkstück W im Wesentlichen würfelförmig und ist auf einer Platte 4 platziert, die auf einem geraden Tisch 5 liegt. Das Werkstück W wird auf der Platte 4 eingefroren und fixiert, indem es einem Auftröpfeln von Flüssigkeit zum Einfrieren und Fixieren, unmittelbar bevor es geschnitten wird, unterworfen wird. Die Flüssigkeit zum Einfrieren und Fixieren ist vorzugsweise eine kryogene Flüssigkeit, gewöhnlicherweise flüssiger Stickstoff (–196 °C). Als andere kryogene Flüssigkeiten können Methan (–163,0 °C), flüssiger Sauerstoff (–186,0 °C), flüssiger Wasserstoff (–252,8 °C) für Einfrieren und Fixieren verwendet werden. Als Beispiel wird ein Behälter für flüssigen Stickstoff nachfolgend hierin beschrieben.
Der Tisch 5 ist bewegbar, um das Werkstück W zu bewegen oder seine Ausrichtung zu ändern. Die gerade Oberfläche der Platte 4 ist die Fixierungsfläche. Die Platte 4 kann aus jedem Material sein, solange ihre Ebenheit bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff aufrecht gehalten werden kann und es kann unter anderem aus Fluorharz, PET, Glas, Metall, usw. hergestellt sein. Die Dicke der Platte 4 beträgt beispielsweise annähernd 200 µm bis 300 µm.
In dem in 1 dargestellten Beispiel bleibt ein Werkstück W, das geschnitten wird, unbewegt und das Messer 1 steht von einem Abschnitt des Randes eines scheibenförmigen Trägers 3 nach außen über. Das Messer 1 ist an dem Träger 3 durch Befestigungsschrauben 14, Befestigungsmuttern 15 und eine Verriegelungsplatte 16 befestigt. Ein Verfahren zur Befestigung des Messers 1 ist nicht auf das Beispiel in der Figur beschränkt. Die eigentliche Schneidfunktion des Messers 1 liegt in einer Schneidkante 11, die über den Rand des Trägers 3 hinausragt. Der Träger 3 ist konzentrisch an einem Drehachsenelement 2 befestigt. Die Drehung von dem Drehachsenelement 2 führt zur Drehung der Schneidkante 11 des Messers 1, um das Werkstück W in einen Schnitt zu schneiden. Das Bezugszeichensymbol r weist auf die Drehrichtung des Messers 1 hin. In einem Beispiel wird das Messer 1 mit der Hand gedreht, z. B. wird ein Handgriff zum Drehen des Drehachsenelements 2 langsam mit der Hand gedreht. In einem anderen Beispiel kann das Messer 1 mit einem Elektromotor gedreht werden. Eine Drehgeschwindigkeit des Messers 1 ist optional; allerdings wird eine niedertourige Drehung, die annähernd denselben Grad der Drehung aufweist, wie die per Hand erzeugte Drehung, bevorzugt. Dies dient dazu, dass das Werkstück W aufgrund von seitlichen Taumelbewegungen oder durch Vibrationen des Messers 1 während der Drehung nicht von der Platte 4 fällt.
Die Dicke eines Schnittes kann gemäß dem Positionsverhältnis von dem Werkstück W zu dem Messer 1 bestimmt werden. Diese Einstellung, wie hierin nachfolgend beschrieben, wird durch das Verschieben des Tisches 5 eingestellt. Es kann eine vorgegebene Dicke, wie beispielsweise 5 µm, 10 µm, 30 µm usw. erhalten werden. Die Dicke von einem Schnitt, der für die Zellbeobachtung mit einem optischen Mikroskop verwendet wird, beträgt gewöhnlicherweise ungefähr mehrere µm bis einige zehn µm.
Um einen Schnitt zu erhalten, der auch mit Sicherheit von dem Rest des Werkstücks W abgetrennt ist, wird die Höhe des Messers 1 eingestellt. Diese Einstellung wird durch Einstellen der Höhe des Drehachsenelements 2 durchgeführt (siehe den in 1 dargestellten Pfeil H).
Es wird bevorzugt, flüssigen Stickstoff aus einer Flüssigstickstoff-Zuführungsvorrichtung 6 zuzuführen, um zu verhindern, dass die Temperatur des Werkstücks W und der Platte 4 während des Schneidvorgangs steigt. Von der Flüssigstickstoff-Zuführungsvorrichtung 6 ist in 1 nur ein Düsenteil dargestellt, wobei allerdings ein Behälter, der in 1 nicht dargestellt ist, den flüssigen Stickstoff liefert. Die Flüssigstickstoff-Zuführungsvorrichtung 6 wird an einer Position platziert, welche nicht den Schneidvorgang des Messers 1 stört.
2A zeigt eine schematische Ansicht einer Zeitreihe, die ein Messer 1 beim Schneiden eines Werkstücks W, das in der Ausführungsform in 1 gezeigt ist, bildlich darstellt. 2B zeigt ein Beispiel des Querschnitts A, d. h., den Querschnitt des Messers 1, das in 2A dargestellt ist.
2A zeigt, dass die Schneidkante 11 des sich drehenden Messers 1 in die obere Kante von dem Werkstück W eindringt und durch es hindurchgeht, nachdem sie das gesamte Werkstück durchgeschnitten hat. Der niedrigste Punkt des Durchgangs der Schneidkante 11 stimmt annähernd mit der Unterseite von Werkstück W überein. Um diese Übereinstimmung zu erzielen, wird die Höhe des Messers 1 bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird es wie dargestellt bevorzugt eine geringe Menge des Koagulationsmittels 7 auf die Oberfläche der Platte 4 aufzutragen (siehe den dritten zugehörigen Stand der Technik). Ein bevorzugtes Beispiel des Koagulationsmittels 7 ist ein dickflüssiges wasserlösliches Polymer, wie beispielsweise Polyvinylalkohol, Stärke, Natriumalginat, Carboxymethylcellulose. Die grundsätzliche Rolle des Koagulationsmittels 7 ist das Werkstück W vor dem Einfrieren und Fixieren vorübergehend festzuhalten. Darüber hinaus verursacht das Platzieren des Werkstücks W auf das Koagulationsmittel 7, dass das Werkstück W von der Oberfläche der Platte 4 durch die dicke des Koagulationsmittels 7 angehoben wird. In diesem Fall wird es dadurch, wie dargestellt, dass die Höhe von dem Messer 1 derart eingestellt wird, dass die Schneidkante 11 des Messers 1 in das Koagulationsmittel 7 eindringt, es der Schneidkante 11 ermöglicht, das Werkstück W sicher insgesamt als Ganzes durchzuschneiden. Wenn das Koagulationsmittel 7 nicht aufgetragen wird, erfordert die Höheneinstellung des Messers 1 eine signifikant höhere Genauigkeit, um zu verhindern, dass die Schneidkante 11 die Oberfläche der Platte 4 berührt. Das Auftragen des Koagulationsmittels 7 stellt jedoch einen Spielraum für die Einstellung der Höhe des Messers 1 aufgrund der Dicke des Koagulationsmittels 7 zur Verfügung.
Wie in der Schnittansicht A von 2B dargestellt, weist das Messer 1 eine Schneidkante 11 an seiner Spitze, eine Schneideklinge 12, die sich in Richtung der Kante 11 verjüngt und einen flachen Abschnitt 13 auf. Das Messer 1 ist in diesem Beispiel zweischneidig, es kann allerdings auch einschneidig sein.
3 zeigt eine schematische Ansicht, die ein Profil einer Schneidkante 11 von einem Messer in einer Schneideinrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildlich darstellt. Die Schneidefunktion des Messers liegt im Wesentlichen in der Schneidkante 11. Die Drehbewegung des Messers 11, das ein bevorzugtes Profil in einer vorgegebenen Drehrichtung r aufweist, gestattet das Schneiden der Bioprobe als Werkstück W, während der lebende Zustand der Zellen erhalten wird. 3 zeigt nur die Schneidkante 11 im Fettdruck ohne das Messer als Ganzes darzustellen. Bezugszeichensymbol C weist auf eine Drehachse, d. h., das Drehzentrum hin. Die Schneidkante 11 weist ein spezifiziertes kurvenförmiges Profil auf, das sich zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende erstreckt.
Das erste Ende der Schneidkante 11 ist ein Punkt, der den kürzesten Abstand Rmin zu der Drehachse C aufweist (hierin nachfolgend als „ am nächsten gelegener Punkt Pmin“ bezeichnet). Das zweite Ende der Schneidkante 11 ist ein Punkt, der den längsten Abstand Rmax zu der Drehachse C aufweist (hierin nachfolgend als „am weitesten entfernt gelegener Punkt Pmax“ bezeichnet). Die Schneidkante 11 weist ein kurvenförmiges Profil auf, das sich von dem ersten Ende zu dem zweiten Ende erstreckt. Der am weitesten entfernt gelegene Punkt Pmax ist hinter dem am nächsten gelegenen Punkt Pmin in der Drehrichtung r. Zusammen mit der Schneidkante 11 nimmt der Abstand von der Drehachse C von jedem der Punkte auf der Schneidkante 11 monoton zu, beginnend mit dem am nächsten gelegenen Punkt Pmin bis zu dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax. Wenn beispielsweise der Abstand zwischen der Drehachse C und einem gegebenen Punkt P1 auf der Schneidkante 11 als R1 bestimmt ist und der Abstand zwischen der Drehachse C und einem gegebenen Punkt P2 auf der Schneidkante 11 als R2 bestimmt ist, wird ihre Ungleichheit als Rmin < R1 < R2 < Rmax ausgedrückt.
Das kurvenförmige Profil der Schneidkante 11, das entgegengesetzt zur Drehachse im Bezug auf eine Gerade Q liegt, welche den am nächsten gelegenen Punkt Pmin und den am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax verbindet, ist konvex (nach außen in Radiusrichtung gebogen, wie von der Achse C aus gesehen). Die Krümmung der Schneidkante 11 ist ein Kreisbogen in 3, die auch ein Ellipsenbogen oder eine andere Kurve wie beispielsweise eine Parabel oder eine Kurve höheren Grades sein kann.
Im Folgenden werden in 3 einige Beispiele für Dimensionierungen der Schneidkante 11 dargestellt:

– Abstand Rmin von der Drehachse C zu dem am nächsten gelegenen Punkt Pmin: 40 mm bis 6 mm (der Abstand Rmin entspricht dem Radius des kreisförmigen Trägers 3 in dem Beispiel in 1)
– Abstand Rmax von der Drehachse C zu dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax: 50 mm bis 75 mm
– Länge L1 der Schneidkante 11 in der Längsrichtung: 10 mm bis 15 mm
– Länge L2 der Schneidkante 11 in der Querrichtung: 18 mm bis 30 mm (Längsrichtung L1 und Querrichtung L2 sind auf den Moment bezogen, wenn der am weitesten entfernt gelegene Punkt Pmax den am niedrigsten gelegenen Punkt wie in 3 dargestellt trifft)
– Höhe h des Werkstücks W: 5 mm bis 8 mm

Wenn die Schneidkante 11 sich in der Drehrichtung r dreht, ist es möglich, einen Gegenstand zu schneiden, der innerhalb einer Ebene platziert ist, durch welche sich die Schneidkante 11 quer hindurch bewegt. Die Ebene ist eine Kreisringebene, begrenzt durch zwei kreisförmige Umlaufbahnen, die durch den am nächsten gelegenen Punkt Pmin und dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax erzeugt werden, wie durch die gestrichelten Linien dargestellt. Die Ebene wird hierin nachfolgend als ein “zum Schneiden brauchbarer Bereich“ bezeichnet. Um das Werkstück W in einen Schnitt zu schneiden, ist es erforderlich, das Werkstück W derart zu platzieren, dass ein Querschnitt des Werkstücks W sich annähernd in dem zum Schneiden brauchbaren Bereich befindet. Ein bevorzugtes Beispiel der Positionierung ist, wie in 3 dargestellt, dass die Bodenseite W1 des Werkstücks W mit dem am niedrigsten gelegenen Punkt des am weitesten entfernt gelegenen Punktes Pmax (niedrigster Punkt in senkrechter Richtung) fluchtend ausgerichtet ist. Anschließend wird die Höhe h des Werkstücks W derart festgelegt, dass die Oberseite W2 des Werkstücks W niedriger liegt als die kreisförmige Umlaufbahn des am nächsten gelegenen Punktes Pmin.
Genauer gesagt, kann es einen Bereich sowohl neben der rechten als auch der linken Kante der Bodenseite W1 des Werkstücks W geben, den die Schneidkante 11 aufgrund der kreisförmigen Umlaufbahn, welche durch den am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax wie in 3 dargestellt erzeugt wird, nicht erreicht und hinreichend schneidet. Dieses Problem wird durch das Anheben der Bodenseite W1 von dem Werkstück W aufgrund der Auftragung des Koagulationsmittels 7 auf die Platte 4, wie bei 2 erklärt, gelöst.
4, 5 und 6 zeigen verschiedene Beispiele, welche die Profilanforderungen für die Schneidkante 11 des Messers 1 gerecht werden, das in 3 bildlich dargestellt ist.
Was die drei Beispiele der Schneidkanten 11A, 11B, 11C betrifft, die in 4A dargestellt sind, sind die Positionen der am nächsten gelegenen Punkte Pmin und der am weitesten entfernt gelegenen Punkte Pmax identisch, allerdings sind die Profile der Krümmung zwischen den beiden Punkten unterschiedlich. Das Bezugszeichensymbol 11A zeigt eine kleine Krümmung. Bezugszeichensymbol 11B zeigt einen Ellipsenbogen. Bezugszeichensymbol 11C zeigt eine Krümmung, die sich in Richtung der Drehrichtung r hervorwölbt. 4B zeigt die kreisförmigen Umlaufbahnen des am nächsten gelegenen Punktes Pmin und des am weitesten entfernt gelegenen Punktes Pmax, welche durch die drehende Bewegung der drei Typen der in 4A dargestellten Schneidkanten erzeugt werden. Was die drei Schneidkanten betrifft, sind die Positionen der am nächsten gelegenen Punkte Pmin und der am weitesten entfernt gelegenen Punkte Pmax identisch und auch ihre kreisförmigen Umlaufbahnen sind identisch.
Wie in 4 dargestellt, muss der Träger 3, an dem das Messer 1 befestigt ist, nicht notwendigerweise eine Scheibenform wie in 1 dargestellt aufweisen. Der Träger 3 besitzt in 4 eine im Wesentlichen rechteckige Form und andere Formen werden dem gleichen Zweck dienen, solange ein derartiger Träger 3 sich ganzheitlich mit dem Drehachsenelement 2 dreht und das Messer 1 (im Wesentlichen seine Schneidkante 11) an einer gegebenen Position befestigt werden kann.
5 zeigt drei Beispiele für unterschiedliche Befestigungspositionen von dem Messer 1 im Bezug auf die Drehachse C. Was die Schneidkanten 11D, 11E und 11F des Messers 1 betrifft, die in 5A, 5C, beziehungsweise 5E dargestellt sind, sind ihre Profile identisch aber ihre Befestigungspositionen im Bezug auf die Drehachse C sind unterschiedlich. Unterschiedliche Befestigungspositionen führen zu unterschiedlichen Abständen von der Drehachse C zu dem am nächsten gelegenen Punkt Pmin und dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax. Die 5B, D und F zeigen kreisförmige Umlaufbahnen von dem am nächsten gelegenen Punkt Pmin und dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax, die durch die drehende Bewegung der entsprechenden Schneidkanten, welche in den 5A, C beziehungsweise 5E dargestellt sind, erzeugt wurden. Der Bereich, durch den die Schneidkanten sich quer bewegen, d. h., der Umfang des zum Schneiden brauchbaren Bereichs, unterscheidet sich entsprechend der Befestigungsposition der Schneidkante.
Die 6A, B und C zeigen Beispiel für andere Profile von dem Messer 1. In den 6A und B weist der flache Abschnitt 13 des Messers 1 einen erweiterten Bereich (schraffierter Bereich) auf, der sich rückwärts von dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax erstreckt. Der Bereich hinter dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax kann mit einer Kante als ein verlängerter Bereich der Schneidkante 11 versehen sein; allerdings trägt eine solche Kante nicht zum Schneidvorgang bei. Der effektive Bereich der Schneidkante 11 für den Schneidvorgang ist wie dargestellt nur der Bereich zwischen dem am nächsten gelegenen Punkt Pmin und dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax.
Während der Drehung des Messers 1, dreht sich der flache Abschnitt 13, der sich von der Schneidkante 11 erstreckt, und stellt einen Kontakt mit der Schnittfläche des Werkstücks her, nachdem die Schneidkante 11 das Werkstück W geschnitten hat. Dementsprechend ist die Kontaktzeit mit dem Werkstück um so länger, je größer der Bereich des flachen Abschnitts 13 ist, was möglicherweise zu einer Temperaturerhöhung oder einer Schädigung von dem Werkstück führt, die durch die Reibung mit der Schnittfläche hervorgerufen wird. Unter Berücksichtigung dieser Möglichkeiten wird ein Profil bevorzugt, dargestellt als die entsprechenden Messer in 4 und 5, bei dem der flache Abschnitt 13 hinter dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt Pmax nicht vorhanden ist. Wie in 6C dargestellt, kann der rückwärtige Rand des flachen Abschnitts 13 nach vorne in Richtung der Drehrichtung r ausgeschnitten werden. Allerdings sollte in diesem Zusammenhang das Profil und der Bereich des flachen Abschnitts 13 sorgfältig gestaltet werden, da die Schneidkante 11 nicht stabil gehalten werden kann, wenn der Bereich des flachen Abschnitts 13 zu schmal ist.
7 zeigt einen Arbeitsablauf eines Verfahrens zum Schneiden von Bioproben gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Ein Beispiel unter Verwendung von flüssigem Stickstoff wird hierin nachfolgend beschrieben werden; allerdings können auch andere kryogene Flüssigkeiten verwendet werden.
<Durchführung der Entnahme von Bioproben>
Eine zweckmäßige Größe der Probe wird aus einem Teil eines inneren Organs oder des Körpers eines lebenden Menschen oder Säugetiers abgeschnitten. Die in der Probe enthaltenen Zellen sind wie vorangehend beschrieben in einem lebenden Zustand. Die Größe der Probe sollte ausreichend sein, um ein Werkstück zum Schneiden zu erhalten. Wenn der Schneidvorgang gemäß der vorliegenden Erfindung unmittelbar durchgeführt wird, ist der nächste Arbeitsablauf die nachstehend beschriebene Durchführung der Präparation des Werkstücks>. Falls nicht, wird die Probe augenblicklich mit flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend konserviert bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs aufbewahrt. Bei diesem Konservierungsverfahren, das wohlbekannt ist, kann die konservierte Probe den lebenden Zustand der Zellen fast dauerhaft aufrechthalten.
<Durchführung der Präparation des Werkstücks>
Dieses Verfahren wird in einem Reinraum durchgeführt, der mit den benötigten Geräten ausgestattet ist. Im Falle einer Probe, die gerade für die Entnahme abgeschnitten worden ist, wird diese unmittelbar mittels Aufträufeln von oder Untertauchen in flüssigem Stickstoff eingefroren und in eine zweckmäßige Größe des Werkstücks aus der eingefroren Portion zurechtgeschnitten. Im Falle einer Probe, die bei der Stickstoff-Temperatur gelagert worden war, wird diese augenblicklich in eine zweckmäßige Größe des Werkstücks zurechtgeschnitten, während die Temperatur so weit wie möglich gehalten wird. Die Größe, die für ein zu schneidendes Werkstück angemessen ist und die waagrechte und senkrechte Länge der Schnittfläche wird aufgrund der Größe des für das Schneiden brauchbaren Bereichs von der Schneidkante der Schneideinrichtung bestimmt. Als Beispiel im Bezug zu 3 wird die Schnittfläche des Werkstücks als ein Quadrat mit 5mm Seitenlänge gesetzt, wenn die niedrigste Position der kreisförmigen Umlaufbahn von dem am nächsten gelegenen Punkt Pmin in der Höhe 8 mm über der Platte beträgt. Obgleich die Tiefe des Werkstücks in 3 willkürlich gewählt ist, ist sie relevant für die Dimensionen der fixierten Fläche des Werkstücks im Bezug auf die Platte 4 und eine ungenügende Tiefe macht eine stabile Fixierung nicht möglich, wodurch das beständige Schneiden schwierig wird. In diesem Beispiel beträgt die Tiefe ungefähr 10 mm. Auf diese Weise wird ein Werkstück mit der Form eines Würfels von 5 mm in der Höhe, 5 mm in der Breite und 10 mm in der Tiefe ausgeschnitten. Das Werkstück befindet sich in einem mit flüssigen Stickstoff eingefrorenen Zustand.
<Durchführung des Einfrierens und Fixierens von dem Werkstück auf der Platte>
Wie in 7A dargestellt wird eine Vertropfungsvorrichtung 8 für flüssigen Stickstoff, die eine Vertropfungsdüse unterhalb eines Behälters aufweist, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, auf eine zweckmäßige Höhe eingestellt. Der Tisch 5 und die Platte 4 werden auf den Platz unter die Vertropfungsvorrichtung 8 für flüssigen Stickstoff geschoben. Der Tisch 5 und die Platte 4 werden im Voraus auf ungefähr –30 °C gekühlt. Wie vorangehend beschrieben, wird das Auftragen von Koagulationsmittel auf die Platte 4 bevorzugt. Das Koagulationsmittel ist dickflüssig und in der Lage, das Werkstück vorübergehend auf der Platte zu fixieren. Es wird bevorzugt, dass ein sterilisiertes Koagulationsmittel verwendet wird. Es wird ebenfalls bevorzugt, die Schichtdicke des Koagulationsmittels in dem Ausmaß einzustellen, dass es den Boden des Werkstücks W von der Oberfläche der Platte 4 hochheben kann.
Das eingefrorene Werkstück W, das zu einer vorgegebenen Größe zurechtgeschnitten wurde, wird so auf der Platte 4 mit dem aufgetragenen Koagulationsmittel platziert, dass es direkt unter der Vertropfungsdüse der Vertropfungsvorrichtung 8 für flüssigen Stickstoff ist. Ein Anti-Spritzring 9, welcher darauf ausgerichtet ist, den tröpfelnden flüssigen Stickstoff N am Spritzen zu hindern, wird rund um das Werkstück W platziert. Anschließend wird der flüssige Stickstoff aus der Vertropfungsvorrichtung 8 für flüssigen Stickstoff getropft, wobei dessen Menge einstellbar ist. Jede beliebige Vorrichtung oder jedes beliebige Werkzeug mit einer anderen Gestalt als die der dargestellten Vertropfungsvorrichtung 8 für flüssigen Stickstoff kann verwendet werden, solange sie in der Lage ist, dem Werkstück W und der Platte 4 flüssigem Stickstoff zuzuführen. Das Vertropfen des flüssigen Stickstoffs macht es möglich, das Werkstück W, welches bereits selber eingefroren ist, weiterhin auf der Platte 4 unmittelbar einzufrieren und zu fixieren. In diesem Einfrieren und Fixieren wird die Stärke der Fixierung so eingestellt, dass sie verhindert, dass das Werkstück W sich während des Schneidvorgangs, der hierin nachfolgend beschrieben wird, nicht von der Platte 4 ablöst.
Eine Reihe von Arbeitsschritten vom zurechtschneiden des Werkstücks W über die Platzierung auf der Platte 4 und dem Vertropfen des flüssigen Stickstoffs N wird so schnell wie möglich durchgeführt, um einen Temperaturanstieg in dem eingefrorenen Werkstück W zu verhindern.
<Durchführung des Bewegens des Tisches>
Der Tisch wird aus der in 7A dargestellten Position in Richtung X in die Position bewegt, wie sie in 7B dargestellt ist (siehe den ungefüllten Pfeil in der Figur). Wie in 7B dargestellt, wird das Werkstück W direkt unter das Drehachsenelement 2 der Schneideinrichtung platziert. In diesem Stadium wird das Drehachsenelement 2 der Schneideinrichtung mit der Höheneinstellung H angehoben und das Messer 1 wird in eine Warteposition für das Schneiden platziert, die in einem ausreichenden Winkel von der Schneidposition entfernt ist.
<Durchführung der Positionierung>
Im Anschluss an den vorangehenden Schritt wird die Positionierung für die ordnungsgemäße Platzierung des Werkstücks W durchgeführt. Die horizontale Positionierung wird durch die parallele Bewegung des Tisches 5 in der X- und der Y-Richtung festgelegt und die Drehbewegung in der θ-Richtung. Diese Bewegungsfunktion des Tisches 5 kann mit der Hand durchgeführt werden oder durch einen elektrischen Motor. Ein elektrischer Motor, der mit einer Steuerungsfunktion ausgestattet ist, welche das Einstellen des Umfangs der Bewegung ermöglicht, wird bevorzugt. Die Bewegung in der X-Richtung ist für die Platzierung des Werkstücks W direkt unter der Drehachse C des Messers 1 ausgelegt. Die Bewegung in der Y-Richtung ist für das Festlegen eines Startpunktes des Schneidens und der Schichtdicke eines Schnittes, der aus dem Werkstück W herausgeschnitten wird, ausgelegt. Die Drehbewegung in θ-Richtung ist zum Anpassen der Verwindung und der Ausrichtung des Werkstücks W, wenn es gefroren ist, ausgelegt. Zum Schluss wird das Drehachsenelement 2 in den Schneidpunkt abgesenkt. In diesem Stadium ist das Messer immer noch von dem Werkstück W entfernt und steht mit dem Werkstück W nicht in Kontakt.
<Durchführung des Schneidens>
Die Drehung des Drehachsenelements 2 ermöglicht es, dass das Messer 1 sich in der Drehrichtung r dreht, was das Schneiden des Werkstücks W zur Folge hat. Das Messer 1 kann manuell oder durch einen elektrischen Motor gedreht werden. Während des Positionierungs- und Schneidvorgangs wird eine angemessene Menge an flüssigem Stickstoff aus der Vertropfungsvorrichtung 8 für flüssigen Stickstoff zugeführt, um eine Temperaturerhöhung in dem Werkstück W und der Platte 4 zu verhindern. Der flüssige Stickstoff kann kontinuierlich oder mit Unterbrechungen zugeführt werden. Nachdem das Messer 1 durch das Werkstück W hindurchgegangen ist und es in einen Schnitt geschnitten hat, legt sich der Schnitt auf die Platte 4.
In der Ausführungsform von 7 verbleibt das Werkstück während der Drehung des Messers 1 unbeweglich an seinem Platz. In einer weiteren Ausführungsform kann das Werkstück W während der Drehung des Messers 1 parallel von rechts nach links in X-Richtung bewegt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann die Drehachse C während der Drehung des Messers 1 parallel von rechts nach links in X-Richtung bewegt werden. In diesen weiteren Ausführungsformen bewegt sich die Schneidkante 11 in einer Kombination aus kreisförmiger Bewegung und linearer Bewegung im Bezug auf das Werkstück W. Dementsprechend bewegt sich der am weitesten entfernt gelegene Punkt Pmax der Schneidkante 11 von dem linken Ende zu dem rechten Ende entlang von dem Boden des Werkstücks W (siehe 3). Dies sondert einen Bereich aus, in welchem die Schneidkante 11 nicht in die Nähe des Bodens von dem Werkstück W kommt. In diesem Fall ist das Anheben des Bodens von dem Werkstück W mit dem Koagulationsmittel nicht notwendig und das Koagulationsmittel wird hauptsächlich für die vorübergehende Fixierung verwendet.
<Vorbereitung für den nächsten Schneidvorgang>
Wenn ein weiterer Schnitt daran anschließend geschnitten wird, wird das Messer 1 in der Drehrichtung r in die Warteposition, die in 7B dargestellt ist, zurückgedreht und das Werkstück W wird um den Betrag entsprechend der Dicke des nächsten Schnittes in Y-Richtung bewegt. Die untere Grenze der Schichtdicke eines Schnittes, die für das Schneiden durchführbar ist, hängt von verschiedenen Bedingungen wie beispielsweise der Dicke des flachen Bereichs oder der Länge der Schneideklinge des Messers 1 ab. Wenn beispielsweise die Dicke des flachen Bereichs von Messer 1 annähernd 200 µm bis 250 µm beträgt, ist das Schneiden eines Schnittes mit ein paar µm möglich, was im Experiment bestätigt wurde.
<Nachbehandlung des Schnittes>
Der auf der Platte 4 liegende Schnitt wird mit einer Pinzette aufgenommen und unmittelbar in einem Gewebekultur-Wachstumsmedium untergetaucht. Dies dient dem Schutz und dem Auftauen des Schnittes. Eine Vielzahl von Schnitten kann abschnittsweise nach kontinuierlichem Schneiden entnommen werden. Dem Schnitt kann unmittelbar vor dem Herausnehmen flüssiger Stickstoff zugeführt werden, um einen Temperaturanstieg während des Überführens in das Gewebekultur-Wachstumsmedium zu verhindern.
<Verfahren der Zellbeobachtung>
Der Schnitt der Bioprobe, der in dem Gewebekultur-Wachstumsmedium wie vorhergehend beschrieben aufgetaut wurde, wird beispielsweise wie folgt zur Zellbeobachtung bereitgestellt.
Beobachtungsverfahren 1
Zellen, die in einem Schnitt existieren, der in einem Zustand vorliegt, in dem er in dem Gewebekultur-Wachstumsmedium in einem Behälter untergetaucht ist, werden von der Außenseite des Behälters mit einem Phasenkontrastmikroskop betrachtet.
Beobachtungsverfahren 2
Im Anschluss an die obige Beobachtung 1 kann der Behälter, der den Schnitt untergetaucht in dem Gewebekultur-Wachstumsmedium enthält, ferner in einem Kohlendioxid-Inkubator (z. B. bei 37 °C, 5 % Kohlendioxidkonzentration) gehalten werden, während die Kultur fortgesetzt wird. In diesem Stadium werden die Zellen, die in dem Schnitt existieren, von außerhalb des Behälters mit einem Phasenkontrastmikroskop betrachtet. Diese Beobachtung kann so lange fortgesetzt werden, solange die Zellen im lebenden Zustand erhalten bleiben und sind zum Beispiel einsetzbar in einem Fall, in welchem die Wirkung von zugesetzten chemischen Agenzien auf die Zellen in einem medizinischen und pharmazeutischen Gebiet studiert werden.
Beobachtungsverfahren 3
Der Schnitt in dem Gewebekultur-Wachstumsmedium wird herausgenommen und anschließend die Zellen in dem Schnitt angefärbt, um sie mit einem Mikroskop zu betrachten.
Herkömmlicherweise benötigt ein Zellbeobachtungsverfahren eine Formalin-Behandlung, Alkohol-(100 %)Behandlung und eine Behandlung durch Paraffin-Einbettung usw., die auf eine Bioprobe vor dem Schneiden eines Schnittes angewendet werden, gefolgt durch Anfärbung. In einem derartigen herkömmlichen Verfahren wir Zeit benötigt und die Arbeitsschritte sind kompliziert und es sind verschiedene Behandlungsreagenzien nötig, wobei darüber hinaus eine Beobachtung lebender Zellen nicht möglich ist. Auf der anderen Seite macht es die Anwendung der vorliegenden Erfindung möglich, einen Schnitt innerhalb kurzer Zeit und mit einfachen Arbeitsschritten zu schneiden, ohne dass verschiedene Behandlungsreagenzien benötigt werden.
Zusätzlich ermöglicht die vorliegende Erfindung das Schneiden und Beobachten von Zellen in einem lebenden Zustand.
8 zeigt eine allgemeine Vorderansicht eines Beispiels einer vollständigen Einrichtung einschließlich einer Schneideinrichtung für das Verfahren zum Schneiden von Bioproben, das in 7 bildlich dargestellt ist. Ein Hauptteil der vorangehend beschriebenen Schneideinrichtung wird einem Arbeitsbereich 21 in einem sterilen Raum, wie beispielsweise einer Reinraumwerkbank 20, wie sie in 8 dargestellt ist, oder einer Glove-Box bereitgestellt. Ein Arbeiten unter einem Ausschluss der umgebenden Luft ist in dem Arbeitsbereich 21 möglich. Eine vertikal bewegliche Schiebetür wird an der Vorderseite der Reinraumwerkbank 20 bereitgestellt, obwohl sie nicht dargestellt ist. Wahlweise können Handschuhe für die Arbeitsschritte in der Vorderseite der Reinraumwerkbank 20 bereitgestellt werden.
Oben auf der Einrichtung kann ein HEPA-Filter für die Belüftung und zur Aufrechterhaltung von sterilen Bedingungen in dem Arbeitsbereich 21 bereitgestellt werden. Eine UV-Lampe 24 und eine Ozon-Generator 25 werden dementsprechend in dem Arbeitsbereich 21 bereitgestellt.
Das Drehachsenelement 2 der Schneideinrichtung wird rechts in dem Arbeitsbereich 21 derart bereitgestellt, dass seine Höhe einstellbar ist. Die Drehung eines ersten manuellen Schneidvorgangs-Betätigungshandgriffs 26, der außerhalb der Reinraumwerkbank 20 bereitgestellt wird, wird auf die Drehung des Drehachsenelements 2 über zweckmäßige Übertragungsmechanismen übertragen. Dieser Handgriff wird verwendet, wenn das Schneiden manuell durchgeführt wird. Die Vertropfungsvorrichtung 8 für flüssigen Stickstoff wird in der Nähe des Messers 1 derart bereitgestellt, das ihre Position einstellbar ist.
Die Vertropfungsvorrichtung 8 für flüssigen Stickstoff wird links in dem Arbeitsbereich 21 bereitgestellt und ihre Position ist in der Y-Richtung mittels Drehung eines zweiten manuellen Schneidvorgangs-Handgriffs 27 einstellbar, der außerhalb der Reinraumwerkbank 20 bereitgestellt wird.
Der Tisch 5 wird in X- und Y-Richtung durch die steuerbare Bewegung eines bewegbaren Tisches 10 bewegt, auf dem der Tisch 5 mittels eines Pneumatikspannfutters usw. fixiert ist. Die Bewegung des beweglichen Tisches 10 wird über die Steuerung von einem elektrischen Motor mit einem Bedienungspult 23 gesteuert, das am rechten Ende des Arbeitsbereichs 21 bereitgestellt wird. Der Tisch 5 kann in der θ-Richtung, wie in 7 dargestellt, durch Drehen des Handgriffs 28 zum Betätigen des θ-Winkels des beweglichen Tisches gedreht werden, der außerhalb der Reinraumwerkbank 20 bereitgestellt ist.
Der Bedienungspult 23 weist auf seiner Außenseite Betätigungsknöpfe usw. für verschiedene Einstellungen in Bezug auf das Laufen der Reinraumwerkbank 20 und für die Schneideinrichtung auf. In dem Bedienungspult 23 sind eine elektrische Ausrüstung und Steuerungsvorrichtungen für einen elektrischen Motor enthalten.
9 zeigt eine schematische Seitenansicht, die einen Schnitt einer Bioprobe bildlich darstellt, der unter Verwendung einer Schneideinrichtung und eines Schneidverfahrens gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung herausgeschnitten worden ist. Die Oberseiten und die Unterseiten, die in 9 dargestellt sind, sind die Schnittflächen von dem Messer. Die Schichtdicke t des Schnittes ist als ein Beispiel auf ungefähr 30 µm festgesetzt. Die Bezugszeichensymbole CL1 und CL2 repräsentieren jeweils eine der Zellen. In diesem Beispiel beträgt der Durchmesser d einer Zelle ungefähr 10 µm. Was die Zelle CL2 an der Schnittfläche betrifft, von der ein Teilbereich weggeschnitten wurde, ist gefunden worden, dass nur noch die Zellmembran übrig geblieben ist und der Rest der Zelle ausgeflossen ist. Im Gegensatz dazu ist die Zelle CL1 zwischen den beiden Schnittflächen vollständig erhalten geblieben. Zum Beispiel kann bei der Durchführung der Beobachtung mit einem Mikroskop die Zelle CL1, die perfekt erhalten ist, beobachtet werden. Weiterhin ist bestätigt, dass die Zelle CL1 in diesem Stadium den Zustand (Position und Funktion) aufrecht hält, den sie in dem ursprünglich lebenden Körper präsentiert hat. Das bedeutet, dass sie als eine lebende Zelle identifiziert wurde, die in ihrer Position, in der sie eine Rolle bei der Bildung von Gewebe in einem lebenden Körper und seinen innewohnenden Funktionen wie beispielsweise Proliferation, Reparatur, Metabolismus und Signaltransduktion zwischen den Zellen eine Rolle gespielt hatte, als intakt erhalten geblieben ist.
Als Vergleichsbeispiele wurden weitere Schneidverfahren ausprobiert, in denen ein gerades Messer oder ein Scheibenmesser verwendet worden sind oder ein Messer gerade durch ein gefrorenes und fixiertes Werkstück bewegt wurde. Allerdings verformten sich die Zellen bei diesen Verfahren in dem Schnitt und veränderten ihre Positionen oder die meisten Zellen wurden vollkommen beschädigt. In einem weiteren Fall, in dem ein Werkstück ohne Einfrieren auf einer Platte platziert wurde, war es nicht möglich, dieses in einen Schnitt zu schneiden.
Die Schneideinrichtung und das Schneidverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist auf eine Bioprobe anwendbar, bei der es nicht notwendig ist, die Zellen in einem lebenden Zustand zu erhalten. In diesem Fall ist das Halten bei Unterkühlungs-Temperaturen nicht notwendig und ein Werkstück kann unter Verwendung eines anderen Verfahrens als mit einer kryogenen Flüssigkeit eingefroren und fixiert werden. Zum Beispiel kann ein Werkstück durch Abkühlen und Einfrieren des Koagulationsmittels (siehe den dritten zugehörigen Stand der Technik), welches vorangehend beschrieben wurde, eingefroren und fixiert werden.
10 zeigt eine mikroskopische Aufnahme (400-fache Vergrößerung) eines 25-µm dicken Schnittes, der aus einer Rattenleber mit einer Einrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung herausgeschnitten wurde. Die entsprechenden Zellen sind in einem Zustand erhalten, in dem sie in dem lebenden Körper waren.
Die Schneideinrichtung und das Schneidverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, den Status der Zellen als Ergebnis des Experimentes zu überprüfen, indem sie auf eine Bioprobe angewendet werden, an der das gewünschte Experiment durchgeführt worden ist. Es ist ebenfalls möglich unter Verwendung eines Schnittes, der aus einer Bioprobe mit der Schneideinrichtung und dem Schneidverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung geschnitten wurde, eine Nachverfolgung eines gewünschten Experiments durchzuführen oder ein gewünschtes Produkt mit einem derartigen Schnitt herzustellen.
Es ist anzumerken, dass die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nicht einschränkend sind bezüglich der in den Zeichnungen beschriebenen Beispiele, sondern sie können unter verschiedenen Aspekten modifiziert werden, solange diese mit dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung übereinstimmen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

JP 2011-232299 A [0003]
JP 2007-30059 A [0005]
JP 2007-237376 [0005]

Claims

Einrichtung zum Schneiden einer Bioprobe als Werkstück in ein Schnittteil, die Folgendes aufweist: eine Platte, auf die das Werkstück platziert wird; eine Vorrichtung zum Einfrieren und Fixieren des Werkstücks auf der Platte; und ein Messer zum Schneiden des eingefrorenen Werkstücks auf der Platte in ein Schnittteil mittels einer Drehbewegung in einer vorgegebenen Drehrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Profil einer Schneidkante des Messers eine Krümmung aufweist, die an einem zu einer Drehachse am nächsten gelegenen Punkt beginnt und an einem am weitesten von der Achse entfernt gelegenen Punkt endet, wobei der Abstand von der Achse zu jedem der Punkte auf der Krümmung von dem am nächsten gelegenen Punkt bis zu dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt monoton ansteigt, dass der am weitesten entfernt gelegene Punkt in der Drehrichtung hinter dem am nächsten gelegenen Punkt liegt und dass die Krümmung konvex ist, gegenüberliegend zu der Drehachse und mit Bezug zu einer Geraden welche den am nächsten gelegenen und den am weitesten von der Achse entfernt gelegenen Punkt verbindet.
Einrichtung zum Schneiden einer Bioprobe gemäß Anspruch 1, wobei eine kryogene Flüssigkeit zum Einfrieren und Fixieren in der Vorrichtung verwendet wird.
Einrichtung zum Schneiden einer Bioprobe gemäß Anspruch 2, wobei die kryogene Flüssigkeit dem Werkstück während des Schneidvorgangs mit dem Messer zugeführt wird.
Einrichtung zum Schneiden einer Bioprobe gemäß Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die kryogene Flüssigkeit flüssiger Stickstoff ist.
Verfahren zum Schneiden einer Bioprobe als Werkstück in ein Schnittteil, welches die Schritte umfasst von: Platzieren des Werkstücks auf eine Platte; Einfrieren und Fixieren des Werkstücks auf der Platte; und Schneiden des gefrorenen Werkstücks, das auf der Platte fixiert ist, in einen Schnitt mittels einer Drehbewegung eines Messers in einer vorgegebenen Drehrichtung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Profil einer Schneidkante des Messers eine Krümmung aufweist, die an einem zu einer Drehachse am nächsten gelegenen Punkt beginnt und an einem am weitesten von der Achse entfernt gelegenen Punkt endet, wobei der Abstand von der Achse zu jedem der Punkte auf der Krümmung von dem am nächsten gelegenen Punkt bis zu dem am weitesten entfernt gelegenen Punkt monoton ansteigt, dass der am weitesten entfernt gelegene Punkt sich in der Drehrichtung hinter dem am nächsten gelegenen Punkt befindet, und dass die Krümmung konvex ist, gegenüberliegend zu der Drehachse und mit Bezug auf eine Gerade, welche den am nächsten gelegenen Punkt und den am weitesten entfernt gelegenen Punkt verbindet.
Verfahren zum Schneiden einer Bioprobe gemäß Anspruch 5, wobei eine kryogene Flüssigkeit zum Einfrieren und Fixieren in der Vorrichtung verwendet wird.
Verfahren zum Schneiden einer Bioprobe gemäß Anspruch 6, wobei die kryogene Flüssigkeit dem Werkstück während des Schneidvorgangs mit dem Messer zugeführt wird.
Verfahren zum Schneiden einer Bioprobe gemäß Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei die kryogene Flüssigkeit flüssiger Stickstoff ist.
Ausschnittteil einer Bioprobe unter Anwendung des Verfahrens zum Schneiden einer Bioprobe gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8.
Verfahren zur Zellbeobachtung, welches die Schritte umfasst: Herstellen eines Schnittteils von einer Bioprobe durch Verwendung des Verfahrens zum Schneiden einer Bioprobe gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8; und Beobachtung der Zellen in dem Schnittteil mit einem Phasenkontrastmikroskop, während das Schnittteil in einem Gewebekultur-Wachstumsmedium eingetaucht ist.
Verfahren zu Zellbeobachtung gemäß Anspruch 10, das ferner den Schritt der Beobachtung von Zellen, die in dem Schnittteil enthalten sind, mit einem Phasenkontrastmikroskop umfasst, wobei die Kultur fortgeführt wird und das Gewebekultur-Wachstumsmedium, welches das eingetauchte Schnittteil enthält, in einem Kohlendioxid-Inkubator gehalten wird.
Verfahren zur Zellbeobachtung, welches die Schritte umfasst: Herstellen eines Schnittteils von einer Bioprobe durch Verwendung des Verfahrens zum Schneiden einer Bioprobe gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8; und Beobachten der in dem Schnittteil enthaltenen Zellen, nachdem diese aus dem Gewebekultur-Wachstumsmedium nach dem Eintauchen entnommen und anschließend angefärbt wurde.