CN110174303A - 一种掌叶木种仁油体观察冰冻切片的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种掌叶木种仁油体观察冰冻切片的制作方法，包含以下操作步骤：(1)取掌叶木种子，分别切取两片子叶中间部分；(2)包埋：预冷，待温度降至‑30±2℃后，滴包埋剂，冷冻40±3min；(3)进行连续切片，切片厚度为15±2μm；(4)将切好的组织在载玻片上黏附，将玻片黏附有切好组织的部分浸入水里，抖动使组织切片离开玻片在水中展开；(5)将水中展开的切片拖动至载玻片上，滴加染液，盖上盖玻片，即得掌叶木种仁油体观察冰冻切片。本发明方法制作所得冷冰切片在显微镜下掌叶木种仁油体清晰可见，子叶贮藏细胞完整度较好，细胞基本无重叠，切片完整度较优且舒展不易卷曲。
Description
技术领域
本发明涉及一种冰冻切片的制作方法，特别涉及一种掌叶木种仁油体观察冰冻切片的制作方法。
背景技术
油体(oil body)又称脂质体(lipid body)或油质体(oleosome)(董劲松，2009)，常贮藏于种子子叶或胚乳中，是由半单位膜包裹液态三酰甘油(triacylglycerols，TAG)脂类物质形成的亚细胞微滴(Huang A H C,1992；Tzen et al.,1992)，是植物油脂储存的基本单位。因油体具有稳定性，不易受外界影响而发生融合或聚合(Frandsen et al.,2001)，常用于从细胞水平上观察植物油脂生长发育规律和鉴定高低含油率品种间的差异性(杨森2015；陈虹，2015；罗丽萍2014)。目前对油体显微观察研究多采用超薄切片和透射电镜或扫描电镜(Tzen等，1993；郭维等，2016)、徒手切片和激光共聚焦显微镜(董劲松，2009；)或石蜡切片和光学显微镜(赵娜,2015)进行研究，这些方法存在仪器设备要求较高或制作步骤过于烦琐的特点，难以推广普及，制约了对油体发育与含油率相关性等关键问题的研究。
冰冻切片是利用低温使组织快速冷冻进行切片的一种方法，具有简便、快速、高效、易操作的特点，可更好的保持生物分子活性，广泛应用于动物与人体组织研究中(Sathyanesan S N，2002；李建霞，2013)，但在植物上的研究较少，主要原因在于植物组织含水量远大于动物，冰冻后硬度较大难以切片且无法保持组织结构完整性(谢佩松2009)。如何确定冰冻切片最优方案使之适用于不同植物材料的显微观察是当前面临的重要问题。
掌叶木是中国西南喀斯特地区特有的国家Ⅰ级保护植物(贵州省林业厅,2000；金鉴明等,1992)，其种子含油率为42.92％(陈波涛等,2007)，种仁含油率高达52.60％(吕清华等,1980)，也是一种优良的木本粮油植物，在营养、保健和工业上市场前景广阔。掌叶木种子属于不具胚乳种子，其油体主要集中于种仁的子叶中，但其油体特性，油脂发育和变化规律等关键性问题尚不清楚，建立掌叶木种仁油体显微观察与分析的冰冻切片方法，可为进一步探索其油脂品质改良和品种选育奠定科学基础，对该珍稀濒危物种种群人工扩繁及合理保护与适度利用具有重要意义。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的切片参数未知的问题，发明一种掌叶木种仁油体观察冰冻切片的制作方法，旨在得到一种切片效果好，观察的掌叶木种仁油体清晰的冰冻切片。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种掌叶木种仁油体观察冰冻切片的制作方法，包含以下操作步骤：
(1)取气干(含水量为13％左右)掌叶木种子，剥去种皮，分别切取两片子叶中间部分，材料现剥现用；
(2)将步骤(1)切取所得物质进行包埋：预冷，待冷冻箱温度降至-30±2℃后，滴包埋剂，将子叶垂直置于包埋剂中，待包埋剂与子叶样本牢固的粘附在标本盘上，继续滴加明胶包埋剂数滴，直至将子叶全部覆盖，包埋时明胶用量要适宜，不能留有气泡，冷冻40±3min；
(3)进行连续切片，切片时要用力均匀多切几下，保证切面平整，切片厚度为15±2μm；
(4)将切好的组织在干净的载玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带，以避免组织摊片过程中皱褶，手持玻片将玻片黏附有切好组织的部分浸入盛满常温蒸馏水的培养皿里，轻轻抖动使组织切片离开玻片展开在蒸馏水中，待展片备用；
(5)利用毛笔将蒸馏水中展开的切片轻轻地拖动至载玻片上，要轻否则切片会碎掉，滴加染液，盖上盖玻片，用滤纸吸掉多余染液，即得掌叶木种仁油体观察冰冻切片，制作完成的掌叶木种仁油体观察冰冻切片放置5min，待染液染色均匀后，上光学显微镜观测拍照。
优选的是，步骤(2)中所述的包埋剂为质量浓度20％的明胶。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明方法制作所得冷冰切片在显微镜下掌叶木种仁油体清晰可见，子叶贮藏细胞完整度较好，细胞基本无重叠，切片完整度较优且舒展不易卷曲，这为进一步观察和定量分析掌叶木子叶贮藏细胞和油体的大小、分布与形态特性等研究提供帮助。
附图说明
图1是本申请制作所得掌叶木种仁油体观察冰冻切片观察到的掌叶木子叶贮藏细胞显微结构，图例为30μm。
图2本申请制作所得掌叶木种仁油体观察冰冻切片观察到的掌叶木子叶贮藏细胞显微结构，图例为10μm。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一种掌叶木种仁油体观察冰冻切片的制作方法，操作步骤如下：
(1)从冰箱中取气干的掌叶木种子(含水量为13％左右)，剥去种皮，分别切取两片子叶中间部分，材料现剥现用；
(2)将步骤(1)切取所得物质进行包埋：设置冷冻切片机冷冻箱温度，将切片刀固定于切片机刀槽上，标本盘置于快速冷冻架上，预冷，待冷冻箱温度降至-30±2℃后，即温度在-30℃上下浮动2℃左右是允许的，滴少量质量分数为20％明胶包埋剂，滴入量能保证子叶样本投影于标本盘上面积能覆盖即可，将子叶垂直置于标本盘包埋剂中，待包埋剂与子叶样本牢固的粘附在标本盘上，继续滴加明胶包埋剂数滴，直至将子叶全部覆盖，包埋时明胶用量要适宜，不能留有气泡，冷冻40±3min，即时间在40min上下浮动3min左右是允许的；
(3)进行连续切片，切片时要用力均匀多切几下，保证切面平整，切片厚度为15±2μm，即厚度在15μm上下浮动2μm左右是允许的，；
(4)将切好的组织在干净的载玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带，以避免组织摊片过程中皱褶，手持玻片将玻片黏附有切好组织的部分浸入盛满常温蒸馏水的培养皿里，轻轻抖动使组织切片离开玻片展开在水中，待展片备用；
(5)利用毛笔将蒸馏水中展开的切片轻轻地拖动至载玻片上，要轻否则切片会碎掉，滴加苏丹Ⅲ染液，盖上盖玻片，用滤纸吸掉多余染液，即得掌叶木种仁油体观察冰冻切片，制作完成的掌叶木种仁油体观察冰冻切片放置5min，待染液染色均匀后，上光学显微镜观测拍照。
切片最优方案的研究过程
1.切片品质评价
分别从抗卷度、细胞完整度，切片完整度，显微观察清晰度4个能直接反映切片品质的评判指标对切片结果进行评判，每一指标均分为5级，评分标准见表1，各切片品质总分＝抗卷度得分+细胞完整度得分+切片完整度得分+显微观察清晰度得分。
表1掌叶木种仁冰冻切片品质评价标准
2.正交实验设计
能否获得高品质的掌叶木种仁冰冻切片决定因素为冷箱温度、冷冻时间和切片厚度，因此采用3次重复的L16(45)正交试验，以冷箱温度(A)、冷冻时间(B)、切片厚度(C)为试验因素，考虑冷箱温度(A)和冷冻时间(B)的交互影响(A×B)，同时设置空列(D)计算随机误差，其中冷箱温度设置-30、-25、-20、-15℃4个水平，冷冻时间设置20、30、40、60min 4个水平,切片厚度设置6、10、15、20μm 4个水平，共16个处理(详见表2)，每处理各重复3次，共48次实验。
3.正交试验结果与分析
表2掌叶木种仁冰冻切片正交试验结果的直观分析
A:冷箱温度；B:冷冻时间；C:切片厚度；D:空列；y1～y3:各次重复的切片品质总分；∑y:3次重复的切片品质总分之和；切片品质总分的平均值；各因素水平下对应；值的平均值；R:极差；同列中不同的小写和大写字母分别表示不同种源间同一表型性状在0.05和0.01水平上差异显著；括号内百分数为变异系数。
表3掌叶木种仁冰冻切片正交试验结果的方差分析
| 变异因素 | SS | df | Ms | F | P | 显著水平 |
| A | 87.167 | 3 | 29.056 | 13.809 | <0.001 | *** |
| B | 22.667 | 3 | 7.556 | 3.591 | 0.024 | * |
| A*B | 15.167 | 3 | 5.056 | 2.403 | 0.086 | |
| C | 243.167 | 3 | 81.056 | 38.521 | <0.001 | *** |
| D | 8.167 | 3 | 2.722 | 1.294 | 0.293 | |
| 随机误差 | 67.333 | 32 | 2.104 | |||
| 总变异 | 443.667 | 47 |
SS:偏差平方和；df:自由度；Ms:均方；F:F值；P:P值；A:冷箱温度；B:冷冻时间；C:切片厚度；D:空列(模型误差)；*:P<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001。
从表2可以看出：对于因素A列，既冷箱温度水平为-30℃时，切片品质最好；水平为-15℃时，切片品质最差，说明较低冷箱温度有利于切片品质的提高。对于因素B列，既冷冻时间水平为40min时，切片品质最好；水平为20min或60min时，切片品质最差，说明冷冻时间因素的最优水平在本次试验选定数值范围之内，时间过短或过长都不利于切片品质的提高。对于因素C列，既切片厚度水平为15μm时，切片品质最好；水平为6μm时，切片品质最差，说明切片厚度因素的最优水平也在本次试验选定数值范围之内，厚度过厚或过薄都不利于切片品质的提高。就因素A与B的交互影响列，既A*B交互作用下第2水平的切片质量最高，由于第2水平下4个处理中处理2的切片品质总分最高，表明冷箱温度为-30℃、冷冻时间为30min时的切片品质最好。
从计算得到的极差R值大小上看：各因素对试验切片品质影响效应的主次顺序为C>A>B>A*B>D，既切片厚度因素对试验的影响最大，其次是冷箱温度，再次是冷冻时间，接着是冷箱温度与冷冻时间的交互因素，而模型误差的影响最小。
从表3可知，冷箱温度和切片厚度对掌叶木种仁冰冻切片品质的影响均达到极显著水平(P<0.001)，冷冻时间对切片品质的影响达到显著水平(P<0.05)，而冷箱温度与冷冻时间的交互、模型误差对切片品质的影响均未达到显著水平(P>0.05)，说明切片厚度和切片厚度对切片品质的影响非常巨大，且切片厚度的影响尤其突出，其次是冷冻时间对切片品质也有较大影响，而冷箱温度与冷冻时间的交互对切片品质的影响不大，具体实验中可不考虑两因素的交互效应。另外，由于模型误差对试验的影响不显著，说明实验受模型误差的影响较小，试验模型的建立可信度较高。
因此，基于切片品质总分的优水平组合为冷箱温度(-30℃)、冷冻时间(40min)、切片厚度(15μm)，各因素对掌叶木种仁冰冻切片品质影响效应从主到次排序列为切片厚度>冷箱温度>冷冻时间>冷箱温度。
图1和图2为不同放大倍数的显微照片，分别为10×40X和10×100X，从图上可知，掌叶木种仁油体清晰可见，子叶贮藏细胞完整度较好，细胞基本无重叠，切片完整度较优且舒展不易卷曲；并且，不同放大倍数图中清晰显示出完整的子叶贮藏细胞的细胞壁(CW)和经苏丹Ⅲ染色的油体(OB)大小和轮廓。切片厚度因素是影响掌叶木种仁冰冻切片品质高低的最主要因素，尤其对细胞完整度和显微观察清晰度两个评判指标影响巨大：当切片太薄时，细胞容易破碎，从而观察不到完整的细胞，且细胞内物质(原生质体、油体等)散溢堆积会导致显微观察清晰度不高；当切片太厚时，虽然细胞基本完整，但细胞间会产生重叠从而影响显微观察的清晰度。除冷箱温度外，冷冻时间和切片厚度的最优水平均在本次拟定的数值范围内，说明这些因素设置区间合理，所得结果真实有效，指导性强。就掌叶木种仁而言，其优水平组合较一般物种特别，原因可能与油料作物种仁油体富含不易凝固的不饱和脂肪酸导致冰冻温度和冷冻时间远高于非油料作物植物类型有关，还可能与植物材料的细胞类型、大小和所选固定剂不同有关。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (2)
1.一种掌叶木种仁油体观察冰冻切片的制作方法，其特征在于，包含以下操作步骤：
(1)取气干掌叶木种子，剥去种皮，分别切取两片子叶中间部分；
(2)将步骤(1)切取所得物质进行包埋：预冷，待温度降至-30±2℃后，滴包埋剂，冷冻40±3min；
(3)进行连续切片，保证切面平整，切片厚度为15±2μm；
(4)将切好的组织在载玻片上黏附，避免组织摊片过程中皱褶，将玻片黏附有切好组织的部分浸入有水的培养皿里，抖动使组织切片离开玻片展开在水中，待展片备用；
(5)将水中展开的切片拖动至载玻片上，滴加染液，盖上盖玻片，即得掌叶木种仁油体观察冰冻切片。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于：步骤(2)所述的包埋剂为质量浓度20％的明胶。
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