CN109580306B - 一种淋巴结组织切片的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淋巴结组织切片的制作方法，所述淋巴结组织周围和/或内部附带有脂肪组织，包括以下步骤：将淋巴结组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色，在固定与脱水之间还包括以下步骤：将淋巴结组织用碱性溶液处理。本发明采用碱性溶液处理淋巴结组织，可去除脂肪细胞中脂滴，使脂肪组织与淋巴组织达到相同脱水效果，从而完整连续成片。另外，采用本发明方法处理淋巴结内部的脂肪化生区域，可避免切片时产生“空洞”现象，以获得高质量切片。

Description

一种淋巴结组织切片的制作方法

技术领域

本发明属于病理组织切片制备技术领域，尤其涉及一种淋巴结组织切片的制作方法。

背景技术

癌症患者的淋巴结病理检查是外科病理的日常工作之一。大量研究表明，淋巴结是否存在癌转移与癌症患者的预后密切相关，但目前淋巴结组织病检的误诊率却高达10％-30％，其主要原因是淋巴结切片不完整。由于外周脂肪或淋巴结内部脂肪化生区域与淋巴组织的脱水效果不同，导致淋巴结与脂肪组织脱水后硬度不一致，切片时无法完整成片。

制作淋巴结组织切片时，淋巴结外周脂肪对切片制作有较大影响，脂肪组织会阻碍试剂与淋巴结充分接触，导致淋巴结固定、脱水不充分，并且脂肪细胞中存在脂滴，也使得脂肪组织本身固定及脱水不充分。而剔除脂肪不仅耗时，并且有可能破坏淋巴结组织解剖学结构完整性或造成较小淋巴结的丢失，从而无法精准判断淋巴结数量以及其周围脂肪、脉管内有无肿瘤细胞侵犯，丢失大量有价值的临床信息。目前所报道的相关病理技术还未能很好的解决上述临床问题。

发明内容

本发明所要解决的临床问题是以上背景技术中提到的淋巴结组织制片这一病理技术难题，提供一种高质量的淋巴结组织切片制作方法，该方法能够保护淋巴结及其周围脂肪组织的完整性，保留淋巴结组织解剖学结构特点，从而获得更多有价值的临床信息。为克服上述技术难题，本发明提出的技术方案为：

一种淋巴结组织切片的制作方法，所述淋巴结组织周围和/或内部附带有脂肪组织，包括以下步骤：将淋巴结组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色，在固定与脱水之间还包括以下步骤：将淋巴结组织用碱性溶液处理。

本发明中，淋巴结周围脂肪组织没有被剔除，剔除脂肪后会破坏淋巴结组织解剖学结构完整性，使其周围脂肪组织和伴行脉管丢失，无法精准判断淋巴结周围脂肪组织及伴行脉管内有无肿瘤侵犯，损失大量临床信息，造成不必要的误诊、漏诊，不剔除淋巴结周围脂肪组织有助于保护淋巴结组织解剖学结构完整性，使病理诊断更加精准。

上述制作方法中，优选的，将淋巴结组织用碱性溶液处理包括以下步骤：将固定后的淋巴结组织放入60-70℃碱性溶液中浸泡5-20min。

上述制作方法中，优选的，所述碱性溶液由强碱、弱碱或强碱弱酸盐配制而成，所述碱性溶液中氢氧根离子的量以保证淋巴结周围和内部所附脂肪组织中脂滴全部反应为准，即保证脂滴全部与碱性溶液中的氢氧根离子反应。优选的，所述碱性溶液由弱碱或强碱弱酸盐配制而成。碱在选用时，理论上只要能提供与脂滴反应的氢氧根离子即可，但弱碱或强碱弱酸盐提供的碱性环境更加柔和，对组织伤害甚微，选择弱碱或强碱弱酸盐较合适。进一步优选的，采用过饱和的碳酸钠溶液配制碱性溶液。

上述制作方法中，更优选的，碱性溶液中，控制碱性溶液的pH值为11-14。

上述制作方法中，优选的，所述碱性溶液中含有缓冲液、保护液，所述缓冲液为磷酸缓冲盐溶液，所述保护液为聚乙二醇，所述缓冲液的浓度为0.01-4mol/L，所述保护液的浓度为0.01-4mol/L。

上述制作方法中，优选的，所述固定时，淋巴结组织在手术离体30min内进行如下操作：将直径大于5mm的淋巴结组织对剖后放入脱水盒内，直径小于1mm的淋巴结组织用擦镜纸包裹后放入脱水盒内，再将脱水盒放入中性福尔马林固定液中浸泡，浸泡时间为8-12h。直径大于5mm的淋巴结对剖意义在于可以切出淋巴结组织的最大切面，直径小于1mm的淋巴结用擦镜纸包裹意义在于防止淋巴结从脱水盒缝隙中漏出，因为脱水盒缝隙宽度是1mm。固定的作用在于防止组织变性，稳定组织细胞结构。本发明中，淋巴结组织固定时间与其他组织固定时间保持相同即可，固定时间以保证固定液充分渗入、细胞结构框架完全稳定为准，一般8-12h可达此效果。

上述制作方法中，优选的，所述脱水、透明、浸蜡时，需将经碱性溶液处理后装有淋巴结组织的脱水盒置于流水中冲洗10min，待无碱性液体残留后放入已设定好脱水、透明、浸蜡程序的组织脱水机中。另外，脂肪细胞中脂滴与碱充分反应后产物可溶于乙醇，故可将浸蜡时间延长30-60min，使脂肪细胞内部被石蜡充分填充，防止脂肪细胞塌陷。

上述制作方法中，优选的，所述包埋时，使用熔点为62℃与58℃两种规格的石蜡按(1-3)：1体积混合后反复冻融，使混合石蜡中杂质析出得到纯净石蜡，再用纯净石蜡包埋淋巴结组织。采用上述包埋操作所制备的蜡块韧性与延展性良好，不易断片或皱褶。

上述制作方法中，优选的，所述切片前，先将包埋好的蜡块充分冷冻，冷冻时间大于2h。将蜡块充分冷冻，可使石蜡、淋巴结、脂肪组织达到相同硬度。

上述制作方法中，优选的，所述切片时，应使用全新刀片，以防止钝刀片撞击造成蜡块崩裂或蜡片皱褶，旧刀片缺口会导致石蜡片出现“刀口”。

上述制作方法中，优选的，所述切片后，将切出的石蜡片放入乙醇-水溶液中摊片，再采用防脱载玻片裱片，所述乙醇-水溶液是指室温水溶液中滴加2-3滴75％的乙醇。上述摊片操作可使石蜡片延展更加充分，减少石蜡片皱褶。采用防脱载玻片裱片，防止脂肪组织染色时出现“掉片”现象。

上述制作方法中，优选的，所述染色前，先将切片放于65℃烤箱内烤片30-40min。烤片可使组织与载玻片贴合更加紧密。

本发明的原理如下：通过临床实践发现，利用“皂化反应”处理淋巴结及其周围组织，可达到优等淋巴结切片标准，并且能够使淋巴结连同其周围组织完整连续成片，有助于保留淋巴结组织解剖学结构完整性，使病理诊断更加精准。“皂化反应”处理淋巴结周围脂肪组织时利用脂肪细胞中脂滴可与碱发生反应生成可溶于水或乙醇的产物，以去除脂肪细胞中脂滴，使脂肪组织与淋巴组织达到相同脱水效果，从而完整连续成片。采用本发明方法处理后，切片时，若脂肪团中包含一枚或多枚小淋巴结则可而造成淋巴结无法切出，增加了淋巴结镜下检出率。另外，较大的淋巴结内部往往伴随着脂肪化生，若不采用本发明方法处理，会导致脂肪化生区域与淋巴组织脱水效果不同，切片时出现“空洞”现象，难以得到高质量切片。采用本发明方法中“皂化反应”处理可使脂肪化生区域与淋巴组织达到相同脱水效果，能够解决因淋巴结内部脂肪化生造成切片时出现“空洞”现象这一难题，得到高质量切片。本发明原理中“皂化反应”的主要方程式示意如下：

本发明方法适用于常规淋巴结组织及包含多枚不易扪及的小淋巴结的脂肪团。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明在固定淋巴结组织时，未剪去淋巴结周围脂肪组织，保留了淋巴结组织解剖学结构完整性，使病理诊断更加精准，为患者的治疗及预后提供了更加完善的临床信息。

2、本发明采用碱性溶液处理淋巴结组织，可去除脂肪细胞中脂滴，使脂肪组织与淋巴组织达到相同脱水效果，从而完整连续成片。另外，采用本发明方法处理淋巴结内部的脂肪化生区域，可避免切片时产生“空洞”现象，以获得高质量切片。

3、在现有淋巴结组织切片制作方法中，为了保证脱水充分，取材时需将淋巴结组织厚度控制在3mm以下，这会增加病理医师与技师工作量。采用本发明方法脱脂后，淋巴组织更易脱水，因此，对取材厚度没有太高要求，使病理医师与技师工作量更小，效率更高。

4、采用本发明方法制备淋巴结组织切片，不会影响其HE及免疫组织化学染色。

5、本发明方法技术简便、安全、高效、实用、环保，能在各层次医院病理科开展并更好的为临床病理技术服务。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例中HE染色后淋巴结及周围脂肪组织切片全景扫描图(HE，×80)。

图2为对比例中HE染色后淋巴结及周围脂肪组织切片全景扫描图(HE，×80)。

图3为图1中A区域高倍镜视野图(HE，×400)。

图4为图2中B区域高倍镜视野图(HE，×400)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一种淋巴结组织切片的制作方法，包括以下步骤：获取淋巴结组织标本，并将淋巴结组织标本固定、碱性溶液处理、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。

本实施例中，淋巴结组织没有剔除淋巴结周围脂肪组织，目的在于保留淋巴结组织解剖学结构完整性，避免淋巴结周围脂肪组织及伴行脉管丢失，有助于准确判断淋巴结及其周围脂肪组织、伴行脉管内是否存在肿瘤细胞，并观察肿瘤细胞与淋巴结及其周围脂肪组织、伴行脉管的整体关系，从而使病理诊断更加精准，为患者的治疗及预后提供更加完善的临床信息。

本实施例中，固定标本的具体步骤为，将直径大于5mm的淋巴结对剖，直径小于1mm的淋巴结用擦镜纸包裹后放入脱水盒内，将装有淋巴结组织的脱水盒置于中性福尔马林(浓度：10％)溶液中固定8h。

本实施例中，碱性溶液处理的具体步骤为，将固定好的淋巴结组织连同脱水盒一同放入装有65℃碱性溶液的玻璃烧杯中，将烧杯置于65℃的烤箱中5-10min。其中，碱性溶液包括碱、缓冲液、保护液、水。碱为碳酸钠，缓冲液为磷酸缓冲盐溶液，保护液为聚乙二醇。65℃碱性溶液的获得方式是用70℃的纯净水与碱、缓冲液、保护液在烧杯内充分混合后放入65℃烤箱内。碱性溶液中，碳酸钠为过饱和状态，碱性溶液的用量以保证淋巴结周围和内部所附脂肪组织中脂滴全部被反应为准。

本实施例中，脱水的具体步骤为，先将经碱处理后的淋巴结组织连同脱水盒一同置于流水下冲洗10min，待脱水盒内无碱性液体残留后将装有淋巴结组织的脱水盒放入已设定好脱水程序的脱水机内自动脱水，所用脱水机为樱花(SAKURA)脱水机。置于流水下冲洗的目的是防止残留的碱性液体腐蚀脱水机内槽。

本实施例中，透明、浸蜡均在脱水机内完成。透明使用二甲苯处理，时间为2h。浸蜡使用熔点为58℃液态石蜡处理，时间为3h。脱水机编程时应将浸蜡时间延长30-60min(相比于常规的浸蜡时间)，目的是使石蜡充分填充脂肪细胞，防止脂肪细胞塌陷。

本实施例中，包埋的具体步骤为，使用熔点为62℃与58℃两种规格的石蜡按1：1体积混合后反复冻融，使混合石蜡中杂质析出，得到纯净石蜡，再用纯净石蜡包埋淋巴结组织。

本实施例中，切片前，先将包埋好的蜡块充分冷冻，冷冻时间应大于2h。切片时，应使用全新刀片。切片后，将以切出的石蜡片放入乙醇-水溶液中摊片，乙醇-水溶液是指室温水溶液中滴加2-3滴75％的乙醇。并且切片后，需采用防脱载玻片裱片。

本实施例中，染色前，应将裱有石蜡组织的防脱载玻片水平放于65℃烤箱内烤片30min。

本实施例中，染色时，按常规病理技术中HE染色标准步骤进行即可。

对比例：

本对比例中淋巴结组织切片的制作方法与实施例相比，不同之处在于没有经过碱处理。

实施例与对比例HE染色切片如图1-4所示。

由图1-2可知，实施例中淋巴组织与脂肪组织脱水效果相同，淋巴结周围脂肪组织被完整切出，脂肪内脉管、神经保留完整，各种组织成分紧密相连，关系清楚。对比例中由于淋巴组织与脂肪组织脱水效果不同，淋巴结周围脂肪组织无法被完整切出，导致大量临床信息丢失。

由图3-4可知，实施例中淋巴组织与脂肪组织脱水效果相同，淋巴结周围脂肪组织被完整切出，淋巴结组织解剖学结构得以保留，可以清晰的观察肿瘤与脂肪中脉管、神经的关系，从而获得大量有价值的临床信息。对比例中由于淋巴结周围脂肪组织无法被完整切出，导致大量临床信息丢失。

Claims (6)

1.一种淋巴结组织切片的制作方法，所述淋巴结周围和内部附有脂肪组织，包括以下步骤：将淋巴结组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色，其特征在于，在固定与脱水步骤之间还包括以下步骤：将淋巴结组织用碱性溶液处理；将固定后的淋巴结组织放入60-70℃碱性溶液中浸泡5-20min；所述碱性溶液中含有缓冲液、保护液，所述缓冲液为磷酸缓冲盐溶液，所述保护液为聚乙二醇；

所述碱性溶液由弱碱或强碱弱酸盐配制而成，所述碱性溶液中氢氧根离子的量以保证淋巴结周围和内部所附脂肪组织中脂滴全部反应为准。

2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述固定时，淋巴结组织在手术离体30min内进行如下操作：将直径大于5mm的淋巴结组织对剖后放入脱水盒内，直径小于1mm的淋巴结组织用擦镜纸包裹后放入脱水盒内，再将脱水盒放入中性福尔马林固定液中浸泡，浸泡时间为8-12h。

3.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述包埋时，使用熔点为62℃与58℃两种规格的石蜡按（1-3）：1体积混合后反复冻融，使混合石蜡中的杂质析出得到纯净石蜡，再用纯净石蜡包埋淋巴结组织。

4.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述切片前，先将包埋好的蜡块充分冷冻，冷冻时间大于2h，冷冻温度为-20℃。

5.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述切片后，将切出的石蜡片放入乙醇-水溶液中摊片，再采用防脱载玻片裱片，所述乙醇-水溶液是指室温水溶液中滴加2-3滴75%的乙醇。

6.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述染色前，先将切片放于65℃烤箱内烤片30-40min。

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