CN106370491A - 环保透明脱蜡液及其制备方法和其在病理切片制备中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病理检测试剂领域，尤其涉及环保透明脱蜡液及其制备方法和其在病理切片制备中的应用。所述环保透明脱蜡液，由下述质量配比的原料制成：白油20‑60%、壬烷12‑45%、辛烷6‑35%、庚烷5—20%、蓖麻油4‑25%、戊醇3‑18%和己醇2‑9%。本发明公开的脱蜡液配方简单且搭配合理，能够充当病理切片制备所使用的透明剂和脱蜡剂，使得病理切片工艺完全脱离二甲苯试剂。

Description

环保透明脱蜡液及其制备方法和其在病理切片制备中的应用

技术领域

本发明属于病理检测试剂领域，尤其涉及环保透明脱蜡液及其制备方法和其在病理切片制备中的应用。

背景技术

据报道，中国每年新增癌症患者占到全球新增数量的20%以上，其中肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌和鼻咽癌这8种癌症死亡人数约占中国癌症总死亡人数的80%以上。癌症患者的早期诊断和早期治疗是提高患者存活率的关键。目前癌症的早期诊断主要依靠病理切片的染色结果进行判断，所以病理切片染色技术的快速高效就显的非常重要。病理切片的基本步骤包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（以及贴片、烘片）、脱蜡、染色、再脱水、再透明和封片处理。在上述步骤中，切片必须经过脱蜡后才能进行相关染色，而切片最终的质量好坏，取决于其脱蜡透明程度的高低，同时，脱蜡透明程度也关系到肿瘤判断及病理诊断准确率。所以在病理切片的制备过程中，透明、脱蜡以及染色三个步骤至关重要。

现有技术中，本领域技术人员基本上都在使用二甲苯作为透明、脱蜡用的试剂。这是由于二甲苯具有渗透力强、作用时间短，溶解石蜡量大且易挥发，而且对组织的透明效果好，价格便宜的优点。但是二甲苯也存在致命的缺点：1）对组织收缩性强，易使组织变硬变脆，导致不同的厚度，不同部位的病理组织的透明和脱蜡时间难以把握，而且如果透明过度会在脱蜡步骤引起掉片现象；2）易挥发且具有一定的毒性，对人的神经系统、呼吸系统、造血系统、免疫系统及生殖系统具有毒害作用，是致突变、致癌物质之一，长期接触会出现神经衰弱综合症及机体免疫力下降等症状，不利于工作人员的健康和环境保护，尤其是在快速石蜡制片的操作过程中，需要加热二甲苯以加速挥发，但是这不仅污染环境而且不利于操作人员的身体健康。因此，世界卫生组织已宣告二甲苯有多重毒性，并建议尽可能避免使用。

因此，本领域技术人员一直致力于寻找一种无毒的、能替代二甲苯的透明脱蜡剂，并取得了一定成果：

詹彦平等人公开了用松节油代替二甲苯作为透明剂，但是单纯的松节油透明和脱蜡效果远不及二甲苯，而且使用久了会使溶液变得黏稠【詹彦平,张云.松节油代替二甲苯透明剂制片探讨[J]. 实用医技杂志.2007, 14(16)：2256】；

王青霞等人公开了使用硬脂酸和石蜡混合液替代二甲苯作透明剂，并取得了较好的效果，但也存在如下缺陷：在透明时如温度低于66℃, 硬脂酸溶解不完全, 在石蜡中呈悬浮的细小颗粒, 这些颗粒在切片中显示为不透明模糊区,影响镜下观察；而且溶解不完全还会造成切片与载玻片之间有潜在的松散间隙,导致切片黏附不牢, 容易脱片【周 导，顾萍，严军宁，硬脂酸石蜡混合液替代二甲苯透明剂制片的探讨[J]，诊断病理学杂志，2006，13（1）：75—76,19；王青霞,安会波,刘征艳等.硬脂酸和组织脱蜡透明液替代二甲苯在病理制片中的应用[J].临床与实验病理学杂志.2009，25(04):442—443】；

冷黎丽等人公开了使用正丁醇替代二甲苯作为染色过程中的透明剂且效果不错，但是透明的时间较长【冷黎丽，正丁醇在组织切片和苏木素伊红染色中的应用体会，佳木斯医学院学报，1991，14 （4）：320】；

熊玉林等人使用由大豆油、玉米油、葵花籽油、棉籽油、芝麻油、山茶油、棕榈油和四氯化碳组成的脱蜡液替代二甲苯脱蜡取得了较好的效果，但是该技术方案仅充当脱蜡剂使用，透明作用不甚显著，因此透明步骤尚未完全脱离二甲苯的使用。【专利公开号：CN102507284A，申请日：2011-11-11】。

美国National Diagnotics公司Histo-Clear II 环保型组织脱蜡透明剂II，从柚子皮中蒸馏提取并且经过复杂的纯化和稳定工艺制成，达到了食品安全级别。具有无毒性，不挥发，无刺激性气味，可生物降解的优点，极大地降低了处理废液的成本。能够完全替代二甲苯和甲苯对病理切片进行透明和脱腊，但是由于其价格昂贵，所以严重地限制了其使用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种环保透明脱蜡液及其制备方法和其在病理切片制备中的应用，本发明公开的环保透明脱蜡液配方简单且搭配合理，能够充当病理切片制备所使用的透明剂和脱蜡剂，使得病理切片工艺完全脱离二甲苯试剂。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

设计一种环保透明脱蜡液，由下述质量百分比的原料制成：

白油20-60%、壬烷12-45%、辛烷6-35%、庚烷5—20%、蓖麻油4-25%、戊醇3-18%和己醇2-9%。

优选的，所述的环保透明脱蜡液由下述质量百分比的原料制成：白油45%，壬烷13%，辛烷14%，庚烷13%，蓖麻油5%，戊醇4%，己醇6%。

优选的，所述的环保透明脱蜡液由下述质量百分比的原料制成：白油44%，壬烷17%，辛烷11%，庚烷12%，蓖麻油6%，戊醇6%，己醇4%。

所述环保透明脱蜡液的制备方法，其特征在于步骤如下：将壬烷、辛烷、庚烷和白油混合均匀，然后加入蓖麻油搅拌均匀，最后加入己醇和戊醇混匀即可。

所述环保透明脱蜡液在病理切片的制备中充当透明剂、脱蜡剂。

具体的，一种病理切片的制备方法，包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、染色、再脱水、再透明和封片步骤，应用到所述环保透明脱蜡液的步骤如下：

1）透明步骤中，采用权利要求1-3任一所述的环保透明脱蜡液对经过无水乙醇脱水后的病理组织浸泡3-8min，然后取出病理组织浸蜡；

2）脱蜡步骤中，采用权利要求1-3任一所述的环保透明脱蜡液对病理切片脱蜡2-3次，每次时长2-5分钟；

3）染色步骤中，将脱蜡后的病理切片浸泡在体积浓度为75%的酒精中0.5-1分钟，然后取出并用水冲洗后进行染色，染色后的病理切片用水冲洗干净；

4）再脱水步骤中，将染色并冲洗后的病理切片浸泡于体积浓度为85%的酒精内0.5-1分钟；

5）再透明步骤中，采用权利要求1-3任一所述的环保透明脱蜡液对再脱水后的病理切片透明2-3次，每次时长1-2分钟即可。

石蜡是固态高级烷烃的混合物，为白色或淡黄色半透明蜡状固体，属于非晶体，但又具有明显的晶体结构，主要成分是直链烷烃、正二十二烷和正二十八烷，溶于汽油、二硫化碳、二甲苯、乙醚、苯、氯仿、四氯化碳、石脑油等非极性溶剂，不溶于水和乙醇等极性溶剂。石蜡在病理切片的制备中充当浸蜡和包埋的材料。

由于本发明在病理切片的制备中，主要充当脱去石蜡的脱蜡剂和透明剂，所以首先要保证有较大的溶蜡量。根据相似相溶原理，发明人优选出溶蜡量较大的非极性溶剂：壬烷、辛烷、庚烷和白油，四者属于烷烃类溶剂，与石蜡的性质相似，可以溶解石蜡，具有高效的脱蜡作用；同时复配具有一定极性的醇类和酯：己醇、戊醇和蓖麻油，三者具有一定的溶水性，使得整个配方在完全脱蜡的同时，对组织起到透明作用。具体作用如下：

在透明步骤中使用本申请所述的环保透明脱蜡液时，由于组织经过无水乙醇脱水，而乙醇和石蜡不能相溶，因此组织在浸蜡前，需要使用过渡溶剂将组织中的乙醇置换出来，并在后续的浸蜡步骤中被石蜡置换出来。环保透明脱蜡液具有既能和乙醇又能和石蜡相互溶解的性质，能够在乙醇和石蜡之间起到一种桥梁作用，实现置换工作。而且环保透明脱蜡液对组织的收缩副作用远远低于二甲苯，即使将环保透明脱蜡液加热至45℃（快速石蜡制片中的脱蜡步骤），也不会引起组织大量收缩和破坏组织抗原，因此能够很好地保存组织内的细胞结构，防止组织变脆而破碎。

在脱蜡步骤中使用本申请所述的环保透明脱蜡液时，其大溶蜡量的性能能够很好地实现脱蜡作业。而且现有技术中的切片脱蜡后染色前，需要使用浓度从高到低的乙醇溶液顺次浸泡，以实现下行倒水，方便后续染色，这个过程操作较为繁琐，因为需要高浓度的乙醇将不溶于水的二甲苯一步步地置换出来，而本申请所述脱蜡液由于具有一定极性，所以只需经过乙醇一次性处理即可完全置换出来，简化了操作流程。同样的，在切片染色后，现有技术需要使用浓度从低较高的乙醇溶液对切片进行脱水，然后使用二甲苯再次置换出乙醇。而使用本申请所述脱蜡液时，不仅能够将乙醇快速置换出来，而且脱蜡液本身也具有一定的脱水作用，达到降低脱水用乙醇使用次数的目的。

当然，本申请所述脱蜡液作为二甲苯的替代试剂，不含苯类等有害化学试剂，加热也不会产生对人体不利的有害气体，符合国家GB18583－2001 环保标准。

本申请所述脱蜡液在病理切片制备方案中经过一年多的试用，获得了令人满意的效果：

1）切片经环保透明脱蜡液脱蜡后进行伊红染色、特殊染色和免疫组化染色，组织细胞结构完好，核浆染色分明；能显示出相应的组织细胞结构和其他组织成分如胶原纤维、网状纤维、基底膜和中性黏液物质等；也能很好地将组织中的相应抗原特异地显示出来，没有非特异性染色。

2）采用环保透明脱蜡液代替二甲苯用于病理制片技术，制作出的组织染片不会对组织细胞结构和组织细胞内其他成分以及组织抗原造成破坏，符合临床病理诊断和研究所要求优质染色片的要求，同时也符合实验室环保的要求。

附图说明

图1为实施例1所述技术方案制得的子宫内膜的病理组织切片染色后的显微镜照片；

图2为实施例1所述技术方案制得的乳腺癌的病理组织切片染色后的显微镜照片；

图3为实施例1所述技术方案制得的肺腺癌的病理组织切片染色后的显微镜照片；

图4为实施例1所述技术方案制得的宫颈鳞状上皮的病理组织切片染色后的显微镜照片；

图5为实施例1所述技术方案制得的宫颈组织的病理组织切片染色后的显微镜照片；

图6为实施例1所述技术方案制得的子宫肌瘤的病理组织切片染色后的显微镜照片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种环保透明脱蜡液，其组分的质量配比如下：

白油45%，壬烷13%，辛烷14%，庚烷13%，蓖麻油5%，戊醇4%，己醇6%。

其制备步骤如下：将壬烷、辛烷、庚烷和白油混合均匀，然后加入蓖麻油搅拌均匀，最后加入己醇和戊醇混匀即可。

采用上述环保透明脱蜡液进行病理切片制备的方法，步骤如下：

1）取样：使用手术器材对病变区域操作并取出病变组织；

2）固定：将病变组织放入固定液中浸泡一定时间，具体时间根据病变组织的种类确定；

3）脱水：采用体积浓度由低到高的酒精溶液对病变组织进行浸泡，例如：采用70%、80%、90%、95%和无水乙醇对病变组织顺次浸泡，使得乙醇将病变组织内的水分置换出来，具体时间根据病变组织的种类确定；

4）透明：采用环保透明脱蜡液对经过无水乙醇脱水后的病理组织浸泡8min，使得透明脱蜡液将病变组织内的乙醇置换出来；

5）浸蜡：将透明好的病理组织置于融化的石蜡中一定时长，使得石蜡浸入组织内；

6）包埋：将浸蜡后的病理组织置于充满蜡液的包埋器中，待蜡液凝固后，将包埋器水冷，然后取出蜡块；

7）切片：将蜡块修整后，切成3μm厚度的组织切片，采集到载玻片上，置于烤片机上在60℃下烤片20min；

8）脱蜡：将病理切片浸泡于盛放有环保透明脱蜡液Ⅰ缸、环保透明脱蜡液Ⅱ缸、环保透明脱蜡液Ⅲ缸中各3min进行脱蜡；

9）染色：将脱蜡后的病理切片浸泡在体积浓度为75%的酒精中1分钟，然后取出并用水冲洗干净；使用苏木素染液浸泡切片10min后用水冲洗，再使用分化液浸泡切片15s后用水冲洗，最后使用返蓝液浸泡切片2min后用水冲洗；伊红染色1min，自来水冲洗；

10）再脱水：使用体积浓度为85%的酒精浸泡切片1分钟；

11）再透明：采用环保透明脱蜡液对病理切片浸泡透明3次，每次时长1min。

12）封片：向切片上滴加树胶，然后置于载玻片与盖玻片之间，完成封片作业即可。

所得病理切片置于显微镜下观察，细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色，颜色鲜艳，对比鲜明。

实施例2

一种环保透明脱蜡液，其组分的质量配比如下：

白油46%，壬烷15%，辛烷13%，庚烷11%，蓖麻油7%，戊醇5%，己醇3%。

其制备步骤如下：将壬烷、辛烷、庚烷和白油混合均匀，然后加入蓖麻油搅拌均匀，最后加入己醇和戊醇混匀即可。

采用上述环保透明脱蜡液进行病理切片制备的方法，步骤如下：

1）取样：使用手术器材对病变区域操作并取出病变组织；

2）固定：将病变组织放入固定液中浸泡一定时间，具体时间根据病变组织的种类确定；

3）脱水：采用体积浓度由低到高的酒精溶液对病变组织进行浸泡，例如：采用70%、80%、90%、95%和无水乙醇对病变组织顺次浸泡，使得乙醇将病变组织内的水分置换出来，具体时间根据病变组织的种类确定；

4）透明：采用环保透明脱蜡液对经过无水乙醇脱水后的病理组织浸泡8min，使得透明脱蜡液将病变组织内的乙醇置换出来；

5）浸蜡：将透明好的病理组织置于融化的石蜡中一定时长，使得石蜡浸入组织内；

6）包埋：将浸蜡后的病理组织置于充满蜡液的包埋器中，待蜡液凝固后，将包埋器水冷，然后取出蜡块；

7）切片：将蜡块修整后，切成5μm厚度的组织切片，采集到载玻片上，置于烤片机上在65℃下烤片30min；

8）脱蜡：将病理切片浸泡于盛放有环保透明脱蜡液Ⅰ缸、环保透明脱蜡液Ⅱ缸、环保透明脱蜡液Ⅲ缸中各3min进行脱蜡；

9）染色：将脱蜡后的病理切片浸泡在体积浓度为75%的酒精中1分钟，然后取出并用水冲洗干净；使用苏木素染液浸泡切片5-10min后用水冲洗，再使用分化液浸泡切片15s后用水冲洗，最后使用返蓝液浸泡切片2min后用水冲洗；伊红染色1min，自来水冲洗；

10）再脱水：使用体积浓度为85%的酒精浸泡切片0.5-1分钟；

11）再透明：采用环保透明脱蜡液对病理切片浸泡透明3次，每次时长2min。

12）封片：向切片上滴加树胶，然后置于载玻片与盖玻片之间，完成封片作业即可。

所得病理切片置于显微镜下观察，细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色，颜色鲜艳，对比鲜明。

实施例3

一种环保透明脱蜡液，其组分的质量配比如下：

白油44%，壬烷17%，辛烷11%，庚烷12%，蓖麻油6%，戊醇6%，己醇4%。

其制备步骤如下：将壬烷、辛烷、庚烷和白油混合均匀，然后加入蓖麻油搅拌均匀，最后加入己醇和戊醇混匀即可。

采用上述环保透明脱蜡液进行病理切片制备的方法，步骤如下：

1）取样：使用手术器材对病变区域操作并取出病变组织；

2）固定：将病变组织放入固定液中浸泡一定时间，具体时间根据病变组织的种类确定；

3）脱水：采用体积浓度由低到高的酒精溶液对病变组织进行浸泡，例如：采用70%、80%、90%、95%和无水乙醇对病变组织顺次浸泡，使得乙醇将病变组织内的水分置换出来，具体时间根据病变组织的种类确定；

4）透明：采用环保透明脱蜡液对经过无水乙醇脱水后的病理组织浸泡8min，使得透明脱蜡液将病变组织内的乙醇置换出来；

5）浸蜡：将透明好的病理组织置于融化的石蜡中一定时长，使得石蜡浸入组织内；

6）包埋：将浸蜡后的病理组织置于充满蜡液的包埋器中，待蜡液凝固后，将包埋器水冷，然后取出蜡块；

7）切片：将蜡块修整后，切成2μm厚度的组织切片，采集到载玻片上，置于烤片机上在55℃下烤片10min；

8）脱蜡：将病理切片浸泡于盛放有环保透明脱蜡液Ⅰ缸、环保透明脱蜡液Ⅱ缸、环保透明脱蜡液Ⅲ缸中各3min进行脱蜡；

9）染色：将脱蜡后的病理切片浸泡在体积浓度为75%的酒精中0.5分钟，然后取出并用水冲洗干净；使用苏木素染液浸泡切片5min后用水冲洗，再使用分化液浸泡切片15s后用水冲洗，最后使用返蓝液浸泡切片2min后用水冲洗；伊红染色1min，自来水冲洗；

10）再脱水：使用体积浓度为85%的酒精浸泡切片1分钟；

11）再透明：采用环保透明脱蜡液对病理切片浸泡透明3次，每次时长1min。

12）封片：向切片上滴加树胶，然后置于载玻片与盖玻片之间，完成封片作业即可。

所得病理切片置于显微镜下观察，细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色，颜色鲜艳，对比鲜明。

效果对比：

1）二甲苯和实施例1所述环保透明脱蜡液对病理切片的脱蜡、透明效果的比较

表1

*脱蜡时间和透明时间是在徕卡全自动染色机上试验的结果，试验时，按照实施1所述步骤，其他程序不变，仅对环保透明脱蜡液和二甲苯进行替换，即得两者的脱蜡时间和透明时间。

饱和溶蜡量测定 准确称取30 g医用切片石蜡，放入150 m L的烧杯中，放入烘箱内，将温度调到70℃，0.5h，待蜡完全溶解后取出烧杯冷却，让石蜡凝结。加入30 mL环保透明脱蜡液，在35℃的恒温水浴中放置 12h，在35℃的烘箱中过滤，将环保透明脱蜡液抽干。根据溶解前后蜡的质量差，计算饱和溶蜡量。

式中 c ——饱和溶蜡量，mg /m L；

m_加——加入蜡的质量，g；

m_剩——剩余蜡的质量，g；

v——环保透明脱蜡液体积，m L。

溶蜡速率测定 将医用切片石蜡，准确称取2 g，放入50 m L的烧杯中，放入烘箱内，将温度调到70℃，0.5h，待蜡完全溶解后取出冷却，使石蜡凝结。加入30mL环保透明脱蜡液，在25℃下，搅拌速度为 120 r/min，记录蜡完全溶解时间。

式中:S——溶蜡速率，mg / (m L·min) ；

m——加入蜡的质量，g；

V——环保透明脱蜡液体积，m L；

t——蜡完全溶解时间，min。

2）将病理组织（如甲状腺、肺、胃、肠、阑尾、肝、肾、膀胱、子宫、乳腺、前列腺、淋巴结、食道等），分别放入装有环保透明脱蜡液和二甲苯试剂的全自动封闭式脱水机中，并分别按照实施例1所述的病理切片制备方法和现有技术操作规程对病理组织进行制片，比对结果如下：

表2 环保透明脱蜡液和二甲苯性能比较

Claims (6)

1.环保透明脱蜡液，其特征在于，由下述质量百分比的原料制成：

白油20-60%、壬烷12-45%、辛烷6-35%、庚烷5—20%、蓖麻油4-25%、戊醇3-18%和己醇2-9%。

2.如权利要求1所述的环保透明脱蜡液，其特征在于，由下述质量百分比的原料制成：白油45%，壬烷13%，辛烷14%，庚烷13%，蓖麻油5%，戊醇4%，己醇6%。

3.如权利要求1所述的环保透明脱蜡液，其特征在于，由下述质量百分比的原料制成：白油44%，壬烷17%，辛烷11%，庚烷12%，蓖麻油6%，戊醇6%，己醇4%。

4.权利要求1-3所述环保透明脱蜡液的制备方法，其特征在于步骤如下：

将壬烷、辛烷、庚烷和白油混合均匀，然后加入蓖麻油搅拌均匀，最后加入己醇和戊醇混匀即可。

5.权利要求1-3所述环保透明脱蜡液在病理切片的制备中充当透明剂、脱蜡剂的应用。

6.病理切片的制备方法，包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、染色、再脱水、再透明和封片步骤，其特征在于，

1）透明步骤中，采用权利要求1-3任一所述的环保透明脱蜡液对经过无水乙醇脱水后的病理组织浸泡3-8min，然后取出病理组织浸蜡；

2）脱蜡步骤中，采用权利要求1-3任一所述的环保透明脱蜡液对病理切片脱蜡2-3次，每次时长2-5分钟；

3）染色步骤中，将脱蜡后的病理切片浸泡在体积浓度为75%的酒精中0.5-1分钟，然后取出并用水冲洗后进行染色，染色后的病理切片用水冲洗干净；

4）再脱水步骤中，将染色并冲洗后的病理切片浸泡于体积浓度为85%的酒精内0.5-1分钟；

5）再透明步骤中，采用权利要求1-3任一所述的环保透明脱蜡液对再脱水后的病理切片透明2-3次，每次时长1-2分钟即可。