CN103656091B

CN103656091B - 一种治疗糖尿病足的水溶性基质中药软膏制剂及其制备方法和用途

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Publication number: CN103656091B
Application number: CN201310680821.XA
Authority: CN
Inventors: 柳国斌; 于鑫; 李西林; 韩强
Original assignee: Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Current assignee: Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2013-12-12
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: CN103656091A

Abstract

本发明公开了一种治疗糖尿病足的水溶性基质中药软膏制剂，具体涉及由紫草、朱砂、龙血竭、黄芪、阿胶、冰片6味中药及特定的基质辅料组成的水溶性基质软膏。此外，本发明还公开了该制剂的制备工艺方法和用途。本发明的外用中药复方软膏剂可以控制糖尿病足坏疽发展、促进疮面肉芽生长、使坏疽愈合。本软膏易于洗除，尤其针对糜烂创面具有优势，对于糖尿病足的渗出液及分泌物能够起到吸收作用。本软膏具有良好的附着性与涂布性，各药物分散均匀、质量稳定、性状良好，稠度适宜，适合临床应用，可以用于治疗糖尿病足以改善临床用药情况，扩大紫朱软膏的临床应用范围，提高治疗效果。

Description

一种治疗糖尿病足的水溶性基质中药软膏制剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明属中药领域，涉及治疗糖尿病足的药物。具体涉及一种能控制糖尿病足坏疽发展、促进疮面肉芽生长、使坏疽愈合的外用中药水溶性基质软膏制剂及其制备方法和用途。

背景技术

糖尿病足（DiabeticFoot，DF）又称为糖尿病性肢端坏疽，是糖尿病主要的慢性并发症之一，也是糖尿病患者致残的主要原因。WHO对糖尿病足定义为：糖尿病患者由于合并神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和（或）深部组织的破坏。糖尿病足治疗难度大，周期长，截肢率、致死率、复发率高，给患者造成身心伤害的同时也给社会造成沉重的经济负担。随着代谢性疾病糖尿病发生率的增高，糖尿病足的发生率也在不断的增加。因此，积极治疗糖尿病足溃疡显得尤为重要，而近年来中医药对糖尿病足等糖尿病周围神经病变的治疗和研究也有了一定的进展和成绩。

中医中药在防治糖尿病足溃疡方面具有独特的疗效优势，尤其在外用药上其优势更加明显。中医外治法具有操作简单、取材容易、费用低廉等优点，并有许多丰富的剂型可供选择，可据疮面的情况灵活选用。如何从扎实的临床研究积累提炼出糖尿病足核心的中医发病机制，并从长期临床有效的治疗经验中发掘研制理想的中药外治制剂是填补目前糖尿病足中药外治的空白，提高糖尿病足外治整体水平的关键。中药复方外用制剂是通过多途径、多层次作用实现的，呈现出综合效应，与糖尿病足发生发展的复杂机理相对应，这正是中医药整体观念的优势所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种疗效确切、使用方便、无明显毒副作用的治疗糖尿病足的新型中药外用复方制剂（水溶性基质软膏剂）。具体涉及到能控制糖尿病足坏疽发展、促进疮面肉芽生长、使坏疽愈合的有效外用配方。

本发明要解决的技术问题之二是提供该制剂的制备方法。

本发明要解决的技术问题之三是提供该制剂的用途。

本发明按照SFDA颁布的《中药注册管理办法》中药、天然药物分类6的要求。通过对前期有效的组方药材研究、适宜辅料研究、制剂工艺研究、软膏性状研究等，研制一种具有清热解毒、祛腐生肌、补气益血的功效、无明显毒副作用的治疗糖尿病足的中药外用水溶性基质软膏制剂。

紫朱软膏是上海中医药大学附属曙光医院借鉴奚九一教授治疗糖尿病足的经验方“捞底膏”，进一步优化组方，形成的由朱砂、紫草、黄芪、龙血竭、阿胶、冰片等6味中药组成的中药复方。全方以朱砂、紫草为君。其中朱砂具解毒祛腐之功；紫草有凉血活血之效，两君相得益彰，共凑清热解毒、祛腐化瘀之效；黄芪味甘性微温，为补气生肌之要药，托毒退肿之上品。阿胶、龙血竭同为甘平之品，均有补血生肌之功，其中阿胶补血滋阴俱佳，龙血竭为治疗溃疡不敛之要药，三者共为臣药；佐以冰片，味辛，通透肌腠以助药效。全方六药，共凑清热解毒、祛腐生肌、补气益血之功。临床常用以羊毛脂、凡士林等为主要基质的油脂性基质软膏。但是，油脂性基质软膏不易于清洗，且与分泌物不易混合。而水溶性基质软膏易于洗除，尤其针对糜烂创面具有优势，对于糖尿病足的渗出液及分泌物能够起到吸收作用。因此，对水溶性基质的紫朱软膏进行研究，可以改善临床用药情况，扩大紫朱软膏的临床应用范围，提高治疗效果。

在本发明的一方面，提供一种治疗糖尿病足的水溶性基质中药软膏制剂，它是由有效成分与基质辅料制成，所述有效成分由以下重量份的原料药组成：朱砂7份、紫草3份、黄芪3份、龙血竭6份、阿胶5份、冰片1份；所述基质辅料包括如下重量份的组分：泊洛沙姆40734份、泊洛沙姆18824份、水70份、丙三醇26份、聚乙二醇4009份、聚乙二醇15009份、聚乙二醇40003份、对羟基苯甲酸乙酯0.06份。

在本方中朱砂采用200目水飞朱砂工业化成品；阿胶以电动粉碎机粉碎为60目粉末；紫草、冰片为有效成分热不稳定药材，采用气流粉碎方式处理；黄芪纤维性较强，先以8倍量75%乙醇提取两次，再将醇提后的药渣以6倍量水提取三次，得到醇提取和水提取浸膏；龙血竭制备成固体分散体以改善其在辅料中的分散性。

在本发明的另一方面，提供本发明所述的软膏制剂的制备工艺方法，需将上述处理好的药材与水溶性基质按照优化的工艺流程混匀，制成软膏制剂。具体通过下述步骤制备：

步骤1，龙血竭固体分散体的制备：龙血竭用适量90～95%乙醇至完全溶解，加入80～85℃熔融的泊洛沙姆188中，搅拌均匀，挥去95%乙醇，得到龙血竭的固体分散物；

步骤2，黄芪提取物用适量纯水混匀，阿胶加纯水55～60℃下烊化，形成阿胶水溶液；并将上述两种水溶液混合均匀后加入到熔融的泊洛沙姆407中，持续搅拌均匀；另在不超过40℃温度下将冰片溶解在丙三醇中加入到上述混合物中，搅拌均匀后，再加入聚乙二醇400、聚乙二醇1500及聚乙二醇4000，混合均匀后将其加入到龙血竭的固体分散物中，持续搅拌均匀冷却至室温；

步骤3，将朱砂细粉、紫草细粉加入，并加入对羟基苯甲酸乙酯，持续搅拌使其分散均匀即得。

所述朱砂采用200目水飞朱砂工业化成品；所述阿胶以电动粉碎机粉碎为60目粉末；所述紫草、冰片采用气流粉碎方式处理；所述黄芪提取物分步采用醇提取和水提取浸膏，具体采用如下方法制得：先以8倍量75%乙醇提取两次黄芪，再将醇提后的药渣以6倍量水提取三次，得到醇提取和水提取浸膏。

在本发明的另一方面，提供所述的软膏制剂在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。

本发明中药外用软膏制剂的使用，每日1次，每次1片药膏贴布或于患处均匀涂抹薄薄一层（平均每cm²药膏贴布含软膏0.15克），以半个月为一个疗程，可连续使用2个疗程，具体使用量和周期需专业临床医师根据剂型、患者的体质、创面的情况作调整。

本发明所述的外用中药软膏制剂，主要以糖尿病足为研究对象，将传统中药制剂的优势和特色与现代科学技术结合，应用新工艺、新技术、新辅料，填补目前无治疗糖尿病足专病药物的空白。在明确其中医病机基础上，开发出治疗糖尿病足的安全、有效、稳定、可控的纯中药制剂。本发明的外用中药复方软膏剂可以控制糖尿病足坏疽发展、促进疮面肉芽生长、使坏疽愈合。本软膏易于洗除，尤其针对糜烂创面具有优势，对于糖尿病足的渗出液及分泌物能够起到吸收作用。具有良好的附着性与涂布性，各药物分散均匀、质量稳定、性状良好，稠度适宜，适合临床应用，可以用于治疗糖尿病足以改善临床用药情况，扩大紫朱软膏的临床应用范围，提高治疗效果。

附图说明

图1是本发明软膏制剂的制备工艺流程图。

图2是本发明试验例1中湿性糖尿病足大鼠模型各组用药后肝肾HE结果示意图，其中，A：正常溃疡组，B：糖尿病组，F：糖尿病感染溃疡对照组，GZ0：基质对照组组，GZ1：中药小剂量组，GZ2：中药中剂量组，GZ3：中药高剂量组，E：西药对照组。

图3是本发明试验例1中中药组不同时间段血液Hg含量变化示意图。

图4是本发明试验例1中Elisa结果示意图。

图5A和图5B是本发明试验例1中Westernblot结果示意图。

图6A-图6F和图7是本发明试验例1中Real-timePCR结果示意图；其中，图6A是E-Ca扩增曲线；图6B是E-Ca溶解曲线；图6C是GAPDH扩增曲线；图6D是GAPDH溶解曲线；图6E是VEGF扩增曲线；图6F是VEGF溶解曲线。

图8和图9是本发明试验例1中免疫组化（IHC）结果示意图。

具体实施方式

以下通过制备实施例对本发明作进一步的阐述：

实施例1

本发明所涉及的水溶性基质紫朱软膏制剂组方、制备方法以及处方优化筛选方法如下所述：

1水溶性基质紫朱软膏组方药材及基质辅料

药材（以40g软膏量计）：朱砂1.4g、紫草0.6g、龙血竭1.2g、黄芪0.6g、阿胶1g、冰片0.2g。

基质辅料（以40g软膏量计）：泊洛沙姆4076.8g、泊洛沙姆1884.8g、水14g、丙三醇（甘油）5.2g、聚乙二醇（PEG）4001.8g、聚乙二醇（PEG）15001.8g、聚乙二醇（PEG）40000.6g、对羟基苯甲酸乙酯0.012g。

其中，朱砂采用200目水飞朱砂工业化成品；阿胶以电动粉碎机粉碎为60目粉末；紫草、冰片为有效成分热不稳定药材，采用气流粉碎方式处理；黄芪纤维性较强，分步采用醇提取和水提取浸膏，先以8倍量75%乙醇提取两次，再将醇提后的药渣以6倍量水提取三次，得到醇提取和水提取浸膏；龙血竭制备成固体分散体以改善其在辅料中的分散性。

泊洛沙姆无毒、无刺激性，安全性高，并且易于涂布，作为软膏的赋形剂；丙三醇为吸湿剂；聚乙二醇为水溶性软膏常用基质，辅助成型；对羟基苯甲酸乙酯为防腐剂。

2水溶性基质紫朱软膏的制备工艺与方法

2.1龙血竭固体分散体的制备：龙血竭用适量95%乙醇至完全溶解，加入80℃熔融的泊洛沙姆188中，搅拌均匀，挥去95%乙醇，得到龙血竭的固体分散物。

2.2黄芪提取物用适量纯水混匀，阿胶加纯水60℃下烊化，形成阿胶水溶液。并将两种水溶液混合均匀后加入到熔融的泊洛沙姆407中，持续搅拌均匀。另在40℃下将冰片溶解在甘油中加入到上述混合物中，搅拌均匀后，再加入PEG400、PEG1500及PEG4000，混合均匀后将其加入到龙血竭的固体分散物中，持续搅拌均匀冷却至室温；最后将朱砂细粉、紫草细粉加入，并加入对羟基苯甲酸乙酯，持续搅拌使其分散均匀即得。具体制备工艺流程图如图1所示。

3优选组分的确定

在软膏基质配比筛选的过程中，常采用正交设计法筛选。根据预试验的结果，发现影响紫朱软膏成膏性状的主要因素为纯水用量（A）、泊洛沙姆407用量（B）、聚乙二醇400用量（C）、聚乙二醇4000用量（D），对此4个因素进行正交实验的考察，每个因素设3个水平，因素水平表见表1。

表1因素水平表

以正交实验表L₉(3⁴)安排实验，制备9组紫朱软膏，并以软膏的综合评分作为评价指标，对结果进行分析。见表2。

表2正交实验表

4优选指标及评分标准

以软膏的外观性状、稳定性、延展性、稠度、pH值及显微镜检观察等为优选指标对各试验组进行考察。

4.1外观性状：从色泽均匀、质地细腻、稠度适宜、易于涂布程度及有无颗粒感等方面进行考察，每一项各占4分，满分为20分。

4.2离心稳定性满分为10分。将各组软膏分别置于离心管中，2500r·min^-1离心30min，观察有无分层或起泡现象。

4.3耐寒耐热稳定性耐寒试验与耐热试验各占5分。满分为10分。

耐寒试验：将各组软膏分别置于塑料样品杯中，4℃冰箱中放置1个月，恢复至室温，观察有无分层、结块、膏体变粗、出水等异常现象。

耐热试验：将各组软膏分别置于塑料样品杯中，40℃恒温烘箱中放置1个月，观察有无分层、变色、长毛等异常现象。

4.4延展性满分为20分。取两块10cm×10cm大小的干净玻璃板，上面一块重125g（不足加砝码补足重量）。称取室温放置24h的各组软膏1g，置于两玻璃板之间，1min后用直尺测定延展后的软膏直径，取最大直径与最小直径的平均值^[6]。

4.5稠度满分为20分。自制插度计，进行锥入度试验。小锥重2g，长40mm，使其自同一高度落下，做自由落体运动，15s后测定椎体扎入的深度^[7-8]。软膏不宜过稠或过稀，以稠度适中为宜。

4.6pH值满分为10分。分别取各组软膏5g，加纯水5mL，搅拌均匀，用pH计测定各组pH值。pH值6～8为满分^[9]，其余为零分。

4.7细腻均匀度满分为10分。取适量软膏置于载玻片上，涂成薄层，覆以盖玻片，100倍显微镜下镜检观察。

5结果分析

各实验组的评分结果见表3。

表3评分结果

正交实验结果直观分析表及方差分析表见表4和表5。

表4正交实验结果直观分析表

表5正交实验结果方差分析表

注：*P<0.05。

从实验结果可以看出：最佳处方为A₂B₂C₂D₂，并且这四个因素对软膏综合得分的影响顺序为B>A>C>D。其中，A、B因素水平变化对结果有显著影响，为主要因素（P<0.05），C、D因素对结果影响不大，为无显著性因素（P>0.05）。因此，筛选出水溶性基质紫朱软膏的最佳处方为：纯水35%，泊洛沙姆40717%，聚乙二醇4004.5%，聚乙二醇40001.5%。

6验证试验

按照筛选出的最优处方用量比例A₂B₂C₂D₂制备3个批次的软膏。3批软膏的外观性状、稳定性、延展性、稠度、pH值均无差别。外观性状、延展性、稠度适宜；稳定性良好；pH值符合要求。显微镜下镜检观察，软膏细腻均匀，无凝聚现象，并且均无大于180μm的粒子。

7结论

本发明制备的水溶性基质紫朱软膏由药物和基质两部分组成，作为软膏的赋形剂以及药物的载体，基质对软膏的质量、药物的分散有着很大的影响。水溶性基质紫朱软膏克服了油脂性基质紫朱软膏油腻不易洗除的缺点，使患者更乐于接受。且其释放较快，较耐高温，能够吸收组织渗出液，对皮肤、黏膜无刺激性，可以用于糜烂创面及腔道黏膜。并且主要基质泊洛沙姆是一种无毒、无刺激性辅料，安全性高，又易于涂布。糖尿病足后期会分泌较多脓性分泌物，水溶性基质紫朱软膏可以很好的吸收脓性渗出液，具有明显的临床优势，值得进一步研究和临床推广运用。

以下通过药效试验对本发明制剂的用途作进一步的阐述：

试验例1本发明制剂用于治疗糖尿病足大鼠实验模型

（一）材料与方法

1.材料

1.1动物：SD雄性大鼠，SPF级，体重(180±10)g，由上海中医药大学实验动物中心提供。

1.2主要试剂及药物：链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），购自Alexis公司；高脂饲料（成份：基础饲料73％，猪油20％，奶粉2％，胆固醇1％，蔗糖4％；其中基础饲料配方：大麦15%，小麦31%，玉米15%，麸皮15%,鱼粉6%，豆粕、油和盐共18%，该基础饲料购自中国人民解放军海军医学研究所）；高脂饲料的制备方法为：首先，将大麦15%，小麦31%，玉米15%，麸皮15%,鱼粉6%按比例搅拌混合均匀后，加入豆粕、油、盐混匀后加压成型制成基础饲料，然后，将基础饲料73％，猪油20％，奶粉2％，胆固醇1％，蔗糖4％按比例搅拌混合均匀后加压成型制成高脂饲料，成品为圆柱块状；质控菌株金黄色葡萄球菌-ATCC25923(Staphylococcusaureus)，质控菌株大肠埃希菌-ATCC25922（Escherichiacoli，E.coli），由曙光医院病原微生物室提供，原始来源：购自美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection)，间接来源为：上海市疾病预防控制中心国际实验工作站；外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子（商品名：贝复济，RecombinantBovineBasicFibroblastGrowthFactorForExternalUse，rb-bFGF），珠海亿胜生物制药有限公司，国药准字S10980077。安尔碘液（遗弃菌液灭活使用）；1ml注射器，无菌拭子，无菌手套。PMSF-Amresco公司，RIPA裂解液-碧云天生物工程有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒-碧云天生物工程有限公司，SDS-PAGE凝胶-上海文渊阁公司，Tris-BBI公司，甘氨酸Glycine-Amresco公司，甲醇-上海国药集团，氯化钠-上海国药集团，Tween-20-Sigma公司，SDS-PAGE上样缓冲液-碧云天生物工程有限公司，丽春红-上海国药集团，GAPDH抗体-SantaCruze公司，E-Cadherin抗体，p-P65抗体，P65抗体，p-PI3K抗体，PI3K抗体，p-JNK抗体，JNK抗体，HRP标记，山羊抗兔Ig，GHRP标记，山羊抗小鼠IgG-SantaCruze公司，CST公司CST公司CST公司CST公司CST公司CST公司SantaCruze公司SantaCruze公司Marker-Fermentas公司，NC膜-Millipore公司，3M滤纸(20*20cm)-Whatman公司，ECL化学发光试剂盒-Millipore公司，逆转录M-MLV1试剂盒(RT-PCR)-TAKARA公司，UniversalSYBRGreen-TAKARA公司，DEPC(焦碳酸乙二酯)-Sigma公司，TRIzolReagent-ambion公司，氯仿-国药集团，异丙醇-国药集团，乙醇-国药集团。30％氯化亚锡，吸收液，汞标准液，汞标准贮备液，汞标准使用液-国药集团，二甲苯-国药集团（沪试），苏木精染液-国药集团（沪试），中性树胶-国药集团（沪试），二抗中-杉金桥，各级酒精-国药集团（沪试）。

1.3主要仪器：烫伤仪SQL-5Q烫伤仪，上海欣软信息科技有限公司。电泳仪-BIO-RAD公司，转膜仪-BIO-RAD公司，酶标仪-Thermo公司，摇床(TS-8)-上海精密仪器制造公司，化学发光成像系统-上海鸥翔科学仪器有限公司，荧光定量PCR仪-AppliedBiosystems，7900HT低温高速离心机-大龙兴创实验仪器有限公司，-80℃冰箱-日本三洋公司，测汞仪（F一732型），管式电炉，石蜡切片机-Leica。

2.方法：

2.1大鼠皮肤，肝肾组织(hematoxylin-eosinstaining，HE)组织切片

苏木精—伊红染色法1、取材与固定：取下组织块(肝肾为0.5cm×0.5cm×0.5cm，皮肤组织为0.5cm×0.5cm全层)，10％福尔马林固定。2、脱水。3、浸蜡包埋。4、切片与贴片（厚度：8微米）。5、脱蜡染色：脱蜡2min×3次；酒精脱水，100%酒精2min×2次，95%酒精2min×1次；水冲洗；染色苏木精1-2min，水冲洗至无蓝色伊红20s，水冲洗；脱水，95%酒精2min×1次，100%酒精2min×2次；透明二甲苯，2min×3；封片，中性树胶80uL，盖玻片用24X50mm。

光镜观察：取100倍和200倍视野。

2.2ELISA检测

原理：它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。

操作方法：取大鼠血液后3000转/分钟，离心20min，吸取上层血清，-20℃保存。IL-6、TNF-ａ、IL-1β、AGES、bFGF、hCRP、NF、NO，ELISA检测试剂盒测定（具体操作见相应说明书），大体流程如下：

1）实验前，将试剂盒拿出室温平衡30min。

2）在空白孔，标准孔和样品孔分别加入50μl样本稀释液，然后在空白孔，标准孔和样品孔分别加入50μl样本稀释液，标准品和样本。

3）每孔加入50μlBiotin-Conjugate。

4）室温200rpm孵育2h。

5）用洗液4次。

6）每孔加入100μlStreptavidin-HRP。

7）室温200rpm孵育1h。

8）用洗液4次。

9）每孔加入100μlTMBSubstrateSolution。

10）避光室温200rpm孵育10min。

11）每孔加入100μl终止液。

12）在450nm处测吸光值（OD值）。

13）计算：根据标准物的浓度与OD值计算标准曲线直线回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算样品浓度，再乘以稀释倍数即为样品的试剂浓度。

2.3实时聚合酶链反应（Real-timePCR）

原理：Real-TimePCR技术，又称实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量分析的方法。

内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

操作方法：取大鼠愈合后皮肤组织，测定其VEGF及Ecadherin的含量。

2.3.1TotalRNA的提取和鉴定

1）向样品管中加入1mlTrizol。

2）组织匀浆机60Hz研磨90s，直至裂解液中午明显小颗粒。

3）室温静置5min。

4）加入1/5体积氯仿（200μl），剧烈振荡15s，待溶液充分乳化无分相现象，室温静置5min。

5）12,000g4℃离心15min。

6）小心取出离心管，吸取上清液转移至另一无RNA酶离心管中。

7）加入等体积的异丙醇（500μl），上下颠倒充分混匀后，室温静置10min。

8）12,000g4℃离心10min，弃去上清，低速离心5s，弃去残留异丙醇。

9）75％乙醇lml洗涤，12,000g4℃离心5min，小心弃去乙醇。

10）室温干燥2-3min，加入20μL灭菌DEPC水溶解沉淀，用手指尖轻弹EP管底部至完全溶解。

2.3.2cDNA合成

1)PCR用离心管中配制混合液，全量12μL，冰上操作。

表6体系

2)65℃保温5min后冰上冷却2min。

3)离心数秒后，在PCR管中配制反转录反应液。

表7反转录反应体系

4)42℃保温1h。

5)70℃保温5min后冰上冷却，得到的cDNA可直接用于2nd-StrandcDNA的合成或PCR扩增，-20℃保存。PCR扩增时cDNA的推荐最大使用量为1μL。

2.3.3PCR反应

1)设计的引物序列及分析条件如表8和表9：

2)PCR管中配制PCR反应混合液，冰上操作。

表8real-timePCR反应体系

3)混匀后分成3份，每个样品做3个重复对照。

4)上机扩增检测。

引物序列：

表9

2.4蛋白质印迹（Western-Blot）

原理：WesternBlot即蛋白质印迹法。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

操作方法：取愈合后大鼠皮肤组织，测定其E-Cadherin、p-P65、P65、p-PI3K、PI3K、p-JNK、JNK含量。步骤如下：

2.4.1.蛋白质抽提和浓度测定

2.4.1.1蛋白质抽提

（1）将组织用冰PBS洗涤3次。

（2）取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

（3）每10mg组织加入100μl裂解液，于4℃匀浆器震荡2分钟裂解组织。

（4）充分裂解后，10000g离心5分钟，取上清。

2.4.1.2蛋白质定量

（1）根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

（2）加适当体积样品到1.5ml离心管中，用0.9%NaCl溶液补足至100μl。

（3）各孔加入BCA工作液1ml，37℃放置30分钟。

（4）测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

2.4.2.SDS-PAGE电泳

（1）准备样品液：样品与5×上样缓冲液4:1混合，煮沸5分钟。

（2）将准备好的样品和蛋白质marker，分别上样。

（3）电泳：使用BioRad电泳装置，样品首先在120V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端。然后160V恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部。

2.4.3.蛋白质转移

（1）取出凝胶，去除所有浓缩胶。将凝胶浸入转移缓冲液中5分钟。

（2）准备膜：预先将NC膜先浸入转移缓冲液中平衡5分钟。

（3）按照泡沫、滤纸、凝胶、转印膜、滤纸、泡沫的顺序组装转移夹层。

（4）将转移夹放入转移槽中，确保转移夹的凝胶侧面向阴极（-）而膜侧面向阳极（+），向转移槽中加入适量缓冲液，确保将转移夹完全浸没。

（5）转膜装置置于冰水中，打开电源400mA转印2小时。

（6）转移完成后，从槽中取出转移夹，用镊子小心打开转移叠层，在双蒸水中漂洗膜。

2.4.4.蛋白质显像

（1）将膜置于反应盒中（印迹蛋白的一面朝上）

（2）加0.5ml丽春红染色30秒，观察转印效果。

（3）去除染液，双蒸水洗膜三次，每次5分钟。

2.4.5.免疫检测

（1）封闭：新鲜配制封闭液：在TBST中加入脱脂奶粉至终浓度为5%（w/v），封闭时，将膜浸入到封闭液中，室温下振荡1h。

（2）加入稀释好的一抗抗体，4℃过夜。

表10

抗体名称	种属来源	使用浓度	对应二抗
				E-Cadherin抗体	兔	1:500	山羊抗兔
p-P65抗体	兔	1:1000	山羊抗兔
				P65抗体	兔	1:1000	山羊抗兔
p-PI3K抗体	兔	1:1000	山羊抗兔
				PI3K抗体	兔	1:1000	山羊抗兔
p-JNK抗体	兔	1:1000	山羊抗兔
				JNK抗体	兔	1:1000	山羊抗兔
GAPDH抗体	小鼠	1:1000	山羊抗小鼠

（3）TBST洗膜3次（每次5分钟）。

（4）加入稀释好的二抗抗体（1:5000），室温1小时振荡孵育。

（5）TBST洗膜3次（每次5分钟）。

2.4.6.化学发光检测

（1）洗好膜以后，取出ECL发光试剂，取A液和B液各1ml混合。

（2）将膜放入曝光仪器中，滴加发光液，曝光三次，每次5min，选择三次曝光的重叠值。

2.5汞（Hg）冷原子吸收法

原理：汞蒸气对波长253.7nm的紫外光具有强烈的吸收作用，试样经适当处理后，将各种形态的汞转变成汞离子，用氯化亚锡将汞离子还原成元素汞，再用测汞仪进行测定，汞浓度与吸收值成正比。

仪器与试剂：测汞仪（F一732型），管式电炉，30％氯化亚锡，吸收液，汞标准液，汞标准贮备液，汞标准使用液。

操作方法：

2.5.1.样品处理：准确称取处理好样本置于石英舟中（上盖一小块滤纸），将石英舟放入管式电炉的石英管里，石英管的一端与氧气瓶连接，另一端与盛有20ml吸收液的吸收管连接。将炉温控制在750±50℃通氧气（流速2L/min），分段燃烧3min，样品中的汞富集于吸收液中，备作测定。

2.5.2.测定：准确吸取一定体积吸收液（燃烧后的）于汞反应瓶中，加入2m130％氯化亚锡溶液后立即塞紧瓶塞，开动循环泵，读取最大吸收值。

2.6免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)

原理：免疫组化即免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。同时借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

操作方法：

（1）脱蜡

在60℃烤箱内30min。

趁热放入二甲苯I---10min。

（2）水化

100%酒精I---5min，II---5min；

95%酒精I---5min，II---5min；

85%酒精---3min；

75%酒精---2min；

水洗---1min。

（3）除去内源性的过氧化氢酶

立即投入3%H₂O₂甲醇（30%H₂O₂（4度避光）1ml+甲醇9ml，现配现用）浸泡10min。水洗3min×2次。

（4）抗原修复

高压锅修复：立即投入柠檬酸缓冲液，等到沸腾，浮子升起，计时2min，自然冷却至室温。

（5）血清封闭

PBS--5min/次，洗2次，擦干外围，免疫组化笔勾圈，风干15s。

滴加5%BSA封闭液，然后放入37℃温箱中半小时。甩去多余液体，不洗。

（6）加一抗

用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加1:100稀释的一抗，湿盒中于4°C冰箱中保存过夜。

（7）加二抗

恢复到室温后，PBS洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加二抗，湿盒中置于37°C温箱中0.5h。

（8）加DAB显色剂

甩干组织周围的PBS后立即滴加显色剂，室温孵育5min，水稍洗终止反应，泡于水中。

（9）苏木素复染

滴加Mayer’s苏木素复染3～10min左右，蒸馏水浸泡数分钟后浸入饱和Na2HPO4溶液中2min，待标本颜色变蓝后泡于水中。

（10）脱水透明

依次将载玻片放入75%酒精-85%酒精-95%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。

（11）封片

用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。

（12）统计分析

利用OPTPro软件拍照，分析阳性率。

正常溃疡组普通饲料喂养；糖尿病溃疡组及感染对照组高脂饲料饲养8周，空腹24小时后，腹腔注射1.5%链脲佐菌素35mg·kg^-1，3天后尾静脉取血测量血糖>16.7mmol·L^-1，制成糖尿病模型；糖尿病溃疡组及感染对照组血糖>16.7mmol·L^-1一周后3%戊巴比妥钠2ml·Kg^-1剂量腹腔注射麻醉下烫伤仪烫伤（1000g，90℃，10S），三天后，糖尿病溃疡组，感染对照组，感染治疗组分别腹腔注射0.1ml的PBS液，0.1ml的10⁸ufc·ml^-1金黄色葡萄球菌或（与）大肠埃希菌的等量混合液。48小时后各组无菌拭子取病原微生物培养及药敏检验，取皮肤组织10%甲醛固定后备检。各组根据药物不同每天换药一次。

（二）结果

1.HE结果

湿性糖尿病足大鼠模型各组用药后肝肾HE结果如图2所示，A：正常溃疡组，B：糖尿病组，F：糖尿病感染溃疡对照组，GZ0：基质对照组组，GZ1：中药小剂量组，GZ2：中药中剂量组，GZ3：中药高剂量组，E：西药对照组。由图2可见：各组肾小球结构完整，肾小管形态正常，肝门结构正常，肝细胞形态正常，均未见异常改变。未发现汞中毒的征象。

2.中药组不同时间段血液Hg含量变化

如图3所示，说明：中药各组血液中Hg含量测定结果显示，大剂量组的含量较中剂量组、小剂量组较高。高剂量组与中剂量组第3天至第10天血液Hg含量呈上升趋势，第10天至处死前呈下降趋势。低剂量组第3天至第10天血液Hg含量呈下降趋势，第10天至处死前呈上升趋势。处死前各组血液Hg含量比较：中剂量组<低剂量组<高剂量组。高剂量组与中剂量组第10天至处死前各组Hg含量降低可能与大鼠机体适应后，药物代谢加速有关。低剂量组Hg含量变化趋势可能与前期创面愈合较快减少Hg吸收，而愈合时间较长从而导致血液Hg含量总量较大有关。

3.Elisa结果

如图4所示，说明：中药各组与模型对照组比较均能血清中NO，HCRP，NF的含量，其中中剂量组降低的最为明显。

4.Westernblot结果

如图5A和图5B所示，说明：各组非磷酸化PI3K，JNK，P65，Ecadherin无差异（P>0.05），说明各组基线相同，具有可比性。各中药组与模型组比较，除高剂量组P-JNK无明显差异外，P-PI3K，P-JNK，P-P65均具有差异（P<0.05）。中药组间比较显示，中剂量组PI3K，JNK，P65蛋白磷酸化水平较高。

5.Real-timePCR结果

如图6A-图6F所示，说明：相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性。

如图7所示，说明：中药组各组VEGFmRNA，EcadherinmRNA表达与模型对照组比较具有差异性（P<0.05），其中GZ1中药低剂量组VEGF表达水平较高；GZ3中药高剂量组Ecadherin表达水平较高。

6.免疫组化（IHC）结果

如图8和图9所示，说明：以上结果显示，棕色为阳性表达，VEGF标记，GZ0，GZ1和GZ3组表达很低，几乎不表达，GZ2组略有表达。CD34抗体标记，GZ0和GZ0组表达很低，几乎没有阳性，与GZ0比较，GZ1和GZ3表达升高，GZ2组表达最高。

（三）结论

综合上述指标，通过湿性（混合感染）糖尿病足大鼠模型的药效学验证，本发明中药组能够降低局部的炎症反应，提高局部抗炎因子的表达，从而促进创面的愈合，可见本发明制剂（紫朱软膏）治疗糖尿病足疗效确切，通过综合比较得出中剂量组的紫朱软膏药物疗效较好，这与前期的药物优化筛选结果一致。

Claims

1.一种治疗糖尿病足的水溶性基质中药软膏制剂，它是由有效成分与基质辅料制成，其特征在于，所述有效成分由以下重量份的原料药组成：朱砂7份、紫草3份、黄芪3份、龙血竭6份、阿胶5份、冰片1份；所述基质辅料包括如下重量份的组分：泊洛沙姆407 34份、泊洛沙姆188 24份、水70份、丙三醇26份、聚乙二醇400 9份、聚乙二醇1500 9份、聚乙二醇4000 3份、对羟基苯甲酸乙酯0.06份。

2.按权利要求1所述的水溶性基质中药软膏制剂的制备工艺方法，其特征在于，包括下述步骤：

步骤1，龙血竭固体分散体的制备：龙血竭用适量90～95％乙醇至完全溶解，加入80～85℃熔融的泊洛沙姆188中，搅拌均匀，挥去95％乙醇，得到龙血竭的固体分散物；

步骤3，将朱砂细粉、紫草细粉加入，并加入对羟基苯甲酸乙酯，持续搅拌使其分散均匀即得；

所述朱砂采用200目水飞朱砂工业化成品；所述阿胶以电动粉碎机粉碎为60目粉末；所述紫草、冰片采用气流粉碎方式处理；所述黄芪提取物分步采用醇提取和水提取浸膏，具体采用如下方法制得：先以8倍量75％乙醇提取两次黄芪，再将醇提后的药渣以6倍量水提取三次，得到醇提取和水提取浸膏。

3.按权利要求1所述的制剂在制备治疗糖尿病足的药物中的应用。