CN108478637A - 白点鲑饲养用中药组合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种白点鲑饲养用中药组合物及使用方法，该技术方案首先对天然药物进行了初筛，而后基于药物协同作用分析了不同配方的免疫促进效果，在此基础上，以受试白点鲑血液中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮以及肠道淀粉酶、肠道脂肪酶、蛋白酶为依据确定了一种针对白点鲑抗氧化能力和非特异性免疫能力具有确切促进效果的药物组合物。在此基础上，本发明考察了药物用量及用药方式对疗效的影响，实验结果表明，以0.5％的添加量与常规饲料混配，采用一般投喂方式持续饲喂14d，各项指标达到最高水平，对白点鲑的免疫促进效果最佳。

Description

白点鲑饲养用中药组合物及使用方法
技术领域
本发明涉及渔业养殖技术领域，进一步涉及饲料的改良及功能性饲料的开发，具体涉及白点鲑饲养用中药组合物及使用方法。
背景技术
白点鲑(Salvelinus leucomaenisf pipiuvius)，隶属于鲑科、红点鲑属，原产于日本河川、溪流中的冷水性鱼类，鱼体呈纺锤型，体被圆鳞且很小，体色为青灰色，因身体背、侧部有白色斑点而得名，故曾名白斑红点鲑，引进国内定名为白点鲑。
在白点鲑的养殖技术中，病害是影响养殖效果的重要问题，为了降低病害发生率、缓解病害程度，现有技术多通过施用化药的方式进行防治。随着水产养殖规模的不断扩大，水产药物的使用量也越来越多，造成对环境的污染持续加重。在养殖过程中，抗生素，重金属等大量的化学合成药剂的使用量大大增加，长时间使用极大地增加了病原微生物的抗药性，并会在动物体内残留，人类使用后对健康造成潜在的危害。此外，目前渔业养殖中化药的施用侧重于针对具体病原，而缺乏对动物机体本身的调节，因此大量使用化药对鱼类增重也存在负面影响。在这种情况下，如何在避免使用化药的同时保证鱼类抗病能力成为了亟待解决的技术问题。
以中草药为代表的天然药物具有无污染、无抗药性、副作用低等优势，有望成为鱼类疾病防治的理想替代品。然而，由于中草药对具体病原普遍不具有直接杀灭作用，因此在用药方法层面更应当侧重对鱼类免疫能力的调节作用，这就涉及到对白点鲑这一具体物种的免疫特性研究，由于生物体免疫机制复杂且多样，再加之中草药种类繁多、协同作用复杂，因此很难在现有技术中获得中草药用药的策略指引。具体来看，尽管现有技术中有研究者尝试开发以天然植物为主要成分的鱼类药物，但一方面缺乏针对白点鲑这一具体品种的免疫调节剂，而且，在免疫促进效果、尤其是非特异性免疫促进效果方面仍有待提升。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供白点鲑饲养用中药组合物及使用方法，以解决现有技术中缺乏一种能有效促进白点鲑抗氧化及非特异性免疫能力的天然药物组合物的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是确定上述组合物用于白点鲑饲养的用药策略。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种白点鲑饲养用中药组合物，包括以下重量份的成分：大黄16～20份，黄芪12～10份，连翘8～10份，黄苓2～4份，丹皮2～4份，抱树莲1～2份，扁豆衣1～2份，雌黄0.8～1.2份，古羊藤0.6～0.8份，过岗龙0.6～0.8份。
作为优选，该组合物还包括1～2重量份的黄蜀葵。
作为优选，该组合物还包括0.5～0.7重量份的寒水石。
作为优选，该组合物还包括2～6重量份的积雪草。
作为优选，该组合物还包括2～4重量份的苦楝皮。
作为优选，该组合物由以下重量份的成分组成：大黄18份，黄芪11份，连翘9份，黄苓3份，丹皮3份，抱树莲1.5份，扁豆衣1.5份，雌黄1份，古羊藤0.7份，过岗龙0.7份。
作为优选，该组合物由以下重量份的成分组成：大黄18份，黄芪11份，连翘9份，黄苓3份，丹皮3份，抱树莲1.5份，扁豆衣1.5份，雌黄1份，古羊藤0.7份，过岗龙0.7份，黄蜀葵1.5份，寒水石0.6份，积雪草4份，苦楝皮3份。
同时，本发明提供了应用上述中药组合物饲养白点鲑的方法，该方法是将所述中药组合物以0.5％(w/w)的比例添加至鱼饲料中，混匀，而后投喂白点鲑，持续7～28d。
作为优选，所述持续时间为14d。
作为优选，利用以上方法饲养白点鲑后，对实验鱼抽血、提取其肠道组织，而后分别测定SOD、CAT、MDA、T-AOC、AKP、ACP、NO、溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力。
作为优选，所述抽血、提取肠道组织，可以是通过以下方法实施的：分别在投喂后的0、7、14、21、28d采样，每次分别采5尾，从基地取回来的鱼立即进行解剖抽血提取所需要的组织，将每条鱼称重之后量体长记录下来，然后立刻进行抽血，抽血时注射器吸取少量肝素然后从鱼尾柄腹侧处抽血，将抽出的血放入离心管中于4℃低温离心机中离心10min取上清放入干净的离心管中于-80℃箱中保存。抽血之后进行解剖，取肠道于离心管中装入封口塑料袋于-80℃冰箱中保存。组织测定前用高通量组织研磨器研磨10min然后用低温高速离心机4℃离心10min取上清液进行各组织的测定。
作为优选，所述鱼饲料是商品名为艾乐牌的市售鱼饲料。
在以上技术方案中，所述大黄、黄芪、连翘、黄苓、丹皮、抱树莲、扁豆衣、雌黄、古羊藤、过岗龙、黄蜀葵、寒水石、积雪草、苦楝皮等成分均为天然药物，其各自的限定意义应当以天然药物领域的一般技术认知作为解释。
本发明所述的组合物可以是将配方量的成分分别粉碎后混合所得的混合物，其粉碎方式可以依照本领域公知常识实施，包括但不限于通过药用粉碎机、均质机等装置实施。
本发明提供了一种白点鲑饲养用中药组合物及使用方法，该技术方案以提升白点鲑非特异性免疫能力为目的研究了多种天然药物对白点鲑生理特性的影响。具体来看，本发明首先对天然药物进行了初筛，而后基于药物协同作用分析了不同配方的免疫促进效果，在此基础上，以受试白点鲑血液中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、一氧化氮(NO)以及肠道淀粉酶(AMS)、肠道脂肪酶(LPS)、蛋白酶为依据确定了一种针对白点鲑抗氧化能力和非特异性免疫能力具有确切促进效果的药物组合物。
在此基础上，本发明考察了药物用量及用药方式对疗效的影响，实验结果表明，以0.5％的添加量与常规饲料混配，采用一般投喂方式持续饲喂14d，各项指标达到最高水平，对白点鲑的免疫促进效果最佳。基于以上有益的发现，本发明确定了该药物组合物的使用方法，为其商品化应用奠定了良好的基础。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
一种白点鲑饲养用中药组合物，该组合物由以下重量份的成分组成：大黄18份，黄芪11份，连翘9份，黄苓3份，丹皮3份，抱树莲1.5份，扁豆衣1.5份，雌黄1份，古羊藤0.7份，过岗龙0.7份，黄蜀葵1.5份，寒水石0.6份，积雪草4份，苦楝皮3份。
同时，本实施例提供了应用上述中药组合物饲养白点鲑的方法，该方法是将所述中药组合物以0.5％(w/w)的比例添加至鱼饲料中，混匀，而后投喂白点鲑，持续14d。其中，所述鱼饲料为商品名为“艾乐牌”的市售鱼饲料。
实施例2
一种白点鲑饲养用中药组合物，该组合物由以下重量份的成分组成：大黄18份，黄芪11份，连翘9份，黄苓3份，丹皮3份，抱树莲1.5份，扁豆衣1.5份，雌黄1份，古羊藤0.7份，过岗龙0.7份。
实施例3
一种白点鲑饲养用中药组合物，该组合物由以下重量份的成分组成：大黄16份，黄芪12份，连翘8份，黄苓2份，丹皮2份，抱树莲1份，扁豆衣1份，雌黄0.8份，古羊藤0.6份，过岗龙0.6份，黄蜀葵1份，寒水石0.5份，积雪草2份，苦楝皮2份。
实施例4
一种白点鲑饲养用中药组合物，该组合物由以下重量份的成分组成：大黄20份，黄芪10份，连翘10份，黄苓4份，丹皮4份，抱树莲2份，扁豆衣2份，雌黄1.2份，古羊藤0.8份，过岗龙0.8份，黄蜀葵2份，寒水石0.7份，积雪草6份，苦楝皮4份。
实施例5
本实施例用于考察以上实施例1中药组合物及其使用方法的效果。
1、材料与方法
1.1试验器材
1.1.1试验鱼
试验鱼取自天津市丰沛水产养殖有限公司，2016年5月21日开始从公司基地取样，平均体重为白点鲑224.14±26.73g。
1.1.2试验器材与仪器
电热恒温水浴锅(DK-98-IIA,天津市泰斯特仪器有限公司)；
低温高速离心机：(eppendorf 5804R型)；
紫外分光光度计：(Thermo Spectronic UVmini-1240型)；
双频数控超声波清洗器：(KQ3200VDE型)；
电热恒温鼓风干燥箱(YH-2S，天津市中环实验电炉有限公司)；
优普超纯水制造系统(UPR-I-10T,四川优普超纯科技有限公司)；
高通量组织研磨器(SCIENTZ-192,宁波新芝兰生物股份有限公司)；；
1.1.3试验试剂
此次实验所用的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；
95％乙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20160611)；
氯化钠(天津市风船化学试剂有限公司，批号20160120)；
双蒸水取自天津农学院水产学院优普超纯水制造系统。
1.2试验方法
1.2.1试验鱼组织样品的提取
采用实施例1所提供的组合物及使用方法投喂白点鲑。分别在投喂后的0、7、14、21、28d采样，每次分别采5尾，从基地取回来的鱼立即进行解剖抽血提取所需要的组织，将每条鱼称重之后量体长记录下来，然后立刻进行抽血，抽血时注射器吸取少量肝素然后从鱼尾柄腹侧处抽血，将抽出的血放入离心管中于4℃低温离心机中离心10min取上清放入干净的离心管中于-80℃箱中保存。抽血之后进行解剖，取肠道于离心管中装入封口塑料袋于-80℃冰箱中保存。组织测定前用高通量组织研磨器研磨10min然后用低温高速离心机4℃离心10min取上清液进行各组织的测定。
1.2.2样品的测定
本试验SOD、CAT、MDA、T-AOC、AKP、ACP、NO、溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶测定均采用南京建成生物工程技术研究所提供的试剂盒进行测定。
1.2.2.1 SOD活性测定
分别往4个离心管中加入1ml试剂一应用液，其中三个管是一条鱼的三个平行，另外一个管是对照组。再往其中三个管中加入血浆样品各10ml，对照管加入10ml双蒸水，然后按顺序分别往四个管中个加入试剂二、试剂三、试剂四应用液0.1ml。立即用漩涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴锅水浴40分钟,然后各加入显色剂2ml。混匀室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，双蒸水调零，比色，记录比色结果。
1.2.2.2 CAT活性测定
分别取4个离心管，其中三个加入0.1ml血浆样品作为测定管，其中一个什么都不加作为对照管，接着将在37℃水浴锅中预热的试剂一，分别加入四个离心管中各1ml，然后将在37℃水浴锅中预热试剂二，分别加入四个离心管中各0.1ml。混匀后于37℃水浴锅中准确反应一分钟，然后按顺序各入试剂三1.0ml，试剂四0.1ml。最后对照管中加入0.1ml血浆样品，滴定管中则什么都不加。立即混匀，波长405nm，光径0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。记录结果。
1.2.2.3 MDA含量测定
分别取6支离心管其中三支为测定管另外三支为空白管、标准管、对照管。空白管中加入0.1ml无水乙醇，标准管中加入0.1ml10nm/ml标准品，测定管和对照管中各加入0.1ml测定样品，接着6支管中都加入0.1ml试剂一。混匀(摇动几下试管架)，然后在全部加入3ml试剂二应用液。再往空白管、标准管、测定管中各加入1ml试剂三应用液。对照管中加入1ml50％冰醋酸。漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴04分钟，取出流水冷却，然后3500～4000转/分，离心10分钟，取上清，532nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。
1.2.2.4 T-AOC活性测定
分别取4个离心管，各加入1试剂一，接着其中三个离心管中加入血浆样品0.1ml作为测定管，另一个什么都不加作为对照管。然后按顺序各加入试剂二应用液2ml、试剂三应用液0.5ml。充分混匀置于37℃水浴锅中水浴30分钟，然后各加入0.1ml试剂四。最后对照管中加入0.1ml血浆样品，滴定管中什么都不加。混匀，放置10分钟，波长520nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。记录结果
1.2.2.5 AKP活性测定
分别取5个离心管，其中一个加入0.05ml双蒸水作为空白管，另一个加入0.05ml0.1mg/ml酚标准应用液作为标准管，剩下三个各加入血清样品0.05ml作为测定管。按顺序向五个管中各加入0.5ml缓冲液、0.5ml基质液。充分混匀于37℃水浴锅中水浴15分钟，在往每个管中加入1.5ml显色剂立即混匀，波长520nm，光径0.5cm，空白管调零，测定各管吸光度值。记录结果
1.2.2.6 ACP活性测定
分别取5个离心管，其中一个加入0.05ml双蒸水作为空白管，另一个加入0.05ml0.1mg/ml酚标准应用液作为标准管，剩下三个各加入血浆样品0.05ml作为测定管。然后按顺序向五个管中各加入0.5ml缓冲液、0.5ml基质液。充分混匀于37℃水浴锅中水浴30分钟，在按顺序向五个管中各加入1.0ml碱液、1.5ml显色剂。立即混匀，室温静置10分钟，于520nm，1cm光径，空白管调零，测各管吸光度值
1.2.2.7 NO活性测定
分别取5个离心管，其中一个加入0.1ml双蒸水作为空白管，另一个加入100μmol/L标准品应用液0.1ml作为标准管，剩下各三个加入0.1ml血浆样品，在分别向五个离心管中加入0.4ml混合试剂。混匀在37℃水浴锅中准确水浴60分钟然后按顺序分别在五个管中加入0.2ml试剂三、0.1ml试剂四。充分漩涡混匀30秒，3500～4000转/分，离心10分钟，取上清各0.5ml显色，在各加入0.6ml显色剂，测定各管吸光度值。记录结果。
1.2.2.8溶菌酶活性测定
一、将配制好的应用菌液，标准应用液及所需检测的样品均放入37℃水浴箱中预温5分钟以上。使菌液，标准液及检测液样本的温度达到37℃。
二、将可见分光光度计于530nm处，1cm光径比色皿，以双蒸水调透光度100％。
三、往相应编号的试管中加入0.2ml待测样本，取2ml应用菌液迅速冲入管中，立即混匀并计时。
四、迅速倒入比色皿中在可见分光光度计530nm处比浊，5秒时读取透光度T0，比色皿不要取出，在2分5秒时读取透光度值T2；
五、求出2次透光度的差值(Δ＝T2-T0)。
1.2.2.9蛋白酶活性测定
分别取4个离心管，其中三个加入1ml适当稀释的酶溶液作为测定管，另一个什么都加作为对照管。然后向对照管中加入1ml去离子水，将三只管放在37℃水浴预热3到5分钟。然后向四只管中加入预热过的0.5酪素3ml，然后离子去除沉淀，取上清于另四个管中1ml，分别加入0.55M碳酸钠5ml，在加入1m福利试剂。37℃水浴显色15分钟，680nm波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。记录结果。
1.2.2.10脂肪酶活性测定
一、将分光光度计于420nm处，1cm光径玻璃比色皿，用Tris缓冲液调零；
二、将底物缓冲液37℃预温5分钟以上；
三、往相应编号的试管中加入25μl 20％组织匀浆上清液，再加入试剂四25μl，吸取已预温好的底物缓冲液2ml冲入试管中，快速混匀，并计时；
四、迅速倒入比色皿中，在分光光度计420nm处比浊，30秒时读取吸光度值A1；
五、将此比色液倒入原试管中置37℃准确水浴10分钟在迅速倒入比色皿中，10分30秒时读取吸光度A2。
六、求出2次吸光度值(Δ＝A1-A2)。
1.2.2.11淀粉酶活性测定
分别4个离心管分别加入37℃预热五分钟底物缓冲液0.5ml，其中三个在加入0.1ml待测样本作为测定管，另一个什么都不加作为空白管。混匀，37℃水浴，准确反应7.5分钟。再分别在四个管中加入0.5ml碘应用液，接着三个测定管中加入3.0ml双蒸水，空白管中加入3.1ml双蒸水。混匀，660nm波长，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度。记录数据。
1.2.3数据处理与统计分析
所得数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示。所有数据均用Excel 2003及SPSS18.0进行分析处理。利用Excel软件制作各指标的标准曲线，并计算出各样品中对应指标的活力含量。利用SPSS软件进行方差分析，P值取0.05水平。
2、实验结果
2.1中药组合物对白点鲑抗氧化指标的影响
中药组合物对白点鲑的抗氧化指标影响见表1，T-AOC活力在14d显著高于0d、7d、21d和28d(p<0.05)，0d与7d差异不显著(p>0.05)；MDA含量差异不显著(p>0.05)；SOD活力差异不显著(p>0.05)；CAT活力在21d显著高于0d、7d、14d和28d(p<0.05)，0d、7d、14d和28d差异不显著(p>0.05)。
表1中药组合物对白点鲑抗氧化指标的影响
2.2中药组合物对白点鲑非特异性免疫指标的影响
中药组合物对白点鲑非特异性免疫指标的影响结果见表2，AKP活力差异不显著(p>0.05)；ACP活力7d、14d和21d显著高于0d和28d(p<0.05)，0d与7d、14d、21d和28d差异显著(p<0.05)；NO浓度在7d和14d显著高于0d、21d、和28d(p<0.05)；LZM含量在21d显著高于0d、7d、14d和28天(p<0.05)，0d、7d和14d差异不显著。
表2中药组合物对白点鲑非特异性免疫指标的影响
2.3中药组合物对白点鲑肠道消化酶指标的影响
中药组合物对白点鲑消化酶指标的影响见表3，蛋白酶活力差异不显著(p>0.05)；淀粉酶活力在14d显著高于0d、7d、21d和28d(p<0.05)，其他时间段差异不显著(p>0.05)；脂肪酶活力差异不显著(p>0.05)。
表3中药组合物对白点鲑消化酶指标的影响
3、实验结论
本试验通过对白点鲑投喂添加中药组合物的饲料喂养28天，研究结果表明：
(1)14d时，白点鲑血液抗氧化性、非特异性及消化酶指标明显提高，其中SOD、ACP、T-AOC和淀粉酶差异显著。
(2)因此，投喂添加0.5％中药组合物的饲料，对白点鲑有促进作用，14d时对白点鲑的效果最佳。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种白点鲑饲养用中药组合物，其特征在于包括以下重量份的成分：大黄16～20份，黄芪12～10份，连翘8～10份，黄苓2～4份，丹皮2～4份，抱树莲1～2份，扁豆衣1～2份，雌黄0.8～1.2份，古羊藤0.6～0.8份，过岗龙0.6～0.8份。
2.根据权利要求1所述的一种白点鲑饲养用中药组合物，其特征在于该组合物还包括1～2重量份的黄蜀葵。
3.根据权利要求1所述的一种白点鲑饲养用中药组合物，其特征在于该组合物还包括0.5～0.7重量份的寒水石。
4.根据权利要求1所述的一种白点鲑饲养用中药组合物，其特征在于该组合物还包括2～6重量份的积雪草。
5.根据权利要求1所述的一种白点鲑饲养用中药组合物，其特征在于该组合物还包括2～4重量份的苦楝皮。
6.根据权利要求1所述的一种白点鲑饲养用中药组合物，其特征在于该组合物由以下重量份的成分组成：大黄18份，黄芪11份，连翘9份，黄苓3份，丹皮3份，抱树莲1.5份，扁豆衣1.5份，雌黄1份，古羊藤0.7份，过岗龙0.7份。
7.根据权利要求1所述的一种白点鲑饲养用中药组合物，其特征在于该组合物由以下重量份的成分组成：大黄18份，黄芪11份，连翘9份，黄苓3份，丹皮3份，抱树莲1.5份，扁豆衣1.5份，雌黄1份，古羊藤0.7份，过岗龙0.7份，黄蜀葵1.5份，寒水石0.6份，积雪草4份，苦楝皮3份。
8.应用权利要求1～7任一项所述中药组合物饲养白点鲑的方法，其特征在于该方法是将所述中药组合物以0.5％(w/w)的比例添加至鱼饲料中，混匀，而后投喂白点鲑，持续7～28d。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述持续时间为14d。
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