CN104672340A - 一种生姜多糖的提取工艺及其提取物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种生姜多糖的提取工艺及其提取物的应用方法，该提取工艺不仅步骤简单、操作方便，而且大大提高了生姜多糖的提取率及纯度。所制备的生姜多糖可明显促进免疫器官发育，增强机体对抗原的免疫应答，有利于增强机体抗病能力。

Description

一种生姜多糖的提取工艺及其提取物的应用

技术领域

本发明涉及一种生姜提取物的制备方法及应用，特别涉及一种生姜多糖的提取工艺及所得生姜多糖的应用。

背景技术

传染性疾病对畜牧生产具有极大危害，尤其是发生病毒性疾病，目前几乎没有有效的治疗药物，故提高机体免疫力是防控病毒性疾病的关键和根本。自1925年法国免疫学家兼兽医Gaston Ramon发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗反应以来，免疫增强剂在医学和兽医学领域逐渐引起人们的关注。实践证实，当前相当数量的疫苗只有与免疫增强剂配合应用才能具有良好的预防效果，近年来，免疫增强剂的研究领域不断拓宽，新成员、新剂型不断发现，临床应用范围越来越广泛，成为当代免疫学研究的热点。然而现存的免疫增强剂中，许多具有较好佐剂活性的同时还存在许多弊端，例如粘滞性高、稳定性差、注射局部反应严重以及制作繁琐、价格昂贵、效果不稳定等。因此，寻找具有高效的、低毒的和能广泛应用的免疫增强剂已成为当务之急。

多糖是单糖通过糖苷链连接而成的天然高分子化合物，是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动植物和微生物的细胞壁中，具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用，且几乎没有毒性，是用于免疫增强剂的佳选。生姜是多年生草本姜的根茎，其营养丰富，当前已确认的化学成分达200余种，其具有广谱抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，药用价值高。由于生姜分布广泛，营养丰富，在其基础上提取的多糖具有价格低廉、功效好、使用方便等优点。但是目前生姜多糖的提取工艺存在着提取率低，纯度不高的问题，这在一定程度上限制了其推广应用。

发明内容

本发明提出一种生姜多糖的提取工艺，解决了现有提取工艺中生姜多糖提取率低，纯度不高的问题。

一种生姜多糖的提取工艺，包括如下步骤：

步骤1：将生姜切片，60℃下烘干至恒重，粉碎，过80目筛，得生姜粉；

步骤2：取步骤1中的生姜粉，加水，100℃水煮3h，得水煮液；

步骤3：将步骤2中的水煮液置于60℃的水浴中进行浓缩，得浓缩液；

步骤4：向步骤3中的浓缩液中加入氯仿-正丁醇溶液，混合20min，3500rpm离心5min，取上清液；

步骤5：向步骤4中的上清液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，静置，4000rpm离心5min，取沉淀物，用水溶解，再用80％乙醇沉淀，所得沉淀物于60℃下干燥至质量不再变化，得生姜多糖。

优选的，步骤2中生姜粉与水的质量比为1:30。

优选的，步骤2具体为将生姜粉水煮两次，并将两次所得水煮液合并。

优选的，步骤4中氯仿-正丁醇溶液的体积为浓缩液体积的1/4。

优选的，步骤4中离心操作2～3次。

优选的，步骤5中的静置时间为12h。

本发明还提供了一种生姜多糖的应用，其步骤为：将生姜多糖配制成浓度为10mg/mL的生姜多糖水溶液。

本发明的有益效果：

本发明提出的生姜多糖的提取工艺，不仅步骤简单、操作方便，而且大大提高了生姜多糖的提取率及纯度。

本发明所制备的生姜多糖可明显促进免疫器官发育，增强机体对抗原的免疫应答，有利于增强机体的抗病能力。

附图说明

图1为五个试验组雏鸡血清新城疫抗体滴度随时间的变化曲线图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种生姜多糖的提取工艺。

实施例1

1材料和仪器

材料：生姜；无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、浓盐酸、硫酸铜、酒石酸钾钠、三氯醋酸、碳酸氢钠、铝片等(均为分析纯)。

仪器：紫外光谱仪(天美公司，UV1102PC型)；自动平衡离心机(北京医用离心机厂，LDZ5-2)；数显恒温水浴锅(国华，HH-4)；生化培养箱(HPS-250，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)；手提式高压蒸汽灭菌锅(YXQ，上海医用核子仪器厂)；低温冰箱(新飞，BCD-213KA)；电子天平(上海天平仪器厂，FA1104型)。

2提取方法

材料预处理：生姜使用前60℃烘干至恒重，粉碎过80目筛备用。

热水提取：称取备用的生姜粉，向其中加入30倍(质量倍数)的水，100℃下水煮3h，得水煮液，生姜粉可水煮一次，也可按上述条件水煮多次，并将每次所得水煮液合并，优选的，将生姜粉水煮2次。

浓缩：将上述水煮液置于60℃的水浴中，进行浓缩，得浓缩液。

脱蛋白：向浓缩液中加入1/4倍体积的氯仿－正丁醇溶液，混合20min，3500rpm离心5min，中层白色絮状沉淀为蛋白质，故取上清，重复离心操作至中间没有明显沉淀为止，优选的，离心2～3次。

醇沉：脱蛋白完毕，向提取液中缓缓加入无水乙醇，边加边搅拌，使乙醇浓度为60％，静置一段时间后，优选为静置12h后，4000rpm离心5min，倒掉上清，将沉淀物用蒸馏水溶解，再用80％乙醇沉淀一次，沉淀物60℃下干燥直至质量不再发生变化，即为生姜多糖。

试验重复3次，计算得到生姜多糖的提取率(提取率＝多糖重量/生姜干重×100％)。

3结果鉴定

生姜多糖定性鉴定

α-萘酚试验：取检品的水溶液1mL，加5％α-萘酚试液数滴振荡后，沿管壁滴入5～6滴浓硫酸，使成两层，待2～3min后，观察液面分界处是否有紫红色环出现。

斐林试验：取检品的水溶液1mL，加入稀盐酸5滴，置沸水浴中10～15min，用10％氢氧化钠溶液中和至中性，再加新配的碱性酒石酸铜试液4滴；另取检液1mL，不加酸直接加入上述试液4滴，两管同时置水浴上煮沸5～6min。如果水解后生成棕红色沉淀物的量比未经水解的多，则示有多糖。

氯仿-浓硫酸反应：将检品溶于氯仿，加入浓硫酸，氯仿层呈现红或蓝色，浓硫酸层有绿色荧光，则示检品中有皂甙。

三氯醋酸反应：将含检品的氯仿溶液滴在纸上，滴三氯醋酸试剂，加热，生成红色渐变紫色，说明检品中有皂甙。

茚三酮试验：取检品的水溶液1mL，加入茚三酮试液2～3滴，加热煮沸4～5min，待其冷却，呈现红色、棕色或蓝紫色，则检液中有蛋白质、肽类及氨基酸。

盐酸-镁粉试验：取检品的乙醇溶液1mL，加放少量镁粉，然后加浓盐酸4～5滴，置沸水浴加热2～3min，如出现红色，示有游离黄酮类(以不加镁粉做对照)。

碘化铋钾试验：取检品水溶液1mL，加盐酸酸化，滴加碘化铋钾试剂，如有橘红色沉淀产生，示可能含有生物碱。

多糖纯度的测定

多糖纯度测定采用硫酸-苯酚法，其原理是多糖在高温条件下被浓硫酸水解产生单糖，单糖在强酸性条件下与苯酚反应生成棕红色物质，其吸光度与单糖含量成正比。

标准曲线的绘制：精密称取于105℃干燥至恒重的葡萄糖25mg于小烧杯中，加水溶解并定量移至100mL的容量瓶中，稀释至刻度，混匀，得0.1mg/mL的标准品溶液。分别精密吸取该溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL置于50mL量瓶中，加蒸馏水至刻度。分别吸取以上各浓度的标准溶液2mL于具塞试管中，加5％的苯酚试液1mL，摇匀，迅速加浓H₂SO₄5mL，振摇2min后，于沸水浴中加热15min，取出置于冷水中冷却。以苯酚-硫酸溶液为空白，于487nm处测吸光度，经回归得线性方程A＝0.0385C-0.016(r＝0.9812)。

纯度的测定：精密称取约0.1g多糖样品于小烧杯中，加水适量使溶解，定量转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得样品溶液，吸取该溶液6.0mL置于100mL容量瓶中，加水至刻度，得供试品溶液。分别吸取该供试品溶液各2mL于具塞试管中(每组3个重复)，按标准曲线项下方法操作，以苯酚-硫酸溶液为空白，在487nm处进行比色测定，按回归方程求得供试溶液中多糖的纯度。

4结果分析

采用本发明提供的生姜多糖提取工艺得到的生姜多糖为黄色固体，极易溶于水，对其进行定性分析及定量鉴定所得结果分别如表1、表2所示：

表1提取物定性鉴定结果

由此说明所得提取物中含有多糖和蛋白质、氨基酸，不含皂甙、黄酮类和生物碱等物质。

表2提取物定量测定结果

经测定本发明生姜多糖的提取率为2.35％，所得生姜多糖的纯度为37.31％。

本发明还提供一种生姜多糖的应用方法。

实施例1：

1受试药物的制备

将所得生姜多糖配制成浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的生姜多糖水溶液，并对其进行消毒、杀菌和热源试验(中华人民共和国兽医药典委员会，2005)，确认符合要求后，4℃保存待用。

2试剂和仪器

肝素，瑞士染料，甲基绿，副品红等均为常用试剂；鸡红细胞溶液(健康鸡外周血用生理盐水洗3遍，每次1500rpm离心10min，用前配成所需浓度)。

离心机，CR14RD，上海天美生化仪器设备工程有限公司；生化培养箱，HPS-250，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；生物显微镜，COIC公司；电子天平，上海天平仪器厂，FA1104型。

3试验动物

小白鼠，购自河北医科大学，常规饲养3d(天)，淘汰病鼠、弱鼠，用以试验。

4分组与处理

选择饲养了3d的健康小鼠100只，随机平均分为5组，分笼饲养，即生理盐水组(NS)、生姜多糖水溶液组(ZP-1，ZP-5，ZP-10和ZP-20)。从4d起，分别灌胃生理盐水、生姜多糖水溶液1mL/只。试验为期3周，期间小鼠自由采食和饮水。

各组分别在3d、10d、15d和20d分别每组随机选取3只小鼠，称重，然后断尾采血，制作血涂片；采血后小鼠脱颈椎处死，迅速摘取胸腺、脾脏并称重，计算胸腺指数和脾脏指数(以器官重量(mg)/体重(g)表示)。

5测定

腹腔巨噬细胞吞噬功能测定

小鼠采样前15min，消毒腹部，注入生理盐水3mL，轻揉腹部5min，注射lmL5％的鸡红细胞，轻揉腹部10min，剖开腹腔，吸取腹腔液滴在消毒过的载玻片上，置湿盒内，于37℃温箱中孵育30min，生理盐水冲去浮着的细胞，瑞氏染液染色，显微镜下观察，每张涂片计数300个巨噬细胞，按以下公式计算吞噬率和吞噬指数(吞噬率＝吞噬红细胞的巨噬细胞数/总巨噬细胞数×100％)。

酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)测定

孵育液配制：将3mL4％NaNO₂水溶液逐滴加入3mL4％副品红盐酸溶液中，边滴边摇，使生成偶氮副品红；将6mL偶氮副品红逐滴加入89mLpH为7.6的磷酸盐缓冲液中，边滴边摇；再将2.5mL2％醋酸萘酯乙二醇甲醚溶液逐滴加入以上混合液中，调pH为6.4即可。

操作方法：取肝素抗凝血，制作血涂片，自然风干后，浸入孵育液中37℃孵育3h，自来水冲洗，滤纸吸干，2％甲基绿溶液染色10s，自来水冲洗，滤纸吸干，镜检。凡胞浆内出现大小和数量不等的深红色颗粒者为ANAE阳性细胞(T淋巴细胞)，计数200个淋巴细胞，计算ANAE阳性细胞率。

结果表示：ANAE阳性率(％)＝200个淋巴细胞中ANAE阳性细胞数/200×100％。

数据处理

结果以表示，SPSS 13.0进行单因素方差分析，用LSD法进行组间多重比较，P≤0.05表示差异显著。

6结果与分析

6.1肉眼观察

肉眼观察各组脾脏、胸腺颜色、形态正常，无可见病理变化，且试验组脾脏、胸腺与对照组比较，更富有光泽，体积较大，变化明显。

6.2对小鼠脾脏指数的影响

如表3所示，ZP组小鼠脾脏指数均显著高于NS组(P≤0.05)；ZP各试验组小鼠脾脏指数中，ZP-10组效果显著高于其它各组(P≤0.05)。以上结果说明ZP组的4个浓度组均显著提高小鼠脾脏指数，且以ZP-10组效果最佳。

表3脾脏指数(mg/g)

注：生理盐水＝NS；生姜多糖＝ZP；*P≤0.05；下表同。

6.3对小鼠胸腺指数的影响

如表4所示，ZP组小鼠胸腺指数均显著高于NS组(P≤0.05)；ZP各试验组小鼠胸腺指数中，ZP-10组效果显著高于其它各组(P≤0.05)。以上结果说明ZP组的4个浓度组均显著提高小鼠胸腺指数，且以ZP-10组效果最佳。

表4胸腺指数(mg/g)

6.4对小鼠外周血ANAE阳性细胞率的影响

如表5所示，ZP组小鼠外周血ANAE阳性细胞率均显著高于NS组(P≤0.05)；ZP各试验组小鼠外周血ANAE阳性细胞率中，ZP-10组效果显著高于其它各组(P≤0.05)。表明ZP组的4个浓度组均显著提高小鼠外周血ANAE阳性细胞率，且以ZP-10组效果最佳。

表5小鼠外周血ANAE阳性细胞率(％)

6.5对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

如表6所示，ZP组小鼠巨噬细胞吞噬百分率均显著高于NS组(P≤0.05)；ZP各试验组小鼠巨噬细胞吞噬百分率中，ZP-10组效果显著高于其它各组(P≤0.05)。以上结果说明ZP组的4个浓度组均显著提高小鼠巨噬细胞吞噬百分率，且以ZP-10组效果最佳。

表6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率的影响(％)

7结论

胸腺是机体重要的中枢免疫器官，是机体淋巴细胞分化和成熟的主要器官，而脾脏是机体最重要的外周淋巴器官。当淋巴细胞在胸腺中发育成熟后，经循环系统转移到脾脏以及各级淋巴组织和淋巴器官中储存，并最终发挥免疫作用。脾脏和胸腺指数是机体脾脏和胸腺发育程度的一个重要反映，给小鼠灌胃生姜多糖后，能显著提高小鼠脾脏和胸腺指数，表明本发明制备的生姜多糖促进了小鼠脾脏和胸腺的生长发育，进而增强机体免疫。

ANAE阳性淋巴细胞百分率代表了机体的细胞免疫水平，其中弥散型细胞是一种活化的T细胞亚群，ANAE阳性呈弥散型的淋巴细胞增加显著，表明活化的T细胞显著增多，机体的细胞免疫水平提高。本发明制备的生姜多糖组小鼠ANAE阳性率显著高于对照组，表明生姜多糖能极大提高机体的细胞免疫水平，特别是T细胞免疫活性显著增强。

小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数是机体非特异性免疫指标。本发明制备的生姜多糖在试验期内均显著提高了小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，说明其有增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，进而提高机体非特异性免疫的作用。

综上所述，本发明制备的生姜多糖能显著提高小鼠免疫器官指数，促进免疫器官发育，有利于增强机体免疫，且生姜多糖在小鼠上的最佳应用浓度为10mg/mL。

实施例2

1受试药物的制备

将所得生姜多糖配制成浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的生姜多糖水溶液，并对其进行消毒、杀菌和热源试验(中华人民共和国兽医药典委员会，2005)，确认符合要求后，4℃保存待用。

2试剂和仪器

新城疫(ND)活疫苗和油疫苗均购自齐鲁动物保健品有限公司；

氯化钠注射液(山东鲁抗辰欣药业有限公司)；亚甲基兰、苏丹红、苯酚(上海科兴商贸有限公司)。

离心机，CR14RD，上海天美生化仪器设备工程有限公司；生物显微镜，COIC公司；电子天平，上海天平仪器厂，FA1104型。

3试验动物及其分组和处理

试验用1日龄海兰蛋雏鸡购自石家庄京石孵化场，试验前饲养于60×60×100厘米铁丝鸡笼中(10只/笼)，室温控制在36±1℃，24h充足光照。随着试验进行，饲养室温度逐渐降低到室温，光照逐渐减少至12h/d，并保持不变。雏鸡饲料购自石家庄正大集团饲料厂，饲料营养价值满足雏鸡生长需要。

500只7d雏鸡滴鼻接种新城疫(ND)活疫苗，随机分为5个试验组，每组100只，平均分为10个重复。雏鸡初始平均体重70.6g，抽检新城疫抗体滴度为4.3log2。1至4组雏鸡分别颈部皮下注射1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL生姜多糖0.5mL，每日一次，连续3天。5组为空白组，用生理盐水代替不同剂量生姜多糖进行注射。在28d，各组雏鸡二次接种新城疫(ND)油疫苗，同时按照7d的处理方式给雏鸡注射生姜多糖和生理盐水。另外，在第一次接种后的0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d和63d，每组随机选择20只鸡(每重复2只)进行心脏采血并制备血清，用以分析血清新城疫抗体滴度(具体试验安排和样品采集见表7)。

表7试验设计

注：¹ND＝新城疫；²ZP＝生姜多糖；

4测定

血清新城疫抗体滴度测定采用微量血凝抑制试验(Fu and Liu,1997)，结果以log2形式表示。以表示，应用SPSS 13.0进行单因素方差分析，用LSD法进行组间多重比较，P≤0.05表示差异显著。

5结果与分析

对血清新城疫抗体滴度的影响

如表8所示，与对照组相比较，第一次接种14d后，ZP-5、ZP-10和ZP-20组雏鸡新城疫抗体滴度均有显著提高(P≤0.05)，ZP-1组雏鸡新城疫抗体滴度则是在接种后21d均有显著提高(P≤0.05)。而4个试验组在刚接种后的短期内，雏鸡新城疫抗体滴度虽有提高，但差异不显著(P≥0.05)。

表8对雏鸡血清新城疫抗体水平的影响¹

注：1指结果以log2表示；2表示ZP-1、ZP-5、ZP-10、ZP-20分别指不同剂量的生姜多糖，结果为同重复组取样雏鸡的几何平均值(n＝10，每重复取样2只)；3表示时间计算从新城疫疫苗第一次接种开始；*表示P≤0.05.

ZP-5与ZP-1组雏鸡血清新城疫抗体滴度比较，除了第一次接种28d外(P≤0.05)，整个试验期内差异均不显著(P≥0.05)。ZP-10和ZP-20组雏鸡新城疫抗体滴度与ZP-1组相比较，接种后7d两者均差异不显著(P≥0.05)，接种后56d ZP-20组差异不显著(P≥0.05)，其余试验期内各组均差异显著(P≤0.05)。与ZP-5组雏鸡新城疫抗体滴度相比，ZP-10和ZP-20组整个试验期内，只有ZP-10组在56d和63d时差异显著(P≤0.05)，其余试验期内各组均差异不显著(P≥0.05)。另外，试验也比较了ZP-10和ZP-20组之间雏鸡新城疫抗体滴度，发现两者均无明显差异(P≥0.05)。

血清新城疫抗体滴度的动态变化

如图1所示，从总体上看，5个试验组雏鸡血清新城疫抗体滴度，在整个试验期内的变化呈现一定规律。第一次接种后，新城疫抗体滴度快速升高，直到21d之前，这种趋势逐渐变缓，而当21d第二次接种后，新城疫抗体滴度以更快的速度升高，在42d达到最大值，并保持一定时间，随后新城疫抗体滴度开始逐渐降低。

另外，从图1中可以发现，各试验组雏鸡血清新城疫抗体滴度动态变化曲线均比生理盐水对照组高，特别是21d后，表现最为明显。而4个试验组中又以ZP-1组动态变化曲线最靠近生理盐水对照组，与其余3个试验组有差异。图中ZP-10和ZP-20组新城疫抗体滴度动态变化曲线几乎重合，说明这两组之间差异不显著。

综上所述，本发明制备的生姜多糖能提高雏鸡外周血中抗体水平，有利于增强机体抗病能力，其最佳应用浓度为10mg/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种生姜多糖的提取工艺，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将生姜切片，60℃下烘干至恒重，粉碎，过80目筛，得生姜粉；

步骤2：取步骤1中的生姜粉，加水，100℃水煮3h，得水煮液；

步骤3：将步骤2中的水煮液置于60℃的水浴中进行浓缩，得浓缩液；

步骤4：向步骤3中的浓缩液中加入氯仿-正丁醇溶液，混合20min，3500rpm离心5min，取上清液；

步骤5：向步骤4中的上清液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，静置，4000rpm离心5min，取沉淀物，用水溶解，再用80％乙醇沉淀，所得沉淀物于60℃下干燥至质量不再变化，得生姜多糖。

2.根据权利要求1所述的一种生姜多糖的提取工艺，其特征在于，所述步骤2中生姜粉与水的质量比为1:30。

3.根据权利要求2所述的一种生姜多糖的提取工艺，其特征在于，所述步骤2具体为将生姜粉水煮两次，并将两次所得水煮液合并。

4.根据权利要求1所述的一种生姜多糖的提取工艺，其特征在于，所述步骤4中氯仿-正丁醇溶液的体积为浓缩液体积的1/4。

5.根据权利要求4所述的一种生姜多糖的提取工艺，其热证在于，所述步骤4中离心操作2～3次。

6.根据权利要求1所述的一种生姜多糖的提取工艺，其特征在于，所述步骤5中的静置时间为12h。

7.一种如权利要求1～6中任一项所述提取工艺提取的生姜多糖的应用，其特征在于，将生姜多糖配制成浓度为10mg/mL的生姜多糖水溶液。