CN106632719A - 一种超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法 - Google Patents

一种超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，生姜加工副产物生姜渣经去色素、干燥、粉碎及过筛后，用超声波细胞萃取仪进行提取，浸提液离心后得到的上清液经浓缩、去蛋白、醇沉及冷冻干燥等技术制备生姜渣粗多糖。本发明首次从生姜加工副产物生姜渣中提取粗多糖，所提出的工艺方法操作简单、耗时短、效率高且多糖活性物质影响较小。

Description

一种超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法
技术领域
本发明涉及蔬菜副产物综合利用技术，尤其是涉及一种超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法。
背景技术
生姜为姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的鲜根茎。生姜在我国中部、东南部至西南部各省区广为栽培，在亚洲热带地区也是常见的栽培植物。生姜具有发散风寒、温中止呕、温肺止咳的功效，是我国传统的中医药材和常用的香辛料。生姜中含有多种对人体有益的活性物质，如矿物质、维生素、氨基酸类、姜油树脂等。姜味调味品与姜汁饮料是目前广受欢迎的两种生姜产品，但在生产加工过程中，生姜渣成为副产物，极大地造成了生姜资源的浪费。
多糖是由多个单糖分子通过苷键连接而成的一类结构复杂的生物大分子，在天然产物中分布非常广泛。多糖是重要的生物活性物质，具有抗肿瘤、降血脂、抗衰老、抑菌抗炎以及调节肠胃功能等多种生理活性。因此，多糖的提取开发具有广阔的市场和应用前景。据报道，生姜多糖具有抑菌抗敏、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等功效。但关于生姜加工副产物生姜渣多糖未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种操作简便、节省能源、提取效率高的利用超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：
一种超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生姜渣去色素、烘干并粉碎成生姜渣粉；
(2)将步骤(1)中得到的生姜渣粉加水后用超声波细胞萃取仪提取生姜渣粗多糖，得到的浸提液离心后取上清液；
(3)将步骤(2)中得到的上清液抽滤、过膜、减压浓缩，得到浓缩液以三氯甲烷-正丁醇试剂法去蛋白离心分离后取上清液；
(4)重复步骤(3)中的去蛋白离心分离步骤3～5次，得到生姜渣粗多糖上清液；
(5)将步骤(4)中得到的生姜渣粗多糖上清液加入无水乙醇，静置后收集沉淀，得到的沉淀冷冻干燥后即得生姜渣粗多糖。
步骤(1)中，所述去色素的方法为：在每1g生姜渣中加入5～15mL的85％乙醇溶液，静置后取沉淀；所述烘干的温度为40～60℃，所述粉碎的粒度为60～100目。所述生姜渣为新鲜的生姜榨汁，抽滤取姜渣，对含水量无特别要求。
步骤(2)中，所述的水和生姜渣粉的液料比为10～50mL/g，所述超声波细胞萃取仪的提取工艺参数为：超声功率200～600W，超声时间5～25min，超声温度50～90℃。优选的，所述的水和生姜渣粉的液料比为30～50mL/g，所述超声波细胞萃取仪的提取工艺参数为：超声功率300～500w，超声时间10～20min，超声温度60～80℃；最优选的，所述的水和生姜渣粉的液料比为40mL/g，所述超声波细胞萃取仪的提取工艺参数为：超声功率400w，超声时间17min，超声温度74℃。
步骤(3)中，所述膜的直径为0.45μm；所述减压浓缩的条件在45～60℃温度下以旋转蒸发仪减压浓缩上清液至原体积的1/2～1/5。
步骤(3)和(4)中，所述三氯甲烷-正丁醇试剂法使用的三氯甲烷-正丁醇试剂为体积比为2:1～6:1的三氯甲烷和正丁醇混合液。所述三氯甲烷-正丁醇试剂法包括以下步骤：将所述浓缩液与三氯甲烷-正丁醇试剂以2:1～6:1的体积比混合后，搅拌不少于30min后，离心。
步骤(5)中，所述无水乙醇的加入量为所述生姜渣粗多糖上清液体积的1～5倍；所述静置的温度为4℃，所述静置的时间为12～24h；所述冷冻干燥的时间为24～72h。
本发明使用超声波辅助提取得到生姜渣粗多糖，本发明方法生姜渣粗多糖的得率为热水浸提法的2倍且多糖纯度较高。
有益效果：本发明首次从生姜加工副产物生姜渣中提取粗多糖，所提出的工艺方法操作简单、耗时短、效率高、对多糖活性物质影响较小，有利于工业生产。
附图说明
图1超声功率对生姜渣粗多糖得率的影响；
图2液料比对生姜渣粗多糖得率的影响；
图3超声时间对生姜渣粗多糖得率的影响；
图4超声温度对生姜渣粗多糖得率的影响；
图5超声时间、超声功率、超声时间、料液比交互作用的响应曲面图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例中，粗多糖得率的计算方式如下：粗多糖得率(％)＝粗多糖/生姜渣粉×100％。
多糖中总糖含量的测定，参照苯酚硫酸法进行实验，并适当调整，具体实验步骤如下：
取葡萄糖标准品烘干至恒重，配置浓度为40μg/mL葡萄糖标准溶液，取8支试管，分别加入上述葡萄糖标准溶液0.0mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL，进而用去离子水补齐至2.0mL。加6％苯酚溶液1.0mL，再缓慢加入浓硫酸5.0mL，充分小心混匀，静置冷却30min后于490nm处测定吸光值，并以去离子水作为空白对照。以试管中葡萄糖微克数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线并得到标准曲线的回归方程，y＝0.0164x+0.0726(R2＝0.9982)，其中，x为葡萄糖微克数，y为490nm处溶液吸光值。配制适当浓度的生姜渣粗多糖溶液(约100μg/mL)，配置完成后，取多糖溶液0.5mL，加入去离子水1.5mL，再缓慢加入6％苯酚溶液1.0mL、浓硫酸5.0mL，充分小心混匀，冷却30min，测定反应体系490nm波长的吸光值。
根据葡萄糖标准曲线和吸光值计算出样品中总糖的微克数，再求出生姜渣粗多糖样品中总糖的百分比含量。
实施例1：生姜粗多糖的制备
(1)用新鲜的生姜榨汁，抽滤取姜渣，60℃烘干，粉碎，过80目筛，得到超微生姜渣粉。以每10g粉按1∶10(w∶v)加85％乙醇，静置2h，离心5000g、15min，取沉淀，烘干，得到生姜渣粉，在4℃下保存。
(2)取预处理粉1g，按超声功率200～600W、液料比10～50mL/g、超声时间5～25min、超声温度50～90℃进行超声萃取。浸提液离心(5000g，15min)，取上清液。
(3)将步骤(2)中得到的上清液抽滤，过0.45μm的膜，将滤液减压浓缩至原来的1/3。多糖溶液与三氯甲烷-正丁醇试剂(三氯甲烷∶正丁醇＝4:1)4:1混合，磁力搅拌器搅拌30min，离心(5000g，15min)重复3次，取上层清液得到生姜渣粗多糖上清液。
(4)将步骤(3)中得到的生姜渣粗多糖上清液再加入4倍体积无水乙醇，4℃冰箱沉淀12h，离心(5000g，15min)取沉淀，沉淀冻干即为生姜粗多糖。分别重复上述实验3次，得到生姜渣粗多糖0.487g、0.474g、0.482g，计算多糖提取率结果平均值为4.81％，取该平均值为多糖得率，总糖含量为87.32％。
实施例2～29超声波辅助提取生姜渣粗多糖工艺条件优化
根据实施例1的方法制备生姜粗多糖，采用不同超声功率、提取时间、提取温度和液料比进行超声波辅助提取试验，以生姜渣粗多糖得率为响应值，逐个考察各提取条件对提取效果的影响。试验设计及结果见表1和2。
(A)单因素实验设计
准确称取生姜渣粉2.0g，放入超声波反应瓶中，在其他条件相同的情况下，采用不同超声功率、提取时间、提取温度和液料比进行超声波辅助提取试验，以生姜渣粗多糖得率为响应值，逐个考察各提取条件对提取效果的影响。
响应面分析法实验设计
通过单因素实验初步确定4个变量的适宜范围，进行四因素三水平Box-Behnken实验设计，各因素的实验水平及编码列于表1。用X1、X2、X3、X4分别表示超声功率(W)、液料比(mL/g)，超声时间(min)、超声温度(℃)。Y表示响应值为多糖得率(％)，根据公式xi＝(Xi-X0)/ΔXi对自变量的三个水平进行编码，其中xi表示各变量的编码值，Xi表示各变量的实际值，X0表示各变量的中心点值，ΔXi表示各变量实际值与中心点值之差
表1 Box-Behnken实验设计各因素的实验水平及编码
单因素实验结果
(A-1)超声功率的影响
超声功率对生姜渣粗多糖得率的影响如图1所示。可以看出，功率小于400W时，随着超声波功率的加大,得率也随之增加,这可能是由于小于400W的功率对细胞壁和细胞膜的破坏作用较大。功率大于400W之后多糖的得率反而下降,,超过400W的功率可能使生姜渣粗多糖结构发生破坏或者使其降解。所以本实验中的最佳超声波功率选择400W为响应面实验的中心点。
(A-2)液料比的影响
由图2可以看出,随着液料比值的增大,加快整个溶媒的传质过程,得率会明显的提高,但当液料比大于40mL/g时,液料比过大，造成超声波的空化效应大部分作用在溶剂而不是作用在物料中，从而引起多糖的溶出率偏低。其次。溶剂太多会加剧后期浓缩的蒸发量，造成不必要的能量消耗，因此，选择因此本实验选用的最佳液料比以40mL/g为响应面实验的中心点。
(A-3)超声时间的影响
由图3可以看出,随着提取时间的延长,得率随之增加,但在前15min内的增加趋势明显,15min之后多糖得率反而缓慢下降。这可能是由于超声波在15min内对细胞膜的破坏作用较大,溶出物多,得率也高,但超声波作用时间太长超声波会使提取物中部分多糖受到破坏[18]。因此,为了保证有效成分结构完好且提取完全,本试验最佳提取时间以15min为响应面实验的中心点。
(A-4)超声温度的影响
超声温度对生姜渣粗多糖得率的影响如图4所示。由图4可以看出,随着提取温度的升高,得率随之增加,但在前70℃内的增加趋势明显,70℃之后多糖得率反而缓慢下降。这主要是因为温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，从而提高了多糖的析出速率和得率，而温度过高可能会影响破坏多糖结构，降低得率。因此，本实验最佳提取温度选用70℃为响应面实验的中心点。
(B)响应曲面优化提取工艺
(B-1)响应曲面实验设计结果
不同试验组合条件下，响应曲面试验的响应值(多糖得率)列于表2。根据参数评估，运用Design-Expert V8.05b软件分析响应值与被检变量之间的逻辑关系。通过多重回归分析，可得出生姜渣粗多糖得率的多元二次方程为：
Y＝4.74+0.13X1+0.092X2+0.35X3+0.13X4+0.088X1X2－0.16X1X3－0.017X1X4+0.11X2X3－0.065X2X4－0.09X3X4－0.45X1 2－0.64X2 2－0.35X3 2－0.086X4 2。这里的X1、X2、X3、X4分别表示超声功率、液料比、超声时间、超声温度的编码值，Y表示响应值生姜渣粗多糖得率(％)。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
(B-2)回归方程显著性检验和方差分析
模型方程的回归系数评估以及相应的显著性检验列于表3。P值既可作为检验每个回归系数显著性的工具，又可检验每个被检变量间相互作用的强度。P值越小，则回归系数的相关性就越显著。当P＜0.05时，回归模型相应项目的相关性就被认为是显著的。由表3可以看出各因素及其交互作用对响应值多糖得率的影响，即X1、X2、X3、X4、X1X3、X1 2、X2 2、X3 2对多糖得率的影响是极显著的。
表3回归方程显著性检验
*显著水平0.05，**显著水平0.01，***显著水平0.001。
多元回归模型的方差分析(ANOVA)及统计显著性和适合度检验列于表4。回归模型的ANOVA结果表明，回归模型是显著的，F-检验显示回归模型有很高的F值(110.57)和很低的P值(P<0.0001)。本研究结果的决定系数R2值等于0.9910，显示此回归模型方程达到了极显著的水平。本试验的调整决定系数(R2 Adj)为0.9821，显示在生姜渣粗多糖得率的总变异中约98.21％是由独立变量决定的，即总变异中约1.79％不能由回归模型解释，说明该模型的拟合程度比较好，且误差较小。因此，对于分析和预测不同组合提取条件下的生姜渣粗多糖得率，此模型是合适的。
回归模型在描绘那些不在回归范围内的试验点的数据时出现的模型描绘的失败情况用适合度缺损(Lack-of-Fit)表示。由表2.4可以看出，本模型的适合度缺损具有较低的F值(1.57)和较高的P值(0.3531)，显示适合度缺损相对于纯误差(Pure Error)是不显著的。此结果表明，在被检测变量值的任意组合条件下，都可用此模型方程预测生姜渣粗多糖的得率Y(％)。
变异系数(CV)，也称作离散系数，反应了标准差与平均数之间的比值，用百分数表示，是衡量资料中各观测值变异程度的标准。CV值得大小和预测值的残差大小呈正相关，表4显示，此回归模型的CV值是1.57，说明此回归模型的可靠性及精度均较高。模型的信噪比(Adeq Precision)越高，说明模型用于预测的可信度越高，此回归模型的信噪比是32.463，表明该模型的拟合性较好。
表4回归模型方差分析表
决定系数R2＝0.9910，调整决定系数adj-R2＝0.9821,CV＝1.49，Adeq Precision＝32.463
(B-3)响应面优化以及最佳条件的确定
在应用Design-Expert软件对提取工艺进行优化的过程中，响应曲面图(3维)是回归方程的形象描述，可以直接的反应各个因素与响应值之间的关系。这些图显示了各个变量的实验值与预测值间的关系与两个被测变量间交互作用的类型。
运用Design-Expert V8.05b软件，最终得出了最佳提取工艺中四个因素的具体条件，即超声功率407.04w、液料比40.91mL/g、超声时间17.19min、和超声温度74.62℃。此条件下的生姜渣粗多糖得率为4.85％。综合考虑现实条件及实际的操作情况，将最佳超声波辅助提取生姜副产物中生姜渣多糖的条件修正为超声功率400w，液料比40mL/g，超声时间17min，超声温度74℃，以此作为最佳工艺的验证参数，替换实施例1的相关参数进行实验，生姜渣粗多糖的得率为4.81％，总糖含量为87.32％。经过SPSS 19.0软件分析可知，预测值与实际值差异不显著(P>0.05)，表明验证性实验的实验值与预测值间存在很好的一致性，同时也意味着此次试验过程中产生的多元二次回归方程是准确的，可以较准确的对生姜渣粗多糖的得率进行预测。

Claims (8)

1.一种超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生姜加工副产物生姜渣去色素、烘干并粉碎成生姜渣粉；
(2)将步骤(1)中得到的生姜渣粉加水后用超声波细胞萃取仪提取生姜渣粗多糖，得到的浸提液离心后取上清液；
(3)将步骤(2)中得到的上清液抽滤、过膜、减压浓缩，得到浓缩液以三氯甲烷-正丁醇试剂法去蛋白离心分离后取上清液；
(4)重复步骤(3)中的去蛋白离心分离步骤3～5次，得到生姜渣粗多糖上清液；
(5)将步骤(4)中得到的生姜渣粗多糖上清液加入无水乙醇，静置后收集沉淀，得到的沉淀冷冻干燥后即得生姜渣粗多糖。
2.根据权利要求1所述的超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述去色素的方法为：在每1g生姜渣中加入5～15mL的85％乙醇溶液，静置后取沉淀。
3.根据权利要求1所述的超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述烘干的温度为40～60℃，所述粉碎的粒度为60～100目。
4.根据权利要求1所述的超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的水和生姜渣粉的液料比为10～50mL/g，所述超声波细胞萃取仪的提取工艺参数为：超声功率200～600W，超声时间5～25min，超声温度50～90℃。
5.根据权利要求1所述的超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述膜的直径为0.45μm；所述减压浓缩的条件在45～60℃温度下以旋转蒸发仪减压浓缩上清液至原体积的1/2～1/5。
6.根据权利要求1所述的超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中，所述三氯甲烷-正丁醇试剂法使用的三氯甲烷-正丁醇试剂为体积比为2:1～6:1的三氯甲烷和正丁醇混合液。
7.根据权利要求6所述的超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，所述三氯甲烷-正丁醇试剂法包括以下步骤：将所述浓缩液与三氯甲烷-正丁醇试剂以2:1～6:1的体积比混合后，搅拌不少于30min后，离心取上清液。
8.根据权利要求1所述的超声波辅助提取生姜渣粗多糖的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述无水乙醇的加入量为所述生姜渣粗多糖上清液体积的1～5倍；所述静置的温度为4℃，所述静置的时间为12～24h；所述冷冻干燥的时间为24～72h。
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