CN110122718A - 增强免疫力和缓解体力疲劳的饮料 - Google Patents

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CN110122718A CN201910494938.6A CN201910494938A CN110122718A CN 110122718 A CN110122718 A CN 110122718A CN 201910494938 A CN201910494938 A CN 201910494938A CN 110122718 A CN110122718 A CN 110122718A
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Abstract

本发明属于汁液提取的非酒精饮料技术领域，具体涉及一种增强免疫力和缓解体力疲劳的饮料。所述饮料，葛根素的含量≥7.5mg/mL，总皂苷(以人参皂苷Re计)的含量≥5.0mg/100mL。该饮料能够增强免疫力，缓解体力疲劳。

Description

增强免疫力和缓解体力疲劳的饮料
技术领域
本发明属于汁液提取的非酒精饮料技术领域，具体涉及一种具有增强免疫力和缓解体力疲劳的饮料。
背景技术
人体为防御病原体的浸入有免疫防御和非免疫防御，二者在防御中存在较大的相关性，而免疫机制中细胞免疫和体液免疫的高低是决定感染是否发病的主要因素(“中医药在治疗免疫功能低下致肺部感染的研究进展”，马秀霞等，中医学报，2010年第25卷第11期，第1075页左栏第1段第1-3行，公开2010年06月30日)。
临床上，许多疾病往往存在不同程度上的免疫功能低下，如肝硬化、糖尿病、大棉衣烧伤、各种手术后、肿瘤，血液病等，以及应用免疫抑制剂、肾上腺皮质激素及抗生素等药物，可导致患者吞噬细胞或免疫淋巴细胞数量减少及其功能降低，或体液免疫功能降低，或皮肤黏膜的天然屏障破坏，或上述多种因素同时存在，使患者易受各种病原微生物的侵袭而引起感染(“免疫功能低下者的感染与抗菌药物应用”，汪复，中华医学杂志，1996年第76卷第4期，第245页第1段第1-4行，公开日1996年04月30日)。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种增强免疫力的饮料。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
饮料，其特征在于，葛根素的含量≥7.5mg/mL，总皂苷(以人参皂苷Re计)的含量≥5.0mg/100mL。
进一步，所述饮料的pH值为4.0-6.0。
进一步，可溶性固形物含量≥5％，以质量百分比计。
本发明的目的还在于保护所述饮料的制备方法，将五味子粉碎，然后与党参、麦冬、葛根和刺五加混合，再提取，随后将提取液静置后过滤，然后将滤液与甜味剂、防腐剂和水混合，灭菌。
进一步，按照质量份计，五味子、党参、麦冬、葛根和刺五加的配比关系为：五味子1-3份、党参4-7份、麦冬2-5份、葛根2-5份和刺五加2-5份。
进一步，所述提取具体为用水煎煮。
进一步，所述水的用量为五味子、党参、麦冬、葛根和刺五加的总质量的4-8倍。
进一步，所述提取的次数为2-3次，每次0.5-1.5小时。
进一步，所述过滤是指300目过滤。
进一步，所述灭菌是指在120-122℃下灭菌处理10-20分钟。
进一步，所述甜味剂为蔗糖。
进一步，所述甜味剂的用量为党参质量的7-10倍。
进一步，所述防腐剂为山梨酸钾。
进一步，所述防腐剂的用量为五味子质量的8％-13％。
进一步，所述饮料的制备方法，具体为：按照质量份，将五味子1-3份粉碎，然后与党参4-7份、麦冬2-5份、葛根2-5份和刺五加2-5份混合，再用水煎煮2-3次，每次0.5-1.5小时，水的用量为五味子、党参、麦冬、葛根和刺五加的总质量的4-8倍，随后将提取液静置后300目过滤，然后将滤液与甜味剂、防腐剂和水混合，在120-122℃下灭菌处理10-20分钟。
本发明的有益效果在于：
本发明的饮料呈棕色，具有正常滋味及气味，无异味，无正常视力可见外来异物。
本发明的饮料安全性好，无毒。
本发明的饮料能够增强免疫力。
本发明的饮料能够缓解体力疲劳。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
饮料，具体采用以下原料按照以下步骤制备而得：
A.将五味子2g粉碎，然后与党参6g、麦冬4g、葛根4g和刺五加4g混合，然后向该混合物中加入120g纯化水煎煮3次，每次1小时，随后将提取液静置8小时后过滤(300目)，得到滤液；
B.将蔗糖55g、山梨酸钾0.22g加水使完全溶解，过滤(300目)，得到滤液；
C.将步骤A所得滤液和步骤B所得滤液混合并搅拌均匀，加入纯化水定容至1000mL，随后在120-122℃下灭菌处理15分钟。
实施例2
感官评价
对实施例1制得的饮料进行色泽，滋味、气味和状态等方面感官评价，结果如表1所示；
其中，感官评价的检测方法为：取10mL饮料置于50mL无色透明烧杯中，在自然光下观察色泽，鉴别气味，用温开水漱口，品尝滋味，检查有无异物。
表1感官评价检测结果
项目 实施例1
色泽 棕色
滋味、气味 具有正常滋味及气味，无异味
状态 无正常视力可见外来异物
由表1可知，实施例1制得的饮料呈棕色，具有正常滋味及气味，无异味，无正常视力可见外来异物。
实施例3
理化指标性能检测
对实施例1制得的饮料进行pH值、可溶性固形物含量、铅含量、总砷含量、六六六含量、滴滴涕含量、葛根素含量、总皂苷(以人参皂苷Re计)含量，结果如表2所示；
其中，pH值按照《中华人民共和国药典》四部通则0631的方法进行检测；
可溶性固形物含量按照《GB/T 12143-2008饮料通用分析方法》中第4节饮料中可溶性固形物的测定方法(折光计法)进行检测；
铅含量按照《GB/T 5009.12-2017食品中铅的测定》中第四法二硫腙比色法进行检测；
总砷含量按照《GB 5009.11-2003食品中总砷及无机砷的测定》中第二法银盐法进行检测；
六六六含量和滴滴涕含量按照《GB 5009.19-2003食品中六六六、滴滴涕残留量的测定》中薄层色谱法进行检测；
葛根素含量按照以下方法进行检测：
色谱条件：以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以体积比甲醇：36％乙酸(体积分数)：水(25:3：72)为流动相；检测波长247nm；流速0.6ml/min；
对照品溶液的制备：取葛根素适量，精密称定，加体积分数为70％的甲醇溶液，分别制成每1ml含20、40、60、80、100、200μg的标准溶液；
供试品溶液的制备：取供试品10ml，通过D101型大孔吸附树脂(内径3cm，柱长10cm)，以水200ml洗脱，弃用水液；再用300ml70％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至20ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
其余按照《GB/T 22251-2008保健食品中葛根素的测定》中规定的方法进行测定；
总皂苷(以人参皂苷Re计)含量按照以下方法进行检测：
照品溶液的制备：取人参皂苷Re适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含2.0mg的标准溶液；
标准管的制备：精密量取对照品溶液100μl，60℃水浴挥干，加1ml水溶解，通过层析柱(10ml注射器，3cmXAD-2大孔吸附树脂，1cm中性氧化铝)；先用25ml 70％乙醇(体积分数)洗柱，弃去洗脱液，再用25ml水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0ml已处理好的对照品溶液，以水25ml洗脱，弃用水液。再用25ml70％乙醇(体积分数)洗脱，收集洗脱液，60℃水浴蒸干，残渣精密加入5％香草醛冰醋酸溶液(质量分数)0.2ml和高氯酸溶液0.8ml，60℃水浴加热10分钟，取出，冰浴至室温，精密加入5.0ml冰醋酸，摇匀，以相应的试剂为空白，用分光光度计在560nm波长处测定吸光度；
测定法：精密吸取供试品1ml，照标准管的制备项下方法，自“通过层析柱(10ml注射器，3cmXAD-2大孔吸附树脂，1cm中性氧化铝)”起，依法测定吸光度；
其余按《保健食品评价与技术规范》2003版规定的方法进行测定。
表2理化指标检测结果
项目 实施例1
pH 4.67
可溶性固形物，％ 9.0
铅(Pb)，mg/L ＜0.05(检出限0.05)
总砷(As)，mg/L ＜0.01(检出限0.01)
六六六，mg/L ＜5.0(检出限5.0)
滴滴涕，mg/L ＜10.0(检出限10.0)
葛根素，mg/100mL 13.3
总皂苷(以人参皂苷Re计)，mg/100mL 25.5
实施例4
对实施例1制得的饮料进行菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌，结果如表3所示；
其中，菌落总数按照《GB 4789.2-2016食品微生物菌落总数的测定》进行检测；
大肠菌群按照《GB 4789.3-2016食品微生物学检验大肠菌群计数法》进行检测；
霉菌和酵母按照《GB 4789.15-2010食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行检测；
金黄色葡萄球菌按照《GB 4789.10-2010食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》进行检测；
沙门氏菌按照《GB 4789.4-2016食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行检测。
表3微生物指标检测结果
项目 实施例1
菌落总数，CFΜ/mL 573
大肠菌群，MPN/mL 0.31
霉菌和酵母，CFΜ/mL 29
金黄色葡萄球菌 未检出
沙门氏菌 未检出
实施例5
毒理学检测
以实施例1制得的饮料的124倍浓缩液(1ml≈1g)作为受试物，对其进行小鼠急性毒性试验、大鼠急性毒性试验，Ames试验(即污染物致突变性试验)、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和30天喂养试验；
其中，小鼠急性毒性试验按照以下方法进行检测：
昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各10只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700110380，SPF级，试验动物使用许可证号SYXK(豫)2012-2005，屏障环境；
试验方法为最大耐受剂量法，剂量为20.0ml/kg BW，以浓缩液作为灌胃液；
禁食过夜，次日经口依次向给予受试物；灌胃量20ml/kg BW；
观察14天，观察各组动物的中毒表现和死亡时间，用SPSS软件进行方差分析结果如表4所示；
大鼠急性毒性试验按照以下方法进行检测：
SD大鼠，体重180-220g，雌雄各10只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700110382，SPF级，试验动物使用许可证号SYXK(豫)2012-2005，屏障环境；
试验方法为最大耐受剂量法，剂量为20.0ml/kg BW，以浓缩液作为灌胃液；
禁食过夜，次日经口依次向给予受试物；灌胃量20ml/kg BW；
观察14天，观察各组动物的中毒表现和死亡时间，用SPSS软件进行方差分析；结果如表5所示；
Ames试验具体按照以下方法进行：
菌株TA97、TA98、TA100和TA102购自Molecular Toxicology，INC，生物学性状经鉴定合格；
S-9自制，其蛋白含量及活性经鉴定均合格；
剂量选择：受试物分为5个剂量组，分别为8μg/皿、40μg/皿、200μg/皿、1000μg/皿、5000μg/皿，即取1.0g样品加蒸馏水至20ml混匀作为5000μg/皿受试液，以下剂量组依次按照1:4稀释至所需浓度，经无菌后使用；另设空白对照组、溶剂对照组(无菌蒸馏水)、阳性对照组；其中，阳性对照组：不加S-9时TA97、TA98、TA100三种菌株均为2-AF(20μg/皿)，TA102为1,8-二羟基蒽醌(50μg/皿)；
选用平板掺入法，加S-9与不加S-9均做两次，每次做3个平行板，取平均值作为试验结果，用SPSS软件进行方差分析；结果如表6和表7所示；
骨髓细胞微核试验具体按照以下步骤进行：
昆明种小鼠，体重25-30g，雌雄各25只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700119122，SPF级，试验动物使用许可证号SYXK(豫)2012-2005，屏障环境；将雌雄小鼠按照体重分别随机分为5组，每组5只；
受试物3个剂量组分别为2.5ml/kg BW、5.0ml/kg BW、10.0ml/kg BW；分别取5.0ml、10.0ml、20.0ml浓缩液加蒸馏水至40ml，混合后作为低、中、高剂量组的受试物，溶剂对照组为蒸馏水，阳性对照组为环磷酰胺40mg/kg BW，称取环磷酰胺40mg加生理盐水至20ml；经口给予，灌胃量20ml/kg BW；
试验方法选用30小时受试物法，即两次给予受试物间隔24小时，第二次给受试物后6小时颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓制片，经甲醇固定，Giemsa染色；油镜下观察，每只动物计数1000个嗜多染红细胞(嗜多染红细胞的英文简称为PCE)中含微核的嗜多染红细胞数(含微核的嗜多染红细胞英文简称为MNPCE)，以千分率表示，阅片后结果进行卡方检验；同时计数200个PCE，计算PCE/NCE值，其中，NCE为正染红细胞；
试验数据统计：用SPSS软件进行方差分析，结果如表8和表9所示；
小鼠精子畸形试验具体按照以下步骤进行：
昆明种小鼠，体重25-35g，雄性30只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700119122，SPF级，试验动物使用许可证号SYXK(豫)2012-2005，屏障环境；将小鼠按照体重分别随机分为5组，剂量组和溶剂对照组每组分别6只，阳性对照组6只；
受试物单个剂量组分别为2.5ml/kg BW、5.0ml/kg BW、10.02.5ml/kg BW，分别取5.0ml、10.0ml、20.0ml浓缩液加蒸馏水至40ml，混合后作为低、中、高剂量组的受试物，溶剂对照组为蒸馏水，阳性对照组为环磷酰胺40mg/kg BW，称取环磷酰胺40mg加生理盐水至20ml；灌胃量20ml/kg BW，连续5天经口给予受试物；
于首次给受试物后的第35天时，每个剂量组取前5只动物处死，取附睾制片，甲醇固定，1％伊红染色；高倍镜下计数每只动物1000个精子中的畸形精子数及畸形类型，阅片后结果进行秩和检验，
试验数据统计：用SPSS软件进行方差分析；结果如表10和表11所示；
30天喂养试验具体按照以下步骤进行：
动物：SD大鼠，雌雄各40只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700110383，SPF级，试验动物使用许可证号SYXK(豫)2012-2005，屏障环境；观察4天后，雌雄分别按照体重随机分为4组，每组10只；
饲料：由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，合格证号120150803011；
剂量设计：设低、中、高三个剂量组，分别为2.5ml/kg BW、5.0ml/kg BW、10.0ml/kgBW；受试物采用灌胃法给予，分别取20.9ml、41.7ml、83.3ml浓缩液加蒸馏水至100ml混匀，作为低、中、高剂量组的受试液，另设溶剂对照组为蒸馏水；经口给予每日一次，灌胃量10ml/kg BW；
试验方法为最大耐受剂量法，剂量为20.0ml/kg BW，以浓缩液作为灌胃液；
禁食过夜，次日经口依次向给予受试物；灌胃量20ml/kg，连续灌胃30天；
观察指标及测定：
一般状况：观察动物进食、饮水和活动等一般状况；
生长发育指标：自试验开始至解释，每周称1次体重和2次食物摄入量，观察体重变化，计算每周食物利用率和总食物利用率；
血液学及血清生化学检查：于试验结束时空腹过夜采血，用雅培CD3700细胞分析仪测定血红细胞(HB)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、白细胞(WBC)计数及分类(中性粒细胞NEU、淋巴细胞LYM、单核细胞MON、嗜酸性粒细胞EOS、嗜碱性粒细胞BAS)；用拜耳ADVIA1200全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、胆固醇、甘油三酯、总蛋白、白蛋白、尿素氮、血糖(试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司生产)；
脏器系数：于试验结束后断头处死大鼠，称取体重及其肝、肾、脾、卵巢(睾丸)的重量，计算脏体比；
病理组织学检查：对动物做大体病变检查，并将各组大鼠的肝、肾、脾、卵巢(睾丸)等置10％的甲醛溶液中固定；石蜡包埋切片，HE染色，普通光镜观察；
试验数据统计：用SPSS软件进行方差分析。
表4小鼠急性毒性检测结果
备注：MTD为最大耐受剂量。
表5大鼠急性毒性检测结果
备注：MTD为最大耐受剂量。
由表4和表5可知，小鼠、大鼠经空腹灌胃后观察14天，雌雄小鼠、大鼠均未见中毒症状，无死亡，雌雄小鼠、大鼠经急性毒性试验MTD均＞20.0ml/kg BW，根据急性毒性分级属无毒级。由此证明，本发明的饮料经急性毒性试验检测结果为无毒。
表6 AMEs试验检测结果(一)
表7 AMEs试验检测结果(二)
由表6和表7可知，各剂量组在加S-9或不加S-9的条件下，均未引起回复突变菌落数明显增加。由此证明，本发明的饮料Ames试验结果为阴性。
表8小鼠骨髓细胞微核试验检测结果(雌性)
备注：与溶剂对照组相比，**P＜0.01。
表9小鼠骨髓细胞微核试验检测结果(雄性)
备注：与溶剂对照组相比，**P＜0.01。
由表8和表9可知，各剂量组微核率与溶剂对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)，阳性对照组与溶剂对照组相比差异极显著(P＜0.01)；各剂量组PCE/NCE比值与溶剂对照组
相比未见明显下降。由此证明，本发明的饮料对小鼠骨髓细胞无明显毒性。
表10小鼠精子畸形试验检测结果
剂量，ml/kg BW 动物数，只 精子数，个 畸形精子数，个 精子畸形率，％
2.5 5 5000 138 2.76±0.24
5.0 5 5000 143 2.86±0.26
10.0 5 5000 142 2.84±0.29
溶剂对照 5 5000 131 2.62±0.55
阳性对照 5 5000 346 6.92±1.13**
备注：与溶剂对照组相比，**P＜0.01。
表11小鼠精子畸形试验检测结果
备注：与溶剂对照组相比，**P＜0.01。
由表10和表11可知，与溶剂对照组相比，阳性对照组精子畸形率具有极显著差异(P＜0.01)，各剂量组精子畸形率无显著差异(P＞0.05)，小鼠精子畸形试验阴性。由此证明，本发明的饮料对小鼠精子无明显毒性。
30天喂养试验各组大鼠的活动、摄食、饮水和排便等均未见明显异常。
表12 30天喂养试验体重检测结果
备注：各剂量组与对照组相比，P＞0.05。
由表12可知，与对照组相比，各剂量组动物的体重无显著差异(P＞0.05)。由此证明，本发明的饮料对动物体重无明显影响。
表13 30天喂养试验进食量检测结果
备注：各剂量组与对照组相比，P＞0.05。
由表13知，与对照组相比，各剂量组动物的进食量无显著差异(P＞0.05)。由此证明，本发明的饮料对动物进食量无明显影响。
表14 30天喂养试验食物利用率检测结果
备注：各剂量组与对照组相比，P＞0.05。
由表14知，与对照组相比，各剂量组动物的食物利用率无显著差异(P＞0.05)。由此证明，本发明的饮料对动物食物利用率无明显影响。
表15 30天喂养试验血常规检测结果
备注：各剂量组与对照组相比，P＞0.05。
表16 30天喂养试验血常规检测结果
备注：各剂量组与对照组相比，P＞0.05。
由表15和16可知，与对照组相比，各剂量组动物的血常规指标无显著差异(P＞0.05)。由此证明，本发明的饮料对动物血常规指标无明显影响。
表17 30天喂养试验血清生化指标检测结果
备注：各剂量组与溶剂对照组相比，P＞0.05。
表18 30天喂养试验血清生化指标检测结果
备注：各剂量组与对照组相比，P＞0.05。
由表17和18可知，与对照组相比，各剂量组动物的血清生化指标无显著差异(P＞0.05)。由此证明，本发明的饮料对动物血清生化指标无明显影响。
表19 30天喂养试验脏器重量影响检测结果
备注：各剂量组与对照组相比，P＞0.05。
表20 30天喂养试验脏器系数影响检测结果
备注：各剂量组与对照组相比，P＞0.05。
由表19和20可知，与对照组相比，各剂量组动物的肝、肾、脾、性腺的重量和脏器系数无显著差异(P＞0.05)。由此证明，本发明的饮料对动物的脏器重量和脏器系数无明显影响。
各组动物剖检后肉眼观察各脏器颜色、形状、大小等均未见明显病变。病理检查标本为对照组、高剂量组的肝、肾、胃、肠、脾、卵巢(睾丸)。标本系甲醛固定，经水洗、修块、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，镜下观察结果如表21-27所示。
表21 30天喂养试验病理组织学检测结果(肝脏)
表22 30天喂养试验病理组织学检测结果(脾脏)
表23 30天喂养试验病理组织学检测结果(肾脏)
表24 30天喂养试验病理组织学检测结果(胃)
表25 30天喂养试验病理组织学检测结果(肠)
表26 30天喂养试验病理组织学检测结果(睾丸)
组别 对照组 高剂量组
动物数，只 10 10
萎缩 0 0
囊肿 0 0
其他 0 0
表27 30天喂养试验病理组织学检测结果(卵巢)
由表19-27可知，切片镜检对照组20只大鼠中有2例动物干细胞空泡变性，1例动物肝脏管汇区炎细胞浸润；高剂量组20只大鼠中有1例动物肝脏管汇区炎细胞浸润，2例动物肾脏肾小管上皮细胞空炮变性，其他均未观察到明显病理改变。由此证明，本发明的饮料对动物病理学无明显影响。
实施例6
增强免疫力功能试验
以实施例1制得的饮料的15.5倍浓缩液为受试物，进行小鼠增强免疫力功能试验，具体按照以下步骤进行：
动物：BALB/c小鼠，雄性，体重18-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700119124，SPF级，试验动物房许可证号：SYXK(豫)2012-2005，屏障环境；将小鼠分为2批，每批48只，每批按照体重随机分为4组，每组12只，免疫一批进行迟发型变态反应、抗体生成细胞检测、血清半数溶血值HC50测定；免疫二批进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定；
剂量选择：三个剂量组低、中、高分别为3.4ml/kg、6.7ml/kg、20.0ml/kg，分别取17.0ml、33.5ml 15.5倍浓缩液加蒸馏水至100ml，作为低、中剂量组的受试液，高剂量组使用15.5倍浓缩液作为受试液；另设溶剂对照组为蒸馏水；经口给予每日一次，灌胃量为20ml/kg，连续灌胃30天后测相应的免疫指标；
试验方法和观察指标：
迟发型变态反应-绵阳红细胞诱导小鼠DTH(足跖增厚法)：取羊血，用生理盐水洗涤3次(2000r/min，10分钟)，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC0.2ml，致敏后4天，测量左后足跖部厚度，同一部位测量3次，取平均值，然后在测量部分皮下注射20％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC 20μl，于注射后24小时测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度；
抗体生成细胞检测(Jerne改良载片法)：将压积SRBC用生理盐水配成2％的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫，5天后，将小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的研磨器内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000转/分)10分用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在8ml RPMI 1640培养液中；将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100ml)加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2-7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50μl 10％SRBC(v/v，用SA液配制)，25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5小时，然后用SA缓冲液稀释的补体(1:6)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5小时，计算溶血空斑数；
半数溶血值(HC50)的测定具体步骤为：将将压积SRBC用生理盐水配成2％的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫，5天后，摘眼球取血，分离血清；血清用SA缓冲液稀释500倍，取稀释后的血清1ml，依次加入10％SRBC 0.5ml，补体1ml(用SA缓冲液按照1:6稀释)，另设不加血清对照管(用SA缓冲液代替)；置37恒温水浴25分钟浴终止反应；2000转/分下离心10分钟，取上清液1ml，都氏剂3ml于试管内，同时取10％SRBC(v/v)0.5ml，加都氏剂至4ml于另一试管内，充分混匀，放置10分钟后，于540nm处测定各管光密度值；然后按照公式计算HC50值；
NK细胞活性测定的具体方法为：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的研磨器内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200mu筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10分钟(1000转/分)，最后用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/ml，取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μl；上述三项均设3个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时，然后将96孔板以1500转/分下离心5分钟，每孔吸取上清液100μl置平底96孔培养板，同时加LDH基质液100μl，反应3分钟，每孔加入1mol/L的盐酸30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值OD；然后按照以下公式
计算NK细胞活性；
以上指标均用SPSS软件进行统计分析：检测数据先经方差齐性检验，再进行方差分析，如组间差异显著，继续进行多个实验组与一个对照组均数的两两比较；对非正态或方差不齐的数据资料进行适当的变量转化，待满足“正态或齐方差”要求后，用转换所得数据进行统计分析，其中，NK细胞活性测定数据需经转换，并经方差齐性检验再进行方差分析。
表28对绵阳红细胞诱导小鼠DTH作用测定结果
组别，ml/kg 动物数，只 24小时足跖肿胀度，mm P值
溶剂对照组 12 0.36±0.12 --
3.4 12 0.45±30.08 0.055
6.7 12 0.49±0.08 0.007
20.0 12 0.52±50.16 0.001
备注：--表示溶剂对照组为参照对象。
由表28可知，中、高剂量组小鼠的足跖肿胀度显著高于溶剂对照组，差异及显著(P＜0.01)。由此证明，本发明的饮料对小鼠的迟发型变态反应能力有增强作用。
表29对抗体生成红细胞数的影响测定结果
组别，ml/kg 动物数，只 溶血空斑数，个 P值
溶剂对照组 12 156±30 --
3.4 12 176±25 0.173
6.7 12 186±28 0.046
20.0 12 208±52 0.001
备注：--表示溶剂对照组为参照对象。
由表29可知，中、高剂量组小鼠的溶血空斑数显著高于溶剂对照组，差异显著(P＜0.05，P＜0.01)。由此证明，本发明的饮料对小鼠的抗体生成细胞的生成有促进作用。
表30对小鼠半数溶血值(HC50)的影响测定结果
组别，ml/kg 动物数，只 HC<sub>50</sub> P值
溶剂对照组 12 243.3±37.3 --
3.4 12 270.3±43.5 0.110
6.7 12 287.2±29.4 0.011
20.0 12 310.3±49.4 0.000
备注：--表示溶剂对照组为参照对象。
由表30可知，中、高剂量组小鼠的半数溶血值显著高于溶剂对照组，差异显著(P＜0.05，P＜0.01)。由此证明，本发明的饮料对小鼠半数溶血值有增高作用。
表31对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验的影响测定结果
组别，ml/kg 动物数，只 淋巴细胞的增殖能力 P值
溶剂对照组 12 1.264±0.252 --
3.4 12 1.394±0.225 0.143
6.7 12 1.459±0.197 0.031
20.0 12 1.702±0.175 0.000
备注：--表示溶剂对照组为参照对象。
由表31可知，中、高剂量组ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力显著高于溶剂对照组，差异显著(P＜0.05，P＜0.01)。由此证明，本发明的饮料对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化有增强作用。
表32对小鼠NK细胞活性的影响测定结果
组别，ml/kg 动物数，只 NK细胞活性，％ P值
溶剂对照组 12 21.0±5.0 --
3.4 12 21.6±2.4 0.999
6.7 12 23.9±6.0 0.0770
20.0 12 31.9±2.7 0.000
备注：--表示溶剂对照组为参照对象。
由表32可知，高剂量组小鼠NK细胞活性显著高于溶剂对照组，差异极显著(P＜0.01)。由此证明，本发明的饮料对NK细胞活性有增强作用。
综上，根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中增强免疫力功能评价标准判定，本发明的饮料在细胞免疫、体液免疫和NK细胞活性结果为阳性，因此，本发明的饮料对小鼠有增强免疫力作用。
实施例7
缓解疲劳实验
以实施例1制得的饮料的15.5倍浓缩液为受试物，进行小鼠增强免疫力功能试验，具体按照以下步骤进行：
动物：昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700119123，SPF级，试验动物房许可证号：SYXK(豫)2012-2005，屏障环境；将小鼠分为2批，每批48只，每批按照体重随机分为4组，每组12只，免疫一批进行负重游泳实验；免疫二批进行血清尿素测定；
剂量选择：三个剂量组低、中、高分别为3.4ml/kg、6.7ml/kg、20.0ml/kg，分别取17.0ml、33.5ml 15.5倍浓缩液加蒸馏水至100ml，作为低、中剂量组的受试液，高剂量组使用15.5倍浓缩液作为受试液；另设溶剂对照组为蒸馏水；经口给予每日一次，灌胃量为20ml/kg，连续灌胃30天后测相应的免疫指标；
主要仪器与试剂：ADVID1200型全自动生化分析仪，拜耳产；乳酸盐分析仪，德国EKF生产；50cm×50cm×40cm游泳箱，上海产；BT2202S型电子天平，赛多利斯产；CP224S分析天平，赛多利斯产；T25型匀浆机，德国IKA产；尿素氮试剂盒由上海科华生物工程有限公司生产；
试验方法：
负重游泳实验：小鼠于末次给予受试物30分钟后，使尾部负重5％体重的铅皮，在水深不少于30cm、水温25℃±1℃的游泳箱中游泳，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间；
血清尿素测定：小鼠于末次给予受试物30分钟后，在水深30cm、水温30℃的游泳箱中不负重游泳90分钟，休息60分钟，拔眼球采全血约0.5ml；待血液凝固后离心，取血清测定尿素含量；
肝糖原测定：小鼠于末次给予受试物30分钟后，立即颈椎脱臼处死取出肝脏，经生理盐水漂洗，滤纸吸干，精确称取肝脏50mg于试管内，加入4ml三氯醋酸匀浆1min，3000转/分下离心15分钟，取上清液用蒽酮法测定肝糖原含量；
实验数据统计：实验数据用SPSS软件进行方差分析。
表33对小鼠负重游泳时间的影响测定结果
组别，ml/kg 动物数，只 NK细胞活性，％ P值
溶剂对照组 12 5.1±0.6 --
3.4 12 5.9±1.2 0.070
6.7 12 6.2±1.1 0.015
20.0 12 6.4±1.0 0.003
备注：--表示溶剂对照组为参照对象。
由表33可知，中、高剂量组小鼠负重游泳时间显著长于溶剂对照组，差异显著(P＜0.05，P＜0.01)。由此证明，本发明的饮料能延长小鼠负重游泳时间。
表34对小鼠运动时血清尿素的影响测定结果
组别，ml/kg 动物数，只 尿素，mmol/L P值
溶剂对照组 12 13.43±1.71 --
3.4 12 13.12±1.29 0.637
6.7 12 12.40±1.58 0.117
20.0 12 10.99±1.71 0.000
备注：--表示溶剂对照组为参照对象。
由表34可知，高剂量组小鼠运动时血清尿素水平显著低于溶剂对照组，差异极显著(P＜0.01)。由此证明，本发明的饮料能降低小鼠运动时血清尿素的产生。
表35对小鼠肝糖原含量的影响测定结果
组别，ml/kg 动物数，只 肝糖原，mg/100g肝组织 P值
溶剂对照组 12 3438±522 --
3.4 12 3859±719 0.158
6.7 12 4130±886 0.023
20.0 12 4598±696 0.000
备注：--表示溶剂对照组为参照对象。
由表35可知，中、高剂量组小鼠肝糖原含量显著高于溶剂对照组，差异显著(P＜0.05，P＜0.01)。由此证明，本发明的饮料能增加小鼠肝糖原的含量。
综上，根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中缓解体力疲劳功能评价标准判定，本发明的饮料在负重游泳实验、血清尿素测定结果和肝糖原测定结果为阳性，因此，本发明的饮料具有缓解体力疲劳功能的作用。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.饮料，其特征在于，葛根素的含量≥7.5mg/mL，总皂苷(以人参皂苷Re计)的含量≥5.0mg/100mL。
2.根据权利要求1所述的饮料，其特征在于，pH值为4.0-6.0。
3.根据权利要求1或2所述的饮料，其特征在于，可溶性固形物含量≥5％，以质量百分比计。
4.权利要求1-3任一项所述饮料的制备方法，其特征在于，将五味子粉碎，然后与党参、麦冬、葛根和刺五加混合，再提取，随后将提取液静置后过滤，然后将滤液与甜味剂、防腐剂和水混合，灭菌。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，按照质量份计，五味子、党参、麦冬、葛根和刺五加的配比关系为：五味子1-3份、党参4-7份、麦冬2-5份、葛根2-5份和刺五加2-5份。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述提取具体为用水煎煮。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述水的用量为五味子、党参、麦冬、葛根和刺五加的总质量的4-8倍。
8.根据权利要求4、5、6或7所述的制备方法，其特征在于，所述提取的次数为2-3次，每次0.5-1.5小时。
9.根据权利要求4、5、6、7或8所述的制备方法，其特征在于，所述过滤是指300目过滤。
10.根据权利要求2、3、4、5、6或7所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌是指在120-122℃下灭菌处理10-20分钟。
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