CN115192567A - 葛根素在制备改善和提升雄性精液质量药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及葛根素在制备改善和提升雄性精液质量药物中的应用，本发明对环磷酰胺处理的ICR成年小鼠和正常青春期ICR小鼠进行灌胃给药葛根素(Puerarin)，实验结果证明，Puerarin可以显著地改善环磷酰胺模型小鼠的精液质量(精子浓度和活力等指标)，而且，Puerarin可以显著地提升正常小鼠的精液质量。因此，Puerarin可用于制备改善化疗所致雄性哺乳动物生殖损伤和提升正常雄性精液质量的产品，本发明具有较好的开发价值和应用前景。

Description

葛根素在制备改善和提升雄性精液质量药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及葛根素在制备改善和提升雄性精液质量药物中的应用。

背景技术

癌症已经是严重危害全世界人民健康的疾病，化疗、放疗等是目前医治癌症的重要临床手段。但是，化疗药物在治疗癌症的同时，常造成癌症患者的睾丸、肝、肾、脾等多脏器损伤，严重影响病人的健康、生活。其中，化疗药物对睾丸的损伤常引起男性生殖功能障碍(精子质量低下)。在本研究中，我们以环磷酰胺为代表研究化疗等因素对男性生殖能力的影响。环磷酰胺作为临床应用较广的抗癌药，可用于睾丸癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、支气管癌、肺癌等。此外，环磷酰胺也可用于类风湿关节炎、儿童肾病综合征以及自身免疫疾病的治疗。但是，已有权威报道指出，环磷酰胺治疗能够造成男性的生殖功能损伤(睾丸萎缩及精子缺乏)。与此同时，现时代的环境污染、工作压力、问题食品等已经越来越普遍地影响男性生殖能力(精液质量)。由此可知，急需探寻可以缓解化疗药物等因素所致生殖损伤的临床干预手段。

天然化合物是有益于解决人类健康问题的重要宝库。已有大量报道指出，葛根素、紫杉醇、小檗碱、黄连素等多种天然化合物用于治疗疾病。其中，葛根素(Puerarin)是从豆科属植物葛根块茎中的一种异黄酮化合物，也是葛根作为药物发挥功能的主要成分。葛根素的分子式是C21H20O9，化学命名为：8-beta-D-葡萄吡喃糖-4，7-二羟基异黄酮。现代药理学研究表明，葛根中葛根素具有抗炎、抗氧化功能；能扩张血管、降低血压、改善微循环；对肾脏相关疾病模型具有很好的保护作用；对非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫均有明显的调节作用。目前，含葛根素的注射液、口服液等产品已经被广泛用于治疗心脑血管疾病、糖尿病及糖尿病并发症、骨坏死、帕金森氏病、阿尔茨海默病、子宫内膜异位症和癌症。然而，葛根素在提升或改善男性生殖能力(精液质量)中的功效尚不清楚，而且有关葛根素在改善雄性精液质量方面的产品尚未见报道。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了葛根素在制备改善和提升雄性精液质量药物中的应用，能够显著地改善环磷酰胺等化疗药物所致的雄性生殖损伤，并显著提升正常雄性动物的睾丸功能，提高精液质量。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

葛根素在制备改善和提升雄性精液质量药物中的应用。

优选地，所述葛根素的分子通式为：

优选地，采用葛根素制备的药物包括溶液、混悬液、冻干粉针、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放制剂、持续释放制剂和微粒体，上述药物通过口服、静脉、动脉方式进行给药。

本发明中，检测葛根素对正常健康青春期雄性ICR小鼠和经环磷酰胺处理的成年雄性ICR小鼠生殖损伤相关的体重、睾丸重量、睾丸病理结构以及精液相关指标的影响。其中，通过拍照、称重观察实验动物体重及睾丸重量改变；通过睾丸组织病理切片的H&E染色(伊红-苏木素染色)或PAS染色(糖原染色)观察小鼠睾丸的病理结构变化；采用CASA系统(计算机辅助精子分析系统)检测实验动物精液质量的相关指标。据此判断葛根素对雄性哺乳动物精液质量的作用。

本发明中通过葛根素微小剂量给药即可显著提升和改善雄性哺乳动物(包括人)的生精功能，提升精液质量，药物本身及药物浓度均安全可靠。本发明涉及葛根素作为活性成分的产品在改善化疗所致雄性哺乳动物生殖损伤和提升正常雄性精液质量的产品中应用。以葛根素作为活性成分的产品可根据本领域公知的方法制备，也可以通过将本发明葛根素作为活性成分的产品与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂/或辅剂结合，制成适用于雄性哺乳动物(包括人)使用的任何剂型。依据患者或动物个体情况，葛根素的给药途径和剂型等有很大范围的变化。

其中，本发明以葛根素作为活性成分的产品在正常健康雄性ICR小鼠的每天合适剂量中的含量通常为0.001mg/kg～200mg/kg体重，其中优选50mg/kg～200mg/kg体重；本发明以葛根素作为活性成分的产品在对药物等各种理化因素导致的精液质量低下的ICR雄性小鼠中，每天合适剂量中的含量通常为0.001mg/kg～100mg/kg体重给药，葛根素的剂量优选为100mg/kg体重/天，人和其他哺乳动物的给药剂量可以按照人与动物表面积等换算公式得到。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明以葛根素作为活性成分的产品可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当以葛根素作为活性成分的产品与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明有益效果：

1、本发明以葛根素作为活性成分的产品可改善环磷酰胺等化疗所致雄性哺乳动物(包括人)生殖损伤和提升正常雄性的精液质量，该用途是首次公开，拓宽了葛根素的应用领域。

2、本发明以小剂量葛根素制备药物即可达到可改善环磷酰胺等化疗所致雄性哺乳动物(包括人)生殖损伤和提升正常雄性的精液质量，药物安全可靠，作为产品进行开发，具有良好的转化前景和临床应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中葛根素提升青春期ICR小鼠的生精能力和精液质量示意图；Normal表示正常健康小鼠组，50mg/kg或200mg/kg是指每千克小鼠体重给50mg或200mg葛根素，Puerarin表示葛根素组；(A)小鼠睾丸的大小示意图；(B)睾丸质量指数及双侧睾丸湿重示意图，ns代表无统计学意义；(C)PAS染色显示小鼠睾丸组织病理结构图，显示50mg/kg体重和200mg/kg体重葛根素灌胃的小鼠生精小管里的精子密度显著高于正常健康小鼠，X50、X100、X200表示显微放大50倍、100倍、200倍下所观察到的结构图；(D)CASA结果显示50mg/kg体重和200mg/kg体重的葛根素给药小鼠的精液质量较正常小鼠明显升高，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001代表葛根素提升正常健康小鼠的精液质量参数具有统计学意义，ns代表无统计学意义。

图2为本发明实施例2中葛根素可以显著地改善环磷酰胺模型组小鼠的生殖损伤示意图；Normal(对照组正常健康小鼠)，Cyclophosphamide(环磷酰胺)，Puerarin(葛根素)，100mg/kg是指每千克小鼠体重给药100mg葛根素；(A)睾丸组织的大小示意图；(B)睾丸质量指数及双侧睾丸湿重示意图，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001代表环磷酰胺或葛根素治疗对小鼠的睾丸质量指数以及双侧睾丸湿重的影响具有统计学意义，ns代表无统计学意义；(C)HE染色显示葛根素可以显著地改善环磷酰胺模型组小鼠睾丸组织的病理结构图，显著地恢复小鼠睾丸生精小管的精子发生；(D)CASA检测结果显示葛根素可以显著地改善模型组小鼠的精子浓度、精子活动率等精液质量指标示意图，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001代表环磷酰胺或葛根素治疗对小鼠的精子浓度、精子活动率的影响具有统计学意义，ns代表无统计学意义；(E)显微观察显示正常对照组、环磷酰胺模型组及100mg/kg体重葛根素治疗组的小鼠精子图，结果显示环磷酰胺模型组小鼠精子浓度明显降低，而100mg/kg体重的葛根素给药显著地改善了环磷酰胺模型小鼠的精子浓度。

具体实施方式

下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参照图1-图2：

实施例1：葛根素提升正常青春期ICR小鼠的精液质量。

1.1实验方法

1.1.1青春期模型动物的葛根素灌胃给药

从南京大学模式动物所购买3周龄的青春期ICR雄性小鼠，随机分为3组，每组5只。所有动物的饲养在SPF级的动物房中。动物饲养于恒温23±2℃、湿度40±10％、12小时昼夜交替的环境，所用饲料为普通辐照饲料(AIN-93)。在实验中，以葛根素对3周龄小鼠进行灌胃给药，每天定时给药剂量分别是50mg葛根素/kg体重、200mg葛根素/kg体重，连续灌胃10天；阴性对照组小鼠灌胃等量生理盐水连续灌胃10天。在此之后的饲养时间里，小鼠自由饮用蒸馏水，在第30天脊柱脱臼法处死小鼠。称量小鼠体重、睾丸大小、睾丸重量；并将睾丸制成石蜡切片，对睾丸切片进行PAS染色；采用CASA检测精液的质量参数，据此评估葛根素对小鼠生精功能和精液质量(精子浓度和活力等指标)的提升作用。

1.1.2宏观形态观察

处死小鼠之后，称取小鼠体重。然后用75％酒精消毒小鼠腹部，取出小鼠睾丸，剥离周围脂肪组织，获得纯净双侧小鼠睾丸，拍照、称重并记录。睾丸质量指数的计算公式是：睾丸质量指数＝睾丸重量(mg)/体重(g)×100％。

1.1.3睾丸的微观形态观察

将各组小鼠睾丸在睾丸固定液中固定过夜，分级乙醇-水系列脱水，石蜡包埋。切片切成5μm厚。然后通过糖原(PAS)染色检测睾丸组织中的糖类，显示出睾丸组织中各生精小管的精子发生情况。最后，在光学显微镜下观察各实验分组睾丸的PAS染色情况。

1.1.4 CASA检测精液指标

在麻醉状态下摘取小鼠附睾体，将双侧附睾尾置于2mL 37℃温热的pH＝7.4的HBSS缓冲溶液(Hank’s平衡盐缓冲液)中孵育20min，整个过程置于摇床上轻轻摇动，使精子游出。将100μL的混悬液加入400μLHBSS中稀释。将稀释的精子悬液滴放在玻片上，然后用CASA系统计算精子浓度和活动率等指标。

1.2实验结果

上述所用青春期ICR小鼠经过连续10天灌胃葛根素后，显示在50mg/kg体重和200mg/kg体重的葛根素灌胃给药可以显著地提升雄性动物生精功能和精液质量。双侧小鼠睾丸的照片显示，相较于对照组的正常健康小鼠，采用200mg/kg体重葛根素灌胃给药的小鼠睾丸体积大小略有增大，睾丸质量指数略有增高；与对照组的正常小鼠相比，50mg/kg体重和200mg/kg体重给药组小鼠睾丸质量指数未见统计学差别(图1A和B)。PAS染色结果显示，50mg/kg体重和200mg/kg体重的葛根素给药可以使小鼠睾丸组织内的生精小管内精子数量显著增多(图1C)。CASA结果显示，50mg/kg体重和200mg/kg体重的葛根素给药可以使小鼠精液质量(精子浓度和活力)较正常健康小鼠明显增高，其中50mg/kg体重的葛根素给药使小鼠精液浓度较正常健康青春期小鼠提高了51.0％，采用200mg/kg体重的葛根素给药使小鼠精液浓度较正常健康青春期小鼠提高了51.9％(图1D)。同时，CASA结果也显示，50mg/kg体重和200mg/kg体重的葛根素给药均可显著地提高正常青春期小鼠的精子活力(图1D)。另外，CASA检测结果显示，葛根素还可以增加精子的游动速度、前向运动能力、平均路径速度(VAP)、曲线速度(VCL)、前向运动速度(VSL)、侧摆幅值(ALH)、鞭打频率(BCF)、STR(精子运动的前向性)、精子的线性度(LIN)等。

表1：CASA检测小鼠精液质量的其余参数

实施例2：葛根素改善环磷酰胺所致的小鼠生殖损伤

2.1实验方法：

2.1.1建立环磷酰胺所致的成年ICR小鼠生殖损伤模型以及葛根素灌胃给药治疗

从南京大学模式动物研究所购买8周龄的成年期ICR雄性小鼠，随机分为3组，每组5只。所有动物饲养在SPF级的动物房中，恒温23±2℃、湿度40±10％、12小时昼夜交替的环境，饲料为普通辐照饲料(AIN-93)。上述小鼠连续5天腹腔注射30mg/kg环磷酰胺、自由饮用蒸馏水，建立环磷酰胺的小鼠生殖损伤模型；再用100mg/kg体重葛根素连续灌胃给药10天。正常组小鼠和环磷酰胺模型组小鼠则连续5天腹腔注射等量生理盐水、自由饮用蒸馏水，再连续灌胃等量生理盐水10天。此后，经过20天的普通饲养，用脊柱脱臼法处死小鼠。称量小鼠体重、睾丸大小、睾丸重量，并用HE染色检测睾丸的组织结构以及CASA检测精液的质量参数。

2.1.2宏观形态的观察

处死小鼠之后，称取小鼠体重。然后用75％酒精消毒小鼠腹部，取出小鼠睾丸，剥离周围脂肪组织，获得纯净双侧小鼠睾丸，拍照、称重并记录。睾丸质量指数的计算公式是：睾丸质量指数＝睾丸重量/体重×100％。

2.1.3睾丸的微观形态观察

将各组小鼠睾丸在睾丸固定液中固定过夜，分级乙醇-水系列脱水，石蜡包埋。切片切成5μm厚。然后，进行伊红-苏木素(HE)染色。在光学显微镜下观察睾丸组织的显微病理结构。

2.1.4 CASA检测精液指标

在麻醉状态下摘除小鼠附睾体，将双侧附睾尾置于2mL 37℃温热的pH＝7.4的HBSS溶液中孵育20min，放在摇床上轻轻摇动，使精子游出。将100μL的混悬液加入400μLHBSS中稀释。将稀释的精子悬液滴放于玻片，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子浓度和活动率等指标。

2.2实验结果

上述所用ICR小鼠经过连续5天腹腔注射环磷酰胺(30mg/kg体重)处理后，显著诱导了小鼠的生殖损伤。这主要体现在：双侧小鼠睾丸的宏观照片显示，相较于正常健康小鼠，环磷酰胺造模小鼠的睾丸体积显著减小，环磷酰胺造模小鼠的双侧睾丸平均重量只有正常健康小鼠组双侧睾丸平均湿重的81.9％，睾丸质量指数显著降低，统计学的t检验显示具有显著差异。与未给药的模型组相比，100mg/kg体重的葛根素治疗组小鼠的双侧睾丸平均湿重得到显著提升，甚至提升至正常健康成年ICR小鼠的94.9％(图1A和B)。PAS染色显示，环磷酰胺造模组的小鼠睾丸组织病理结构显著地被破坏，生精小管空泡化严重；而经葛根素治疗后，小鼠睾丸组织中生精小管损伤明显减轻，生精功能显著恢复(图2C)。CASA结果显示，环磷酰胺造模组的小鼠精液质量较正常健康小鼠显著降低，其中精子浓度只有正常健康小鼠组平均值的59.3％，精子活动力降至正常健康小鼠组的49.5％；而在葛根素治疗组中，精子浓度恢复到正常健康小鼠组的90.4％，精子活动力提升至正常健康小鼠组的81.4％(图1D)。

综上所述，本发明对环磷酰胺处理的ICR成年小鼠和正常青春期ICR小鼠进行灌胃给药葛根素(Puerarin)，实验结果证明，Puerarin可以显著地改善环磷酰胺模型小鼠的精液质量(精子浓度和活力等指标)，而且，Puerarin可以显著地提升正常小鼠的精液质量。因此，Puerarin可用于制备改善化疗所致雄性哺乳动物生殖损伤和提升正常雄性精液质量的产品，本发明具有较好的开发价值和应用前景。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (3)

1.葛根素在制备改善和提升雄性精液质量药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述葛根素的分子通式为：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：采用葛根素制备的药物包括溶液、混悬液、冻干粉针、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放制剂、持续释放制剂和微粒体，上述药物通过口服、静脉、动脉方式进行给药。

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