CN105250295B - 一种联合用药物及其作为免疫调节剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种联合用药物，含有第一活性成分青蒿素，和第二活性成分硫酸羟基氯喹，以及任选的药学可接受的辅料。该联合用药物可以更有效地用于治疗自身免疫性疾病，且能够在保证药效作用不变甚至提高的前提下减少硫酸羟基氯喹的使用量，从而降低硫酸羟基氯喹其毒副作用。

Description

一种联合用药物及其作为免疫调节剂的应用

技术领域

本发明涉及一种含有青蒿素的联合用药物，该联合用药物的活性成分为青蒿素和硫酸羟基氯喹，该联合用药物可以作为免疫调节剂用于治疗自身免疫性疾病。

背景技术

免疫性疾病(immune diseases)是免疫调节失去平衡影响机体免疫应答而引起的疾病。其中，自身免疫性疾病是最典型的免疫性疾病，常见的有系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等，其发病与免疫复合物形成、免疫细胞和细胞因子等免疫异常有关。

硫酸羟基氯喹(Hydroxychloroquine Sulphate，HCQ)为4-氨基喹诺酮类药物。近年来被广泛地应用于治疗各种自身免疫性疾病，并具有较好的疗效，是目前临床治疗免疫性疾病的重要药物。该药具有预防免疫性疾病患者病情严重发作的长期效应。硫酸羟基氯喹治疗免疫性疾病的作用机制较为复杂，目前认为与其免疫抑制及抗炎作用有关。

硫酸羟基氯喹不良反应较多，眼部反应是其最主要的副作用，它分为可逆与不可逆两类。前者包括角膜沉积、凹反射消失和眼调节反射障碍。视网膜病变是其最严重的也是不可逆的药物不良反应，可导致视力下降甚至失明。其他不良反应还包括以头晕头痛为主的中枢神经系统反应，以眼外肌麻痹、骨骼肌软弱为主的神经肌肉反应，以皮肤色素沉着、瘙痒皮疹为主的皮肤反应，以粒细胞缺乏、白细胞减少、血小板减少为主的血液学反应以及以食欲不振、恶心呕吐为表现的胃肠道反应等。

硫酸羟基氯喹疗效显著，至今仍被广泛应用于临床。但不良反应限制了硫酸羟基氯喹的长期用药，影响治疗效果。减少不良反应及毒副作用已经成为了硫酸羟基氯喹临床应用一个急需解决的难题。

化学单体青蒿素(Artemisinin，ART)由我国药学家首先于20世纪70年代从菊科植物黄花蒿中提取分离得到，分子式C₁₅H₂₂O₅，是我国第一个被WHO认可按西药研究标准开发的高效抗疟药。通过近十年的实验及临床研究证实，青蒿素具有一定的抗炎免疫抑制活性。且其不良反应较少，适合长期服用。

目前还没有发现硫酸羟基氯喹与青蒿素能够联合应用，特别是作为免疫调节剂在治疗自身免疫性疾病方面的应用。

发明内容

发明人从外周血细胞因子、细胞免疫功能、体液免疫功能、非特异性免疫功能几个方面对青蒿素和硫酸羟基氯喹配伍后的药效作用进行评价，并与单用硫酸羟基氯喹的药效作用进行比较。发明人令人惊讶地发现青蒿素与硫酸羟基氯喹联合应用，能够在保证药效作用不变甚至提高的前提下减少硫酸羟基氯喹的使用量，从而降低硫酸羟基氯喹其毒副作用。因此，本发明主要涉及以下几个方面。

本发明的第一方面涉及一种联合用药物，含有第一活性成分青蒿素，和第二活性成分硫酸硫酸羟基氯喹，以及任选的药学可接受的辅料。

根据本发明第一方面任一项所述的联合用药物，其中第一活性成分与第二活性成分的重量比为1﹕3～3﹕1。

根据本发明第一方面任一项所述的联合用药物，其中第一活性成分和第二活性成分在同一种制剂单元中，或者第一活性成分和第二活性成分分别在不同的规格制剂单元中。

根据本发明第一方面任一项所述的联合用药物，其中第一活性成分和第二活性成分同时、分别或者依次给药。

本发明的第二方面涉及本发明第一方面任一项所述的联合用药物在制备作为免疫调节剂的药物中的用途，或在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

本发明的第三方面涉及第一活性成分青蒿素和第二活性成分硫酸硫酸羟基氯喹联合用于制备作为免疫调节剂的药物中的用途，或用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

本发明的第四方面涉及一种用于自身免疫性疾的方法，该方法是将第一活性成分青蒿素和第二活性成分硫酸硫酸羟基氯喹联合施用到需要治疗的个体中，或者是本发明第一方面任一项所述的联合用药物施用到需要治疗的个体中。其中第一活性成分和第二活性成分可以同时施用到需要治疗的个体中，也可以分别施用到需要治疗的个体中，还可以依次施用到需要治疗的个体中，例如先施用第一活性成分，间隔一定时间再施用第二活性成分；也可以先施用第二活性成分，间隔一定时间再施用第一活性成分。

本发明中，所述的自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、痛风关节炎、皮肌炎、肾病综合征或干燥综合征。

发明的有益效果

本发明的联合用药物中，第一活性成分青蒿素与第二活性成分硫酸硫酸羟基氯喹二者连用能够在保证药效作用不变甚至提高的前提下减少硫酸硫酸羟基氯喹的使用量，从而降低其毒副作用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实验例1 青蒿素和硫酸羟基氯喹联用治疗免疫性疾病药效学实验

硫酸羟基氯喹(Hydroxychloroquine Sulphate，HCQ，以下简称H)为临床用于治疗免疫性疾病的重要药物，但具有明显毒副作用，限制其临床应用。本实验运用青蒿素(Artemisinin，ART，以下简称A)与硫酸羟基氯喹进行配伍(以下简称AH)，降低硫酸羟基氯喹的使用量，从外周血细胞因子、细胞免疫功能、体液免疫功能、非特异性免疫功能几个方面对AH配伍后的药效作用进行评价，并与单用硫酸羟基氯喹的药效作用进行比较。本实验的研究结果对AH治疗免疫性疾病的临床应用发展具有重大意义。

1.实验材料

1.2药品与试剂

青蒿素：四川同人泰药业有限公司，批号：130602，纯度98.8％。

硫酸羟基氯喹：重庆康乐制药有限公司，批号：SQK-130403,纯度98.7％，碱基含量77.40％。

醋酸泼尼松片：广东华南药业集团有限公司，批号：120202，规格：5mg×100片。

脂多糖(LPS)：Sigma，L-2880，规格：10mg/瓶。

IFN-γELISA试剂盒：北京诚林生物科技有限公司，批号：201410。

TNF-αELISA试剂盒：北京诚林生物科技有限公司，批号：201410。

淋巴细胞分离液：天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：20140319，规格：100ml/瓶。

植物血球凝集素(PHA-P)：Sigma，L-8754，5mg/瓶。

噻唑蓝：Sigma，批号：yk201102，规格：1g/瓶。

RPMI1640培养基：赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，批号：NZB1076，规格：500ml/瓶。

胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司，批号：140402，规格：100ml/瓶。

青霉素：哈药集团制药总厂，批号：A1309018，规格：160万单位/瓶。

链霉素：深圳华药南方制药有限公司，批号：N110608，规格：100万单位/瓶。

二甲基亚砜：广州化学试剂厂，批号：20120601-1，规格：500ml/瓶。

磷酸二氢钾：天津市福晨化学试剂厂，批号：20100202，规格500g/瓶。

磷酸氢二钠：天津市福晨化学试剂厂，批号：20090907，规格500g/瓶

氯化钾：天津市福晨化学试剂厂，批号：20120912，规格500g/瓶。

柠檬酸三钠：天津市福晨化学试剂厂，批号：20130305，规格500g/瓶。

柠檬酸：天津市福晨化学试剂厂，批号：20130122，规格500g/瓶。

无水葡萄糖：天津市福晨化学试剂厂，批号：20120602，规格500g/瓶。

氯化钠：广东光华科技股份有限公司，批号：201307013，规格500g/瓶。

珠江墨汁：广州金箭办公用品制造厂，规格：230ml/瓶。

无水碳酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20130110，规格：500g/瓶。

生理盐水：广东艾希德药业有限公司，批号：131126209，规格：500ml/瓶。

无水乙醇：广东光华科技股份有限公司，批号：20130719，规格：500ml/瓶。

1.2实验用溶媒

名称：纯净水。

来源：新南方药物安全性评价中心实验动物室纯净水系统。

1.3实验动物

1.3.1品系和等级、数量和性别、年龄及来源

1.3.1.1KM小鼠：SPF级，体重18g～22g，雌性50只，雄性50只，用于AH对炎症小鼠外周血细胞因子的影响试验，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002，实验动物质量合格证号：No.44007200008757；KM小鼠：SPF级，体重18g～22g，雌性50只，雄性50只，用于AH对小鼠细胞免疫的影响作用试验，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002，实验动物质量合格证号：No.44007200008757；KM小鼠：SPF级，体重18g～22g，雌性50只，雄性50只，用于AH对小鼠体液免疫的影响作用试验，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002，实验动物质量合格证号：No.44007200009477；KM小鼠：SPF级，体重18g～22g，雌性55只，雄性55只，用于AH对小鼠非特异性免疫的影响作用试验，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002，实验动物质量合格证号：No.44007200009767。

1.3.1.2Hartley豚鼠：普通级，体重250g～350g，雌性1只，雄性2只，用于AH对小鼠体液免疫的影响作用试验，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2014-0035，实验动物质量合格证号：No.44411600000234。

1.4实验动物的识别方法

1.4.1小鼠的识别方法：接收小鼠后，先给以小鼠临时编号：采用笼号和笼内编号共同进行标记，笼上标签标示笼号，鼠尾上用记号笔划环形圈标示笼内鼠号；适应性饲养观察结束后，将正式纳入试验的小鼠以小鼠皮肤染色和笼具双重编号标记识别。小鼠皮肤染色采用二色涂染法，用苦味酸(黄色)染色标记作为个位数，用硝酸银溶液(咖啡色)染色标记作为十位数。在笼具上张贴专用标签，标示专题编号、动物类别、组别、性别、给药途径、笼号、动物编号、专题负责人及预计动物室使用时间等信息。

1.4.2豚鼠的识别方法：接收豚鼠后，先给以豚鼠临时编号：采用笼号和笼内编号共同进行标记，笼上标签标示笼号，鼠耳上用记号笔划环形圈标示笼内鼠号；适应性饲养观察结束后，将正式纳入试验的豚鼠以豚鼠皮肤染色和笼具双重编号标记识别。豚鼠皮肤染色采用二色涂染法，用苦味酸(黄色)染色标记作为个位数，用硝酸银溶液(咖啡色)染色标记作为十位数。在笼具上张贴专用标签，标示专题编号、动物类别、组别、性别、给药途径、笼号、动物编号、专题负责人及预计动物室使用时间等信息。

1.5适应性饲养过程：自接收之日起，小鼠、豚鼠均进行2～3天的适应性饲养观察，每天观察1次；观察小鼠、豚鼠的体重、精神状态、行为活动、被毛、摄食、眼睛、粪便、会阴部等均未见异常，亦未见其它异常症状及体征。所有健康动物纳入正式试验。

1.6实验动物饲养管理及环境条件

1.6.1小鼠饲养管理及环境条件：小鼠饲养于公司动物房D区D₆房；实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2013-0014。室温20℃～25℃，湿度40％～70％，照明采用12h/12h昼夜明暗交替。小鼠饲养在无毒、耐高压、耐高温、耐腐蚀的塑料盒中，雌雄分开，实验开始后每笼7只，自由摄食、饮水。每周更换饮水瓶1次、更换饮水3次；每周更换塑料鼠盒1次、垫料2次。环境设施符合试验动物SPF级等级要求，实验动物使用证号：SYXK(粤)2013-0014；动物实验设施使用证号：00088582、00088581、00090108、00090701。

1.6.2豚鼠饲养管理及环境条件：豚鼠饲养于公司动物房普通区；实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2013-0014。室温16℃～26℃，湿度40％～70％，照明采用12h/12h昼夜明暗交替。环境设施符合试验动物SPF级等级要求，实验动物使用证号：SYXK(粤)2013-0014；动物实验设施使用证号：00090108。

1.7饲料、垫料及饮用水

饲料：SPF级灭菌鼠料，豚鼠维持配合饲料，由广东省医学实验动物中心提供。

垫料：垫料由广东省医学实验动物中心提供。

饮用水：为纯净水，来自公司实验动物室纯净水系统。

2.主要实验仪器

百分之一电子天平：TP-1102，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

十万分之一分析天平：BP121S，Sartorius(赛多利斯)。

新世纪紫外可见分光光度计：T6，北京普析通用仪器有限责任公司。

数显恒温水浴箱：HH-6，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

酶标仪:ELX800UV，美国BIO-TEC。

微量有机分析专用超纯水机：颐洋企业发展有限公司。

恒温生化培养箱：GI7-2，美国SHELDON公司。

移液枪：5-50μL、10-100μL、20-200μL、100-1000μL，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司。

自动高压灭菌锅：HVE-50，日本HIRAYAMA公司。

电热恒温鼓风干燥箱：9070B，上海佳胜实验设备有限公司。

生物显微镜：CX31，奥林巴斯株式会社。

生物显微镜：BX63，奥林巴斯株式会社。

二氧化碳细胞培养箱：BC-J160S，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

振荡机：TS-1，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

冰箱：BCD-215DK，青岛海尔股份有限公司。

小型离心机：1-14，Sigma。

低速离心机：SC-3616，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

洁净工作台：BC-2CD，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

3.剂量设计及分组

AH为青蒿素与硫酸羟基氯喹配伍，硫酸羟基氯喹成人临床拟用剂量为200mg·d^-1，以此为基础，为降低硫酸羟基氯喹的使用剂量，拟定AH给药总量为200mg·d^-1，其中配伍青蒿素，以不同剂量的青蒿素代替部分硫酸羟基氯喹。按成人60公斤体重计算，则AH每日人拟用剂量为3.33mg·kg^-1·d^-1。其小鼠的等效剂量约为33.33mg·kg^-1·d^-1。本实验小鼠按每日总给药量33.33mg·kg^-1·d^-1设AH＝1:3组(8.33mg青蒿素+25mg硫酸羟基氯喹)·kg^-1·d^-1、AH＝1:1组(16.67mg青蒿素+16.67mg硫酸羟基氯喹)·kg^-1·d^-1、AH＝3:1组(25mg青蒿素+8.33mg硫酸羟基氯喹)·kg^-1·d^-1三个剂量组。硫酸羟基氯喹组药物剂量为33.33mg·kg^-1·d^-1。阳性对照药醋酸泼尼松药物剂量，即等于临床拟用剂量，为10.00mg·kg^-1·d^-1。见表1。

表1 AH对KM小鼠药效学试验剂量设计

4.统计分析

以“均值±标准差(±s)”表示。试验数据采用SPSS17.0统计分析软件包进行统计处理，符合正态分布检验和方差齐性检验，则进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)；不符合正态分布检验和方差齐性检验，则进行Kruskal-Wallis H检验。

5.实验方法与结果

5.1AH对炎症小鼠外周血细胞因子的影响

选取适应性饲养观察合格的KM小鼠70只，雌雄各半，体重18g～22g，随机分为7组，每组10只，即正常对照组、模型对照组、硫酸羟基氯喹组、AH＝1:3组、AH＝1:1组、AH＝3:1组、醋酸泼尼松组。各药物组于每天上午按20mL·kg^-1·d^-1容积灌胃给药，每天1次，连续14天，正常对照组和模型对照组给予等容积纯净水。末次给药后，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组腹腔注射5mg·kg^-1LPS。150min后，摘除眼球采血，静置30min，3000r/min离心取上清，ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α含量，处死小鼠，取胸腺及脾脏称重，计算胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数(mg/10g)＝胸腺重量/小鼠体重×10；脾脏指数(mg/10g)＝脾脏重量/小鼠体重×10。

结果：与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清中IFN-γ含量明显降低(P﹤0.01)，

TNF-α含量明显升高(P﹤0.01)，表明LPS致小鼠炎症模型造模成功。AH＝1:3组血清IFN-γ含量明显高于模型对照组(P﹤0.01)，且高于硫酸羟基氯喹组(P﹤0.05)；TNF-α含量明显低于模型对照组(P﹤0.05)。AH＝1:3组、AH＝1:1组及AH＝3:1组小鼠的胸腺指数低于模型对照组，但无统计学意义，作用不明显。AH＝1:3组及AH＝1:1组小鼠的脾脏指数明显低于模型对照组(P﹤0.05)。上述结果表明，AH＝1:3能够提高血清中的IFN-γ含量，减少TNF-α含量，降低小鼠的脾脏指数，有较好的抗炎作用。结果见表2、3、4。

表2 AH对炎症小鼠外周血细胞因子的影响(±s，n＝10)

注：模型对照组与正常对照组比较，^△P﹤0.05，^△△P﹤0.01；各药物组与模型对照组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01；三个药物剂量组与硫酸羟基氯喹组比较，^#P﹤0.05，^##P﹤0.01。

表3 AH对炎症小鼠胸腺指数的影响(±s，n＝10)

注：模型对照组与正常对照组比较，^△P﹤0.05，^△△P﹤0.01；各药物组与模型对照组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01；三个药物剂量组与硫酸羟基氯喹组比较，^#P﹤0.05，^##P﹤0.01。

表4 AH对炎症小鼠脾脏指数的影响(±s，n＝10)

注：模型对照组与正常对照组比较，^△P﹤0.05，^△△P﹤0.01；各药物组与模型对照组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01；三个药物剂量组与羟基氯喹组比较，^#P﹤0.05，^##P﹤0.01。

5.2AH对小鼠细胞免疫的影响作用

选取适应性饲养观察合格的KM小鼠72只，雌雄各半，体重18g～22g，随机分为6组，每组12只，即正常对照组、硫酸羟基氯喹组、AH＝1:3组、AH＝1:1组、AH＝3:1组、醋酸泼尼松组。各药物组于每天上午按20mL·kg^-1·d^-1容积灌胃给药，每天1次，连续25天，正常对照组给予等容积纯净水。末次给药后眼眶取血，分离淋巴细胞。在96孔板中添加100μl淋巴细胞液和100μl12.5μg·mL^-1PHA-P液，对照组则添加100μlRPMI1640培养液。在5％CO₂培养箱中37℃培养72h后，于每孔中分别添加50μl5mg·mL^-1MTT液，再培养4h，终止培养，小心吸去培养液，加入二甲基亚砜150μl/孔，溶解由细胞代谢MTT而产生的紫色沉淀，轻微震荡后在酶联免疫检测仪上(吸收波长为570nm处)测吸光值(OD)，以刺激指数(SI)表示淋巴细胞转化率。刺激指数(SI)＝试验孔OD均值/对照孔OD均值。

结果：数据分析显示，AH＝1:3组、AH＝1:1组及AH＝3:1组的淋巴细胞转化低于正常

对照组(P﹤0.01)，表明AH＝1:3、AH＝1:1及AH＝3:1能够抑制细胞免疫作用，显著降低小鼠淋巴细胞转化率。结果见表5。

表5 AH对小鼠细胞免疫的影响作用(±s，n＝12)

注：与正常对照组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01；三个药物剂量组与硫酸羟基氯喹组比较，^#P﹤0.05，^##P﹤0.01。

5.3AH对小鼠体液免疫的影响作用

选取适应性饲养观察合格的KM小鼠72只，雌雄各半，体重18g～22g，随机分为6组，每组12只，即正常对照组、硫酸羟基氯喹组、AH＝1:3组、AH＝1:1组、AH＝3:1组、醋酸泼尼松组。各药物组于每天上午按20mL·kg^-1·d^-1容积灌胃给药，每天1次，连续15天，正常对照组给予等容积纯净水。小鼠灌胃给药第9天，每只小鼠腹腔注射5％生理盐水鸡红细胞混悬液0.2mL进行免疫，第二天继续给药。免疫6天后小鼠摘眼球取血，分离血清，用生理盐水稀释100倍。受试物组各取稀释血清1mL，然后各组均依次加入5％鸡红细胞混悬液0.5mL，10％补体0.5mL，混匀后置37℃恒温水浴锅中保温30min，然后移至0℃冰箱中10min终止反应。2000rpm离心10min，取上清液，于分光光度计540nm处分别测定各管吸光度值。另设无小鼠血清的补体和鸡红细胞混悬液作为空白对照管，同样操作，取上清液作为比色时调“0”的基准。以光密度(OD)读数作为判定血清溶血素的指标，比较各组的差异。

结果：数据分析显示，AH＝1:3组及AH＝1:1组的血清溶血素含量低于正常对照组(P﹤0.01)，且低于硫酸羟基氯喹组(P﹤0.05)，表明AH＝1:3组及AH＝1:1能够抑制体液免疫作用，显著降低小鼠血清溶血素含量。结果见表6。

表6 AH对小鼠体液免疫的影响作用(±s，n＝12)

注：与正常对照组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01；三个药物剂量组与硫酸羟基氯喹组比较，^#P﹤0.05，^##P﹤0.01。

5.4AH对小鼠非特异性免疫的影响作用

选取适应性饲养观察合格的KM小鼠72只，雌雄各半，体重18g～22g，随机分为6组，每组12只，即正常对照组、硫酸羟基氯喹组、AH＝1:3组、AH＝1:1组、AH＝3:1组、醋酸泼尼松组。各药物组于每天上午按20mL·kg^-1·d^-1容积灌胃给药，每天1次，连续15天，正常对照组给予等容积纯净水。于末次给药30min后尾静脉注射20％墨汁0.lmL/10g，2min后用毛细管(预先用肝素溶液湿润)从眼眶后静脉丛取20ul血液溶于2mL0.1％碳酸钠溶液中摇匀，再过l0min后从眼眶后静脉丛取20ul血液溶于2mL0.1％碳酸钠溶液中摇匀，在751分光光度计600nm处分别测定吸收度(OD值)。同时将各组小鼠称体重并取肝脏、脾脏称重。计算碳粒廓清指数K及吞噬指数α。α的计算公式如下：

K＝(logOD₁-logOD₂)/(t₂-t₁)

其中：OD₁为尾静脉注射墨汁2分钟后取血溶于碳酸钠溶液所测吸光度值；

OD₂为尾静脉注射墨汁12分钟后取血溶于碳酸钠溶液所测吸光度值；

t₁为第一次取血时间；

t₂为第二次取血时间。

α＝(×小鼠体重)/(肝脏重量+脾脏重量)。

结果：AH＝1:3组的碳粒廓清指数K低于正常对照组(P﹤0.01)；AH＝1:3组的吞噬指数α低于正常对照组(P﹤0.01)。表明AH＝1:3能够抑制非特异性免疫作用，显著降低小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α。结果见表7、表8。

表7 AH对小鼠碳粒廓清指数K的影响作用(±s，n＝12)

注：与模型对照组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01；三个药物剂量组与硫酸羟基氯喹组比较，^#P﹤0.05，^##P﹤0.01。

表8 AH对小鼠吞噬指数α的影响作用(±s，n＝12)

注：与模型对照组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01；三个药物剂量组与硫酸羟基氯喹组比较，^#P﹤0.05，^##P﹤0.01。

6.结论

上述实验结果表明，AH＝1:3、AH＝1:1及AH＝3:1三个剂量组具有以下药理作用：

6.1抗炎作用

AH＝1:3组血清IFN-γ含量明显高于模型对照组，且高于硫酸羟基氯喹组；TNF-α含量明显低于模型对照组。表明AH＝1:3能够提高血清中的IFN-γ含量，减少TNF-α含量，有较好的抗炎作用。

AH＝1:3及AH＝1:1能显著降低小鼠的脾脏指数。

6.2抑制淋巴细胞转化率的作用

AH＝1:3组、AH＝1:1组及AH＝3:1组的淋巴细胞转化低于正常对照组，表明AH＝1:3、AH＝1:1及AH＝3:1能够抑制细胞免疫作用，显著降低小鼠淋巴细胞转化率。

6.3抑制体液免疫作用

AH＝1:3组及AH＝1:1组的血清溶血素含量低于正常对照组，且低于硫酸羟基氯喹组，表明AH＝1:3组及AH＝1:1能够抑制体液免疫作用，显著降低小鼠血清溶血素含量。

6.4抑制非特异性免疫的作用

AH＝1:3组的碳粒廓清指数K低于正常对照组；表明AH＝1:3能够抑制非特异性免疫作用，显著降低小鼠碳粒廓清指数K。

AH＝1:3组的吞噬指数α低于正常对照组；表明AH＝1:3能够抑制非特异性免疫作用，显著降低小鼠吞噬指数α。

在各个实验指标中，AH＝1:3、AH＝1:1及AH＝3:1三个剂量组的药效作用与硫酸羟氯喹组比较，结果如下：

注：+表示药效作用优于硫酸羟基氯喹；＝表示药效作用与硫酸羟基氯喹相当；-表示药效作用低于硫酸羟基氯喹。

实验结果表明AH＝1:3能显著升高炎症小鼠血清中的IFN-γ含量，同时也能显著降低炎症小鼠血清中的TNF-α含量；AH＝1:3及AH＝1:1可降低炎症小鼠的脾脏指数；AH＝1:3，AH＝1:1和AH＝3:1均可降低小鼠淋巴细胞转化率；AH＝1:3及AH＝1:1还可以降低小鼠血清溶血素含量；AH＝1:3亦可降低小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α。综上，AH＝1:3具有较好的抗炎免疫抑制作用，AH＝1:1次之。AH＝1:3、AH＝1:1及AH＝3:1三个剂量组的药效作用基本上与硫酸羟基氯喹组相当，其中AH＝1:3升高炎症小鼠血清中IFN-γ含量的作用及AH＝1:3、AH＝1:1降低小鼠血清溶血素含量的作用优于硫酸羟基氯喹。AH配伍使用可降低硫酸羟基氯喹的使用剂量，减少其毒副作用，同时能增加药物效应，本实验的研究结果对其临床应用具有重要意义。

实验例2青蒿素急性毒性试验

观察研究昆明种(KM)小鼠24h内3次灌胃给予青蒿素，在一定时间内所产生的毒性反应，了解其急性毒性作用剂量。

1.材料

1.1供试品

1.1.1青蒿素(Artemisinin，ART，以下简称“A”)：四川同人泰药业有限公司，批号：130602，纯度98.8％；

1.1.2硫酸羟基氯喹(Hydroxychloroquine Sulphate，HCQ，以下简称“H”)：重庆康乐制药有限公司，批号：SQK-130403,纯度98.7％，碱基含量77.40％。

1.2药物配制

使用BS210S电子天平(万分之一)称量，加入2～3滴吐温80于乳钵中充分研磨配成混悬液，再以蒸馏水稀释成试验设计所需浓度，每次用药均在给药前配制。

1.3动物及分组

1.3.1试验动物：昆明远交系小白鼠(KM)，体重20±2g，鼠龄4～5周。每组4～10只，雌雄各半。合格证号：SCXK(粤)2013-0020，符合GB14922.0—2001试验动物SPF级。小鼠及饲料、垫料均购于广东省医学试验动物中心。小鼠自由进食及饮水。

1.3.2试验动物房：动物饲养室温度23±2℃，相对湿度70±10％。日通气4次，每次1小时，日照明12小时。

2.实验方法

按预试验结果，急性毒性试验采取最大给药量方法。KM小鼠按性别及体重分层，随机分为2组[给药组(18.0g青蒿素/kg)和溶媒组(纯净水)]，每组20只，♀♂各10只，各组均按40mL/kg体重灌胃给药3次，两次给药间隔4小时；每次灌胃给药后连续4小时观察小鼠出现的症状及症状起始的时间等情况。药后连续观察14天，每天上下午各1次，观察小鼠外观、行为、精神、对刺激的反应、分泌物、排泄物等。所有小鼠均进行大体解剖，肉眼观察其器官体积、颜色、质地的改变(若任何器官出现体积、颜色、质地等改变时，均进行组织病理学检查)；在D₀、D₁、D₇、D₁₄测量体重，在D_0～1、D_6～7、D_13～14测量摄食量；并计算最大给药量。

3.实验结果

一般临床观察：给药组20只小鼠(♀♂各10只)每次给药后，鼻孔无明显阻塞，未见竖毛现象；未见异常分泌物及排泄物，眼睑未见异常表现，体温正常，皮肤未见水肿和红斑。给药组小鼠给药后症状主要表现为少动、呼吸急促，一般出现在每次灌胃后1min～3min，症状持续时间1min～3min；分析原因可能与小鼠灌服高浓度高体积的药液有关。溶媒组20只小鼠(♀♂各10只)由试验开始至第3次灌胃给药后4小时未见明显异常症状。从D₁～D₁₄每天上下午各观察1次，在此期间，小鼠精神状态较好，外观未见异常表现，行为活动正常，未见异常分泌物及排泄物，至试验结束时无小鼠死亡。

体重：给药组雌性小鼠、雄性小鼠在D₀、D₁、D₇、D₁₄与溶媒组比较，差异无显著性(P＞0.05)；

摄食量：给药组雌性小鼠、雄性小鼠在D_0～1、D_6～7、D_13～14与溶媒组比较，差异无显著性(P＞0.05)；

病理学检查：给药组与溶媒组小鼠在观察期结束时按计划处死，大体解剖肉眼观察其体表完整、被毛柔顺、无外伤及破溃等；皮下无出血点及色素沉着等；腹腔、胸腔无积水，脏器位置正常；各器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。

4.结论

在本实验条件下，对KM小鼠24h内3次灌胃给予青蒿素，给药浓度为150mg青蒿素/mL，给药容积为40mL/kg，两次给药间隔4h，每次给药后连续观察4小时；给药组小鼠药后少动、呼吸急促症状，判断可能是小鼠灌服高浓度高体积的药液所致。连续观察14天，在此期间，小鼠精神状态较好，外观未见异常表现，行为活动正常，未见异常分泌物及排泄物，至试验结束时无小鼠死亡。青蒿素对小鼠体重、摄食量无明显影响。给药组小鼠观察期结束时按计划处死，大体解剖肉眼观察各器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。青蒿素对KM小鼠最大给药量为18.0g青蒿素/kg，为临床人拟用剂量的4320倍。

实验例3硫酸羟基氯喹急性毒性试验

观察研究KM小鼠1次灌胃给予硫酸羟基氯喹，在一定时间内所产生的毒性反应，了解其急性毒性作用剂量。

1.材料

同实验例2。

2.实验方法

按预试验的D_m(100％死亡的最大剂量)和D_n(0％死亡的最小剂量)结果，D_m取4000mg/kg，D_n取1500mg/kg，组间距为1﹕0.78，将KM小鼠随机分为5个给药组[4000mg/kg、3120mg/kg、2434mg/kg、1898mg/kg、1481mg/kg]和1个溶媒对照组(纯净水)，每组10只，♀♂各5只。各组均按10mL/kg体重灌胃给药1次；药后连续6小时观察小鼠出现的症状、症状起始的时间、持续时间、死亡时间、濒死前反应等情况。药后连续观察14天，每天上下午各1次，观察小鼠外观、行为、精神、对刺激的反应、分泌物、排泄物等。所有小鼠均进行大体解剖，肉眼观察其器官体积、颜色、质地的改变(若任何器官出现体积、颜色、质地等改变时，均进行组织病理学检查)。在D₀、D₁、D₇、D₁₄测量体重。用Bliss法计算半数致死量(LD₅₀)及其95％可信限。

3.实验结果

一般临床观察：给药组小鼠灌胃给予各剂量硫酸硫酸羟基氯喹，给药后出现活动减少、抽搐、呼吸困难等毒性症状。60％小鼠死亡发生在药后1h内，存活小鼠大部分出现毒性症状后逐渐恢复正常。给药剂量越大，中毒症状出现的时间越早，小鼠死亡数越多。溶媒对照组(纯净水)：10只小鼠(♀♂各5只)由试验开始至给药后6小时未见明显异常症状；至试验结束未见小鼠死亡。连续观察14天，每天上下午各1次；在此期间，存活小鼠精神状态较好，外观未见异常表现，行为活动正常，未见异常分泌物及排泄物。

体重：2434mg/kg组雄鼠在D₁、D₇较溶媒对照组体重降低，1898mg/kg组雌鼠在D₁较溶媒对照组体重降低，1481mg/kg组雌鼠、雄鼠在D₁较溶媒对照组体重降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；其它剂量组雌性、雄性小鼠在D₀、D₁、D₇、D₁₄与溶媒对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

病理学检查：对观察期内死亡小鼠及观察期结束时按计划处死的小鼠进行大体剖检，肉眼观察其体表完整、被毛柔顺，无外伤及破溃等；皮下无出血点及色素沉着等；腹腔胸腔无积水、脏器位置正常；各器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。

硫酸硫酸羟基氯喹对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验死亡时间和死亡情况见表9。

表9 硫酸羟基氯喹对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验死亡时间和死亡情况

硫酸羟基氯喹对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验LD₅₀的计算如下表10所示。

表10 硫酸羟基氯喹对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验LD₅₀的计算

计算结果 (本底死亡率为:0％)

中间结果第3轮

注:g值＝0.214 g>0.1,不可忽略应作Feiller校正

异质性的全面校正

注:χ2值＝3.676P值＝0.299不必作异质性校正

根据表9和表10结果计算LD₅₀：硫酸羟基氯喹半数致死量LD₅₀＝2156.178mg/kg，95％可信限＝(1895.476～2452.736)mg/kg。

4.结果讨论

给药组小鼠中毒症状一般表现在药后6小时内，在此期间，给药组小鼠不进食或少进食，而溶媒对照组小鼠在此期间则正常进食，故给药组小鼠在D₁与溶媒对照组比较体重降低，2434mg/kg组雄鼠体重在D₇天仍降低，其它剂量组小鼠体重D₇、D₁₄未见异常。由于动物数较少，且只有个别给药组表现出体重与溶媒对照组比较有显著性差异，故不能认为对硫酸羟基氯喹KM小鼠体重有明显影响。

5.结论

在本实验条件下，硫酸羟基氯喹对KM小鼠24小时内1次灌胃给药，给药后出现少动、抽搐、呼吸困难等毒性症状，病理学检查结果显示未见异常。硫酸羟基氯喹半数致死量LD₅₀＝2156.178mg/kg，95％可信限＝(1895.476～2452.736)mg/kg。

实验例4青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方1﹕1)小鼠急性毒性试验

观察研究KM小鼠1次灌胃给予青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方1﹕1)，在一定时间内所产生的毒性反应，了解其急性毒性作用剂量。

1.材料

同实验例2。

2.实验方法

按预试验的D_m(100％死亡的最大剂量)和D_n(0％死亡的最小剂量)结果，D_m取8000mg/kg，D_n取4000mg/kg，组间距为1﹕0.84，将KM小鼠随机分为5个给药组[8000mg/kg、6720mg/kg、5645mg/kg、4742mg/kg、3983mg/kg]和1个溶媒对照组(纯净水)，每组10只，♀♂各5只。各组均按20mL/kg体重灌胃给药1次；药后连续6小时观察小鼠出现的症状、症状起始的时间、持续时间、死亡时间、濒死前反应等情况。药后连续观察14天，每天上下午各1次，观察小鼠外观、行为、精神、对刺激的反应、分泌物、排泄物等。所有小鼠均进行大体解剖，肉眼观察其器官体积、颜色、质地的改变(若任何器官出现体积、颜色、质地等改变时，均进行组织病理学检查)。在D₀、D₁、D₇、D₁₄测量体重。用Bliss法计算半数致死量(LD₅₀)及其95％可信限。

3.实验结果

一般临床观察：给药组小鼠灌胃给予各剂量青蒿素硫酸羟基氯喹，给药后出现活动减少、抽搐、呼吸困难等毒性症状。64％小鼠死亡发生在药后1小时内，存活小鼠大部分出现毒性症状后逐渐恢复正常。给药剂量越大，中毒症状出现的时间越早，小鼠死亡数越多。溶媒对照组(纯净水)：10只小鼠(♀♂各5只)由试验开始至给药后6h未见明显异常症状；至试验结束未见小鼠死亡。连续观察14天，每天上下午各1次；在此期间，存活小鼠精神状态较好，外观未见异常表现，行为活动正常，未见异常分泌物及排泄物。

体重：各剂量组雌性、雄性小鼠在D₀、D₁、D₇、D₁₄与溶媒对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

病理学检查：对观察期内死亡小鼠及观察期结束时按计划处死的小鼠进行大体剖检，肉眼观察其体表完整、被毛柔顺，无外伤及破溃等；皮下无出血点及色素沉着等；腹腔胸腔无积水、脏器位置正常；各器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。

青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方1﹕1)对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验死亡时间和死亡情况见表11。

表11 硫酸羟基氯喹对小鼠灌胃给药急性毒性试验死亡时间和死亡情况

青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方1﹕1)对小鼠灌胃给药急性毒性试验LD₅₀的计算如表12所示。

表12AH对小鼠灌胃给药急性毒性试验LD₅₀的计算

计算结果 (本底死亡率为:0％)

中间结果第4轮

注:χ2值＝2.695P值＝0.441不必作异质性校正

由表11、表12结果计算LD₅₀：青蒿素硫酸羟基氯喹半数致死量LD₅₀＝5022.517mg/kg，95％可信限＝(4633.736～5443.917)mg/kg。

4.实验结论

在本实验条件下，青蒿素硫酸羟基氯喹对KM小鼠24h内1次灌胃给药，给药后出现活动减少、抽搐、呼吸困难等毒性症状，病理学检查结果显示未见异常。青蒿素硫酸羟基氯喹半数致死量LD₅₀＝5022.517mg/kg，95％可信限＝(4633.736～5443.917)mg/kg。

实验例5.AH复方配伍减毒作用研究

通过测定1:1配伍的AH复方及其各组分单药A和H的小鼠LD₅₀(参见实施例2-4)，计算复方配伍的毒性联合作用系数Q，为评价AH复方配伍减毒作用提供理论和实验依据。

以Bliss法计算各药的LD₅₀，用Finney公式计算复方配伍(混合毒物)的联合作用系数：Q＝复方LD₅₀理论值/复方LD₅₀实测值，若小于1则为减毒；大于1为增毒；等于1为相加。联合作用系数计算结果见表13。

(a、h分别为A药和H药在复方中比例，即各占50％)

表13 AH复方及其组分LD₅₀和联合作用系数结果

由表13结果可知，AH复方的LD₅₀为5022.5mg/kg，组分H的LD₅₀为2156.2mg/kg，A测得最大耐受量为18000mg/kg，因此可以认为A药的LD₅₀为>18000mg/kg。通过Finney公式计算AH复方LD₅₀的理论值为3852.1～4314.1，药物毒性联合作用系数Q值为0.767～0.859<1，说明AH复方配伍具有减毒作用。

Claims (7)

1.一种作为免疫抑制剂的联合用药物，含有第一活性成分青蒿素，和第二活性成分硫酸羟基氯喹，以及任选的药学可接受的辅料；其中，第一活性成分与第二活性成分的重量比为1﹕3～1﹕1。

2.权利要求1的联合用药物，其被用于治疗自身免疫性疾病。

3.权利要求1-2任一项的联合用药物，其中第一活性成分和第二活性成分在同一种制剂单元中，或者第一活性成分和第二活性成分分别在不同的规格制剂单元中。

4.权利要求1的联合用药物，其中第一活性成分和第二活性成分同时、分别或者依次给药。

5.权利要求1-4任一项所述的联合用药物在制备作为免疫抑制剂的药物中的用途，或在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

6.第一活性成分青蒿素和第二活性成分硫酸羟基氯喹联合用于制备作为免疫抑制剂的药物中的用途，或在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途；其中，第一活性成分青蒿素与第二活性成分硫酸羟基氯喹的重量比为1﹕3～1﹕1。

7.权利要求5或6的用途，其中所述的自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、痛风关节炎、皮肌炎、肾病综合征或干燥综合征。