CN104189099A

CN104189099A - 肉苁蓉苯乙醇苷提取物在防治高原病中的应用

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Publication number: CN104189099A
Application number: CN201410270792.4A
Authority: CN
Inventors: 陶义存; 毛新民; 李琳琳; 骆新; 王烨; 靳春丽
Original assignee: Xinjiang Medical University
Current assignee: Xinjiang Medical University
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明公开了肉苁蓉苯乙醇苷提取物在防治高原病中的应用，申请人通过实验证实肉苁蓉苯乙醇苷提取物可以通过抗缺氧、抗炎、抗氧化应激及调节水通道蛋白表达，使得生物体适应高原缺氧环境，预防脑水肿和肺水肿的发生。此外治疗给药实验证实肉苁蓉苯乙醇苷提取物可以降低慢性高原病大鼠四肢水肿发生率及死亡率，并能有效降低慢性高原病大鼠的肺动脉高压和心室肥厚程度，改善心肺病理改变。相应的，本发明还公开了一种含有肉苁蓉苯乙醇苷提取物的防治高原病的药物组合物。

Description

肉苁蓉苯乙醇苷提取物在防治高原病中的应用

技术领域

本发明涉及肉苁蓉苯乙醇苷提取物在防治高原病中的应用，属于药理学领域。

背景技术

我国是世界上高原面积最大的国家，而我国地势整体呈西高东低分布，使得位于西北及西部边陲的国界线主要为高原地形。新疆、西藏两个自治区面积占到我国总面积30％以上，资源富集，拥有我国陆地边境线的很大部分，战略地位极为重要。新疆西藏矿藏和旅游资源极其丰富，随着陆路国际通道的打通，两地的能源开发及旅游业将获得长足发展，成为重要的经济支点。大力发展西部，对国家经济建设及稳定具有重要意义。西部一些重要矿业和经济开发区海拔高度达到4000米至5000米，所以国家能源基地等四个基地的建设以及旅游业的长足发展必然会带来大量的平原居住环境者进入高原环境，加上我国生活在海拨3000米以上的人群有近6千万，所以防治由高原极端环境引发的高原病将极为重要。

常见的高原极端环境包含高寒低压低氧环境、干热的沙漠戈壁环境，高辐射环境等重要组成因素。高原病是由于人体对高原低压性缺氧不适应，导致机体病理生理上一系列改变而引起的各种临床表现的总称。该病一般分为急性和慢性两类。急性高原病(Acute mountain sickness，AMS)指初入高原(海拔3000米以上)时出现的急性缺氧反应或疾病，轻型急性高原病即急性高原反应；重型急性高原病又分为：高原脑水肿(high altitude cerebral edema，HACE)、高原肺水肿(high altitude pulmonary edema，HAPE)、混合型。慢性高原病(Chronic mountain sickness，CMS)指原有急性高原病症状迁延不愈或抵高原后半年以上方发病者。中国将慢性高原病又分为：高原心脏病、高原红细胞增多症、高原血压异常、混合型慢性高原病^[1]。

目前急性高原病的治疗方法主要是预防为主，西药多采用地塞米松、乙酰唑胺、氨茶碱等，会引起严重的不良反应。中药防治高原病在我国被公认为是一种有效的措施。在这之中，银杏叶提取物的有效性尚存在争议，刺五加注射液仅适合高原低血压症的治疗。而高原植物红景天提取物及其复方制剂应用较多，具有一定的预防效果。其中红景天苷具有抗缺氧、抗氧化、抗疲劳、抗辐射作用，是预防高原反应的最有效成分之一。

中药肉苁蓉是肉苁蓉属植物的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾壮阳、益精血等功效。管花肉苁蓉(C.tubulosa(Schrenk)Wight)主产于我国新疆南部，资源丰富。为目前肉苁蓉的主要基源植物。

申请人在长期研究中发现，肉苁蓉中的苷类成分具有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗辐射、提高免疫力和改善学习功能等作用，并且对脑缺血/脑缺血再灌注也有一定的保护作用，可提高血液循环能力，对低氧诱导的氧化损害有强的抗氧化和细胞保护活性。具备与红景天苷相似的药理作用并具有资源优势。

发明内容

基于上述研究成果，本发明公开了肉苁蓉苯乙醇苷提取物在防治高原病中的应用。

申请人在实验过程中，利用西北地区人工实验舱模拟高原环境制备了急慢性高原病大鼠模型，验证了肉苁蓉苯乙醇苷对其的防治作用。

本发明的肉苁蓉苯乙醇苷提取物，包含松果菊苷(根据具体制备工艺的差别，占总质量的15-75％左右)及毛蕊花糖苷，可以通过多种方法制备，尤其可以通过下述制备方法获得(具体的制备实施例可参考CN1268341C)，所述制备方法包括下述步骤：

a)将管花肉苁蓉的肉质茎以第一极性溶剂加予萃取；

b)将步骤a)获得的萃取物加到装有疏水大孔隙聚合物的柱中，使得苯乙醇苷成分吸附在聚合物上；

c)用第二极性溶剂作为流动相流洗液洗脱该柱以除去游离的化合物，在此情况下，大部份的苯乙醇苷仍然吸附在聚合物上；

d)用第三极性溶剂将苯乙醇苷从聚合物上洗脱下来，得到含有苯乙醇苷的洗脱液，除去含有苯乙醇苷洗脱液中的溶剂以得到干燥产物。

在上述方法中，步骤a)的第一极性溶剂为水或水与乙醇的混合溶剂；所述的步骤c)的第二极性溶剂为水，步骤d)的第三极性溶剂为甲醇、乙醇、水与甲醇的混合溶剂，或水与乙醇的混合溶剂。

由于肉苁蓉苯乙醇苷提取物在防治高原病中效果优异，因此本发明还公开了含有肉苁蓉苯乙醇苷提取物的防治高原病的药物组合物，包括辅料、肉苁蓉苯乙醇苷提取物，肉苁蓉苯乙醇苷提取物与辅料的重量比为1∶99～99∶1。

上述的辅料，可根据具体剂型的需要，选择药学上任意可用的药用辅料，具体的剂型包括但不限于口服液、片剂、丸剂、胶囊、注射剂、滴丸剂或膏剂。

在上述药物组合物中，肉苁蓉苯乙醇苷提取物包含松果菊苷及毛蕊花糖苷。

附图说明

图1为各组大鼠脑组织病理结果(HE×400)，其中A-F依次为正常对照组、模型组、大花红景天组、肉苁蓉苯乙醇苷提取物(PhGCs)低剂量组、肉苁蓉苯乙醇苷提取物(PhGCs)中剂量组、肉苁蓉苯乙醇苷提取物(PhGCs)高剂量组；

图2为各组大鼠脑组织AQP4表达量图(×400)，其中A-F依次为正常对照组、模型组、大花红景天组、PhGCs低剂量组、PhGCs中剂量组、PhGCs高剂量组；

图3为各组大鼠肺组织病理结果(HE×400)，其中A-F依次为正常对照组、模型组、大花红景天组、PhGCs低剂量组、PhGCs中剂量组、PhGCs高剂量组；

图4为各组大鼠肺组织AQP5表达结果(×400)，其中A-F依次为正常对照组、模型组、大花红景天组、PhGCs低剂量组、PhGCs中剂量组、PhGCs高剂量组；

图5为各组大鼠肺组织病理结果(HE×40)，其中A-F依次为正常对照组、模型组、大花红景天组、PhGCs低剂量组、PhGCs中剂量组、PhGCs高剂量组；

图6为各组大鼠右心室病理结果(HEx100)，其中A-F依次为正常对照组、模型组、大花红景天组、PhGCs低剂量组、PhGCs中剂量组、PhGCs高剂量组；

图7为各组大鼠肺组织HIF1α表达图(100x)，其中A-F依次为正常对照组、模型组、大花红景天组、PhGCs低剂量组、PhGCs中剂量组、PhGCs高剂量组；

图8为各组大鼠肺组织VEGF表达图(100x)，其中A-F依次为正常对照组、模型组、大花红景天组、PhGCs低剂量组、PhGCs中剂量组、PhGCs高剂量组。

具体实施方式

实施例1：小鼠常压缺氧实验

实验动物：清洁级KM小鼠，体重18-22g，自由饮水摄食，清洁级动物SPF实验室适应性饲养3天，温度(20±2)℃，湿度(60±5)％，12h光照周期。实验仪器与试剂：250mL广口瓶，秒表，医用钠石灰(上海五四化学试剂有限公司，20121218)，凡士林，大花红景天口服液(西藏藏药集团股份有限公司，120503，国药准字B20070002)，肉苁蓉苯乙醇苷提取物(杏辉天力药业有限公司，120401)

实验方法：

(1)选用18～22g昆明种小鼠50只，雌雄各半，购自新疆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(新)2011-0004，动物使用许可证号为SYXK(新)2011-0004。随机区组法均衡体重性别随机分为5组：空白对照组，肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组(112.5mg/kg)、肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组(225mg/kg)、肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组(450mg/kg)，大花红景天口服液组(2.57mL/kg)，每组 10只，各组均在SPF环境饲养。灌胃给药(空白对照组给蒸馏水，其余各组按相应剂量给药，灌胃体积为0.2mL/10g)，连续给药7d，末次给药1h后，将小鼠放入含有15g钠石灰的250mL广口瓶中，每瓶1鼠。瓶底钠石灰上置滤纸，瓶塞用凡士林密封。立即计时，观察小鼠从瓶塞封闭到呼吸停止时间，称为缺氧生存时间。计算各组小鼠缺氧生存时间均值，并计算药物对生存时间的延长百分比。

生存时间延长百分比＝(给药组平均生存时间-正常对照组平均生存时间)/正常对照组平均生存时间×100％。

(2)选用18～22g昆明种小鼠50只，雌雄各半，购自新疆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(新)2011-0004，动物使用许可证号为SYXK(新)2011-0004。随机区组法均衡体重性别随机分为5组：空白对照组，肉苁蓉苯乙醇苷剂量组(112.5mg/kg)，中剂量组(225mg/kg)，高剂量组(450mg/kg)，大花红景天口服液组(0.42mL/kg)，每组10只，各组均在SPF环境饲养。腹腔注射给药(空白对照组给蒸馏水，其余各组按相应剂量给药，给药体积为0.2mL/10g)，给药0.5h后，将小鼠放入含有15g钠石灰的250mL广口瓶中，每瓶1鼠。瓶底钠石灰上面放置滤纸，瓶塞用凡士林密封。立即计时，观察小鼠从瓶塞封闭到呼吸停止时间，称为缺氧生存时间。计算各组小鼠缺氧生存时间均值，并计算药物对生存时间延长百分比。

生存时间延长百分比＝(给药组平均生存时间-正常对照组平均生存时间)/正常对照组平均生存时间×100％

实验结果如下所示：

与空白对照组相比，灌胃给肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组及大花红景天组小鼠缺氧生存时间显著延长(P＜0.05)，延长百分率分别为22.46％、33.75％、41.51％和30.23％。腹腔注射肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量及大花红景天后小鼠缺氧生存时间也显著延长(P＜0.01)，延长百分率分别为33.38％、69.39％、105.67％和95.52％。具体结果见表1-1。

表1-1 各组小鼠缺氧存活时间

*P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组比

实验结论：肉苁蓉苯乙醇苷提取物灌胃给药和腹腔注射给药可以显著延长正常小鼠耐缺氧存活时间，具有抗缺氧作用。

实施例2：肉苁蓉苯乙醇苷预防给药对高原脑水肿模型大鼠的影响

表2-1 主要仪器

表2-2 主要试剂

实验动物与分组

Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，体重180～220克，购自新疆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(新)2011-0004，动物使用许可证号为SYXK(新)2011-0004。随机区组法均衡体重性别后将大鼠随机分为6组：正常对照组，高原脑水肿模型组，肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组(75mg/kg)、肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组(150mg/kg)、肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组(300mg/kg)，大花红景天口服液组(1.78mL/kg)，每组12只。各组均在SPF环境饲养，正常对照组、模型组灌胃生理盐水(1.0mL/100g)，其余各组按照相应剂量灌胃给药，灌胃体积均为 1.0mL/100g，连续给药10天。第8-10天除空白对照组外各组置于模拟海拔5000m高原环境的低压舱中饲养。舱内高度以10m/s的速度匀速上升到海拨5000m水平(大气压为54.1Kpa，氧分压为11.52Kpa)，期间动物自由进水及进食，每24h开舱半小时给药，添加饲料及饮水。

动物处理

各组大鼠出实验舱后腹腔注射戊巴比妥钠(2％，0.2mL/100g)麻醉，打开颅腔，取脑组织，左脑上半部称重后锡箔纸包裹测定含水量，左脑下半部4％多聚甲醛固定，用于制作石蜡切片，HE染色观察病理变化和免疫组化法检测AQP4在脑部的表达。右脑上半部称重，加PBS液制备10％匀浆液，3000r/min离心10min后，分装上清-80℃冰箱冻存，用以测定TNF-α、IL-6、SOD、MDA、谷胱甘肽过氧物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化物酶(peroxidase，POD)。右脑下半部分-80℃冰箱冻存，提取mRNA进行荧光定量PCR分析。

实验结果：

PhGCs对高原脑水肿大鼠脑组织病理改变的影响

在光镜下观察各组大鼠脑组织病理切片可见，正常对照组脑组织分子层、外颗粒细胞层、椎体层细胞层、内颗粒细胞层、多行细胞层结构清楚，未发现病变。模型组大鼠脑组织毛细血管充血、水肿，分子层、椎体层细胞水肿明显，部分椎体细胞嗜酸变，细胞核浓缩。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组大鼠脑组织分子层部分血管扩张充血水肿，细胞轻度水肿，海马椎体细胞散在核浓缩，水肿较模型组减轻。肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组大鼠脑组织部分脑膜下血管扩张充血，偶见细胞水肿，水肿较模型组明显减轻。肉苁蓉苯乙醇苷大剂量分子层无明显水肿，血管周围轻度水肿，偶见个别细胞核浓缩，水肿较模型组明显减轻。大花红景天组大鼠脑组织分子层散在水肿，椎体层散在核浓缩，散在血管极轻度水肿，水肿较模型组明显减轻。可知模型组大鼠脑组织明显水肿，模型成立。肉苁蓉苯乙醇苷、大花红景天可以降低高原脑水肿模型大鼠脑水肿程度，结果见图1。

PhGCs对高原脑水肿大鼠脑组织含水量的影响

与正常对照组相比，模型组脑组织含水量升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明模型成立。肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织含水量与模型组相比均降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组与大花红景天组脑组织含水量比较，差异无统计学意义。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组大鼠脑组织含水量与正常对照组接近，差异无统计学意义。具体结果见表2-3。

表2-3 各组大鼠脑组织含水量比较

*P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比，#P＜0.05，##p P＜0.01与模型组比

PhGCs对高原脑水肿大鼠脑TNF-α、IL-6含量影响

与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织匀浆液中TNF-α、IL-6含量显著升高(P＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织匀浆液中TNF-α、IL-6含量低于模型组(P＜0.05)，差异有统计学意义。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组与大花红景天组脑组织TNF-α、IL-6含量比较均未见显著差异。各给药组大鼠脑组织匀浆液中IL-6含量与正常对照组比较无显著差异，但TNF-α仍高于正常对照组。具体结果见表2-4。

表2-4 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-6含量比较

*P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比，#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比

PhGCs对大鼠脑组织MDA、SOD、POD、GSH-Px的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织SOD、POD、GSH-Px酶活力显著降低，MDA含量显著升高(P＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织SOD、POD、GSH-Px酶活力高于模型组，MDA含量低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组与大花红景天组大鼠脑组织SOD、POD、GSH-Px和MDA含量比较未见显著差异。各给药组大鼠脑组织SOD、POD、GSH-Px和MDA含量与正常对照组比较未见显著差异，具体结果见表2-5。

表2-5 各组大鼠脑组织氧化应激相关指标变化

PhGCs对高原脑水肿大鼠脑组织AQP4mRNA表达的影响

荧光定量PCR检测脑组织AQP4mRNA的表达发现，与正常对照组相比，模型组大鼠脑组织AQP4mRNA表达量显著升高，是其2.21倍(P＜0.01)。与模型组相比，肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织AQP4mRNA表达量下降(分别为模型组的0.54、0.47、0.51和0.49倍)，差异有统计学意义(P＜0.01)。苯乙醇苷各剂量组与大花红景天组相比差异无统计学意义。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组大鼠肺组织AQP4mRNA表达量仍高于正常对照组，肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织AQP4mRNA表达量与正常对照组相比，差异无统计学意义(p＞0.05)。具体结果见表2-6。

表2-6 各组大鼠脑组织AQP4mRNA表达量比较

PhGCs对高原脑水肿大鼠脑组织AQP-4蛋白表达的影响

用免疫组织化学法检测脑组织AQP4的表达发现，AQP4主要在大鼠脑组织脉络丛表达。空白对照组大鼠脑组织AQP4表达弱阳性或阴性表达，在急性高原病模型组大鼠脑组织阳性表达，肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织AQP4表达弱阳性，尤其是肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组大鼠脑组织AQP4表达接近正常组。可知模型组大鼠脑组织AQP4蛋白在调控水-电解质平衡的部位表达增多，肉苁蓉苯乙醇苷能降低高原脑水肿大鼠脑组织AQP4蛋白的表达，从而抑制水肿的发生。具体结果见图2。

实验结论：肉苁蓉苯乙醇苷能够预防高原脑水肿的发生，与其抗炎、抗氧化应激和降低脑组织中AQP4mRNA和蛋白表达有关

实施例3：肉苁蓉苯乙醇苷对高原肺水肿的预防作用及作用机制研究

实验动物、实验仪器同实验实施例2，实验试剂除AQP5抗体(L4790，Santa Cruz Biotechnology)替换AQP4外，其他相同。

实验动物与分组

Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，体重180～220g，购自新疆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(新)2011-0004，动物使用许可证号为SYXK(新)2011-0004。随机分为6组：正常对照组，模型组，大花红景天口服液组(1.78mL/kg)，肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组(75mg/kg)、肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组(150mg/kg)、肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组(300mg/kg)，每组12只。各组均在SPF环境饲养，正常对照组、模型组灌胃生理盐水(1.0mL/100g)，其余各组按照相应剂量灌胃给药，连续给药10天，第8天除空白对照组外其余各组置于模拟海拔5000m高原环境的人工实验舱中饲养。舱内高度以10m/s的速度匀速上升到海拨5000m水平(大气压为54.1Kpa，氧分压为11.52Kpa)，期间动物自由进水及进食，每24h开舱半小时给药，添加饲料及饮水。

动物处理

各组大鼠出实验舱后腹腔注射戊巴比妥钠(2％，0.2mL/100g)麻醉，打开腹腔，取肺组织，左肺上叶称重后锡箔纸包裹测定含水量，左肺下叶4％多聚甲醛固定，用于石蜡包埋切片，HE染色检测病理改变，免疫组化法检测肺AQP5表达。右肺上叶称重，加PBS液制备10％匀浆液，3000r/min离心10min，分装上清-80℃冰箱冻存，用于测定TNF-α、IL-6、SOD、MDA、GSH-Px、POD。右肺剩余叶-80℃冰箱冻存，提取mRNA进行荧光定量PCR分析。

实验结果：

PhGCs对高原肺水肿大鼠肺组织病理改变的影响

光镜下观察各组大鼠肺组织病理切片可见，正常对照组大鼠肺组织形态正常，肺泡腔内无分泌物，肺泡壁结构完整，无炎性细胞浸润及红细胞渗出。模型组大鼠肺组织变化明显，肺泡壁普遍增厚，部分可见肺组织实变，肺正常结构消失，炎性细胞浸润明显，肺间质充血水肿明显，周围可见代偿性气肿。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组大鼠肺组织肺间质轻度充血水肿，少量炎细胞浸润。肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组大鼠肺组织水肿不明显，间质增厚较轻，间质血管轻度充血。肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组大鼠肺组织水肿不明显，少量炎细胞浸润，间质增厚较轻，间质血管轻度充血。故病理结果显示模型组大鼠出现明显肺水肿，模型成立。肉苁蓉苯乙醇苷和大花红景天可以减轻高原肺水肿模型大鼠的水肿程度，具体结果见图3。

PhGCs对高原肺水肿大鼠肺组织含水量的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织含水量升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明模型成立。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组、肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组及大花红景天组大鼠肺组织含水量与模型组相比均降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组与大花红景天组大鼠脑肺组织含水量比较，差异无统计学意义。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组和大花红景天组大鼠肺组织含水量仍高于正常对照组(P＜0.01)。具体结果见表3-1。

表3-1 各组大鼠肺组织含水量

PhGCs对高原肺水肿大鼠肺组织的TNF-α、IL-6含量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织匀浆液中TNF-α、IL-6含量显著升高(P＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织匀浆液中TNF-α、IL-6含量低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组与大花红景天组肺组织TNF-α、IL-6含量比较均未见显著差异。各给药组大鼠肺组织TNF-α含量仍高于正常对照组，大花红景天组、肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组和高剂量组肺组织IL-6含量也高于正常对照组(P＜0.05)，肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组大鼠肺组织IL-6含量与正常对照组无显著差异。具体结果见表3-2。

表3-2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6含量

PhGCs对大鼠肺组织MDA、SOD、POD、GSH-Px的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织匀浆液SOD、POD、GSH-Px酶活力显著降低，MDA含量显著升高(P＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织POD、GSH-Px酶活力高于模型组，MDA含量低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。仅见肉苁蓉苯乙醇苷低、中剂量组大鼠肺组织SOD活力显著高于模型组(P＜0.05)。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组与大花红景天组大鼠肺组织SOD、POD、GSH-Px和MDA含量比较均未见显著差异。大鼠肺组织MDA含量、POD和GSH-Px活力在各给药组和正常组间无显著差异，肺组织SOD活力除肉苁蓉苯乙醇苷与正常对照组无显著差异外，其余给药组仍显著低于正常对照组(P＜0.05)。具体结果见表3-3。

表3-3 各组大鼠肺组织氧化应激相关指标变化

PhGCs对高原肺水肿大鼠肺组织AQP5mRNA表达的影响

荧光定量PCR检测肺组织AQP5mRNA的表达量，与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织AQP4mRNA表达量显著降低，仅是其0.27倍(P＜0.01)。与模型组相比，肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织AQP5mRNA表达量增高(分别为模型组的2.96、3.11、2.74和2.96倍)，差异有统计学意义(P＜0.01)，但仍显著低于正常对照组(分别为正常对照组的0.80、0.84、0.74和0.80倍)。苯乙醇苷低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠肺组织AQP5m表达量与大花红景天组差异无统计学意义。具体结果见表3-4。

表3-4 各组大鼠肺组织AQP5mRNA表达量比较

*P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比；#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比

PhGCs对高原肺水肿大鼠肺组织AQP-5蛋白表达的影响

用免疫组织化学法检测各组大鼠肺组织AQP5的表达发现，正常对照组大鼠肺组织AQP5表达阳性，AQP5在急性高原病模型组大鼠肺组织几乎无表达，肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组、肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织AQP5表达较模型组大鼠增多，肉苁蓉苯乙醇苷小剂量组AQP表达弱阳性。可见模型组大鼠肺组织AQP5表达显著减少，肉苁蓉苯乙醇苷小剂量组、中剂量组、大剂量组和大花红景天组大鼠肺组织AQP5表达较模型组增多。具体结果见图4。

实验结论：

肉苁蓉苯乙醇苷能够预防高原肺水肿的发生，与其抗炎、抗氧化应激和增加肺组织中AQP5mRNA和蛋白表达有关

实施例4：肉苁蓉苯乙醇苷对慢性高原病模型大鼠的治疗作用

表4-1 主要仪器

表4-2 主要试剂

实验动物与分组

Wistar大鼠72只，SPF级，雌雄各半，体重180～220g，购自新疆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(新)2011-0004，动物使用许可证号：SYXK(新)2011-0004。大鼠按照随机区组方法均衡体重性别随机分为6组：正常对照组，慢性高原病模型大鼠组(简称模型组)，大花红景天口服液组(1.78mL/kg)，肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组(75mg/kg)、肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组(150mg/kg)、肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组(300mg/kg)，每组12只。正常对照组在SPF环境饲养，其余各组置于模拟海拔5000m高原环境的人工实验舱中饲养。第5周各组开始灌胃给药，正常对照组和模型组灌胃蒸馏水，其余各组按相应剂量灌胃给药，灌胃体积1mL/100g，给药4周。

动物处理

末次给药后，各组大鼠眼内眦取血，置于抗凝采血管中，轻轻转动采血管保证充分抗凝，送检测定红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定，做气管插管手术，同时分离颈总动脉，做动脉插管，通过压力换能器连接BL-420系统，测定主动脉压，待压力波形稳定后连接呼吸机，模拟生理条件下的呼吸通气量，然后沿胸骨打开胸腔，用充满肝素化的生理盐水的7号针头从右心室上角分别插入肺动脉和右心室，另一端用导管与压力换能器连接BL-420系统。记录各只大鼠动脉压、平均肺动脉压，右心室收缩压^[89]。实验结束后，剖胸取出大鼠心脏，剪去心房组织。沿室间隔边缘分离出右心室(RV)和左室(LV)+室间隔(S)，用滤纸吸干水分后称量RV和LV+S的重量，以RV/(LV+S)比值比值来反映右心室肥厚程度。肺组织PBS液体冲洗后，1叶固定制备病理切片，1叶制备均浆液测定相关指标，其余-80℃冻存测定mRNA和蛋白质表达。

PhGCs对慢性高原病大鼠一般状况的影响

正常对照组大鼠毛色正常、状态良好，未见死亡和四肢水肿。随着造模时间的延长，模型组大鼠出现精神萎靡，出现四肢水肿，并有死亡。大花红景天组、肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠也出现四肢水肿和死亡。计算给药结束时各组大鼠死亡率和出现四肢水肿的动物百分比进行统计分析发现，模型组大鼠死亡率和四肢水肿率高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组大鼠死亡率和四肢水肿率显著低于模型组(P＜0.05)。因为检测指标较多，故每组实际动物数为24只，12只为一小组测定某指标。具体结果见表4-3。

表4-3 各组动物死亡率及四肢水肿率比较

PhGCs对慢性高原病大鼠血常规指标的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠血液红细胞数、血红蛋白含量及红细胞比容显著升高(P＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠与模型组相比，大鼠血液红细胞数、血红蛋白含量及红细胞比容无显著变化(p＞0.05)，仍显著高于正常对照组(P＜0.01)。大鼠血液红细胞数、血红蛋白含量及红细胞比容在肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组与大花红景天组间差异无统计学意义。具体结果见表4-4。

表4-4 各组大鼠红细胞计数、血红蛋白、红细胞比容

P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比，#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比

PhGCs对慢性高原病大鼠血流动力学指标的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠平均肺动脉压、右心室收缩压、平均动脉压及右心室肥厚指数显著升高(p＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠平均肺动脉压、右心室收缩压、右心室肥厚指数比模型组显著降低，但仍显著高于正常对照组。与模型组相比，肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组和中剂量组大鼠平均动脉压显著降低，仍高于正常对照组。与大花红景天组比较，仅见肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组平均动脉压显著低于前者。具体结果见表4-5和图4。

表4-5 各组大鼠mPAP、RVSP、MAP及RVHI

*P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比，#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比，▲P＜0.05，与大花红景天组比。

PhGCs对慢性高原病大鼠肺组织和肺动脉病理改变的影响

光镜下观察各组大鼠肺组织病理改变，可见正常对照组大鼠肺组织形态正常，肺泡壁结构完整，无炎症细胞浸润，肺泡腔内无分泌物；肺小动脉管壁较薄，管腔较大。模型组大鼠肺间质明显增厚，气管周围大量炎性细胞浸润；肺小动脉管壁明显增厚，管腔狭窄。大花红景天组、肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠肺间质增厚、肺小动脉管壁增厚及管腔狭窄较模型组减轻，气管周围炎性细胞浸润减少。具体结果见图5。

PhGCs对慢性高原病大鼠右心室病理改变的影响

光镜下观察各组大鼠右心室病理改变可见，正常对照组右心室心肌结构清楚，排列紧密，无毛细血管充血，无水肿及坏死。模型组右心室心肌明显增厚肥大，毛细血管明显充血水肿、嗜酸性变，部分间质有少量炎性细胞浸润。大花红景天组大鼠右心室心肌肥厚较轻，毛细血管充血范围明显减轻，仅见各别血管充血，嗜酸性变细胞减少，无明显炎性细胞浸润。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组右心室心肌肥厚比模型组减轻，充血水肿明显减轻，部分细胞嗜酸性变，炎性细胞浸润较少。肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组右心室心肌增厚较轻，炎性细胞浸润少，充血水肿明显减轻，偶见部分细胞嗜酸性变，基本与大花红景天组类似。肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组心肌肥大较轻，充血明显，部分细胞嗜酸性变，细胞及血管周围少量或散在炎性细胞浸润。具体结果见图6。

PhGCs对慢性高原病大鼠肺组织TNF-α、IL-6含量的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织TNF-α、IL-6含量显著升高(p＜0.01)。与模型组相比，肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织TNF-α、IL-6含量显著降低。而各给药组大鼠肺组织IL-6含量仍显著高于正常对照组(p＜0.01)。除肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组大鼠肺组织TNF-α仍高于正常对照组外，(p＜0.05)，肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组、高剂量组，大花红景天组与正常对照组相比，差异无统计学意义。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组肺组织TNF-α、IL-6含量无显著差异，具体结果见表4-6。

表4-6 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6含量比较

PhGCs对慢性高原病大鼠肺组织NO和NOS的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织NO含量降低，TNOS、iNOS和eNOS活力均下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织NO含量、TNOS、iNOS和eNOS活性都高于模型组。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、高剂量组和大花红景天组肺组织NO含量、总NOS和eNOS活性仍低于正常对照组，差异有统计学意义；肉苁蓉苯乙醇苷低中剂量组鼠肺组织NO含量、TNOS和eNOS活性与正常对照组无显著差异。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠肺组织NO含量、TNOS、iNOS和eNOS活性未见与大花红景天组有显著差异。具体结果见表4-7

表4-7 各组大鼠肺组织NO和NOS

PhGCs对慢性高原病大鼠肺组织ET-1含量的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织中ET-1含量显著升高(P＜0.01)。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织ET-1含量低于模型组，差异有统计学意义。各给药组大鼠肺组织ET-1含量仍显著高于正常对照组。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组与大花红景天组大鼠肺组织ET-1含量差异无统计学意义。具体结果见表4-8

表4-8 各组大鼠肺组织ET-1含量

PhGCs对慢性高原病大鼠肺小动脉HIF1α蛋白表达的影响

免疫组化法检测大鼠肺小动脉HIF1α蛋白表达量变化，光镜下观察可见，正常对照组大鼠肺动脉HIF1α蛋白无表达或弱阳性表达，模型组大鼠肺动脉HIF1α表达显著增加，为强阳性，大花红景天组、肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组大鼠肺动脉HIF1α蛋白表达弱阳性，尤其肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组表达与正常对照组相似。可见模型组大鼠肺动脉HIF1α蛋白表达量显著高于正常对照组，各给药组大鼠肺动脉HIF1α蛋白表达量比模型组明显减少。具体结果见图7。

PhGCs对慢性高原病大鼠肺组织HIF1αmRNA表达的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织HIF1αmRNA表达量为其1.03倍，差异无统计学意义。大花红景天组大鼠肺组织HIF1αmRNA表达量为正常对照组的1.06倍，与模型组和正常对照组无显著差异。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠肺组织HIF1αmRNA表达量分别是正常对照组的0.78倍、0.58倍和0.60倍，明显低于模型组和正常对照组，差异有统计学意义，表达量显著下降。与大花红景天组相比也显著降低。具体结果见表4-9。

表4-9 各组大鼠肺组织HIF1αmRNA表达量

*P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比，#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比，^▲P＜0.05， ^▲▲P＜0.01与大花红景天组比

PhGCs对慢性高原病大鼠肺组织HIF1α蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织HIF1α蛋白表达显著增多，表达量分别是正常对照组的2.75倍。肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组，大花红景天组HIF1α表达低于模型组(分别为模型组的0.50倍、0.43倍、0.47倍和0.52倍)，但仍高于正常对照组(分别为正常对照组的1.38倍、1.19倍、1.31倍和1.43倍)，肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组大鼠肺组织HIF1α蛋白表达量显著低于大花红景天组(P＜0.05＝。具体结果见下表4-10。

表4-10 各组大鼠肺组织HIF1α蛋白表达量

*P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比；#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比^▲P＜0.05， ^▲▲P＜0.01与大花红景天组比

PhGCs对慢性高原病大鼠肺小动脉VEGF蛋白表达的影响

免疫组化法检测大鼠肺小动脉VEGF蛋白表达量变化，光镜下观察可见，正常对照组大鼠肺动脉内皮层VEGF蛋白无表达或弱阳性表达，模型组大鼠肺动脉内皮层VEGF表达显著增加，为强阳性，大花红景天组、肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组大鼠肺动脉内皮层VEGF蛋白表达弱阳性，尤其肉苁蓉苯乙醇苷各剂量组表达与正常对照组相似。可见模型组大鼠肺动脉内皮层VEGF蛋白表达量显著高于正常对照组，各给药组大鼠肺动脉内皮层VEGF蛋白表达量比模型组明显减少。具体结果见图8。

与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织VEGFmRNA表达量为其7.64倍，显著增多。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织VEGFmRNA表达量分别为模型组的0.17、0.16、0.17、0.19倍，表达量显著低于模型组，差异有统计学意义。肉苁蓉苯乙醇苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和大花红景天组大鼠肺组织VEGFmRNA表达量与正常对照组比较，仍高于正常对照组，差异有统计学意义。肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组、肉苁蓉苯乙醇苷高剂量组大鼠肺组织VEGFmRNA表达量低于大花红景天组，差异有统计学意义。具体结果见表4-11。

表4-11 各组大鼠VEGFmRNA表达量

*P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比；#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01与大花红景天组比

PhGCs对慢性高原病大鼠肺组织VEGF蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组VEGF蛋白表达显著增多，表达量是正常对照组的1.98倍。肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组，大花红景天组VEGF蛋白表达低于模型组。肉苁蓉苯乙醇苷中剂量组表达量与正常组相比无显著差异。肉苁苯乙醇苷中剂量和高剂量组VEGF蛋白表达显著低于大花红景天组。具体结果见下表4-12.

表4-12 各组大鼠肺组织VEGF蛋白表达量

P＜0.05，**P＜0.01与正常对照组比，#P＜0.05，##P＜0.01与模型组比；^▲P＜0.05， ^▲▲P＜0.01与大花红景天组比

实验结论：肉苁蓉苯乙醇苷能降低慢性高原病的肺动脉高压和心室肥厚程度，改善心肺病理改变。可能是通过抗炎、抑制低氧诱导因子通路功能、增强NO通路功能发挥作用。但对红细胞数量、比容和血红蛋白含量无显著影响。

Claims

1.肉苁蓉苯乙醇苷提取物在防治高原病中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肉苁蓉苯乙醇苷提取物包含松果菊苷及毛蕊花糖苷。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肉苁蓉苯乙醇苷提取物制备方法包括下述步骤：a)将管花肉苁蓉的肉质茎以第一极性溶剂加予萃取；b)将步骤a)获得的萃取物加到装有疏水大孔隙聚合物的柱中，使得苯乙醇苷成分吸附在聚合物上；c)用第二极性溶剂作为流动相流洗液洗脱该柱以除去游离的化合物；d)用第三极性溶剂将苯乙醇苷从聚合物上洗脱下来，得到含有苯乙醇苷的洗脱液，除去含有苯乙醇苷洗脱液中的溶剂以得到干燥产物。

4.根据权利要求3的应用，其特征在于步骤a)的第一极性溶剂为水或水与乙醇的混合溶剂；步骤c)的第二极性溶剂为水，步骤d)的第三极性溶剂为甲醇、乙醇、水与甲醇的混合溶剂，或水与乙醇的混合溶剂。

5.含有肉苁蓉苯乙醇苷提取物的防治高原病的药物组合物，其特征在于包括辅料、肉苁蓉苯乙醇苷提取物，肉苁蓉苯乙醇苷提取物与辅料的重量比为1:99～99:1。

6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于所述肉苁蓉苯乙醇苷提取物包含松果菊苷及毛蕊花糖苷。

7.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于为口服液、片剂、丸剂、胶囊、注射剂、滴丸剂或膏剂。