CN107648345A - 一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物 - Google Patents

一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物 Download PDF

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CN107648345A CN201710827098.1A CN201710827098A CN107648345A CN 107648345 A CN107648345 A CN 107648345A CN 201710827098 A CN201710827098 A CN 201710827098A CN 107648345 A CN107648345 A CN 107648345A
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Abstract

本发明涉及一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，该组合物由下述原料按重量份配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷1~10份和栀子黄色素1~10份。本发明具有较好的抗缺氧抗疲劳作用。

Description

一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物
技术领域
本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物。
背景技术
我国是世界上高原面积最多、海拔最高并且居住人口最多的国家。氧分压低、空气稀薄、寒冷、昼夜温差大以及紫外辐射强是高原地区的主要特点，容易诱发高原疾病的发生，对不适应高原环境的人群造成严重的危害。高原缺氧是我国高原地区面临的主要问题。缺氧会导致组织血流动力学的改变、增加血脑屏障的通透性、增高动脉压，容易引发脑水肿和肺水肿。同时，在缺氧条件下，运动作业能力也会下降，容易产生疲劳。因此，对于抗缺氧药物的研究是目前防治高原疾病，提高运动作业能力具有重要的影响。
疲劳是机体在一定强度或在一定时间内活动后产生的一种复杂的生理变化过程，主要是机体活动到达一定强度后，体力以及脑力表现出的一种正常的生理现象。当机体长时间处于疲劳状态时会出现精神怠倦，体力不支，工作效能下降，最终会出现一种病理状态。平原人急进高原后最大摄氧量会急速下降，最大做功量也会降低为平原时的30%左右，并且海拔越高下降速度越快。急性缺氧会使得需氧运动能力急速降低。但是随着在高原生活时间的不断延长，机体会逐渐对高原产生习服，适应性增强，机体的各项功能会逐渐恢复，但是最终还是达不到正常水平。长期居住在高原的居民，其运动能力也会低于平原水平。
栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实，具有利胆保肝、抗炎镇痛、抗菌、抗肿瘤以及降血糖血脂等多方面的药理活性。栀子黄色素是栀子的有效提取部位，属于一种天然的类胡萝卜素色素，主要由西红花酸与二分子龙胆二糖结合而成，包括西红花苷-I 和西红花苷- II。有研究表明西红花苷具有较强的抗氧化活性。肉苁蓉属于列当科植物肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma.）干燥带鳞叶的肉质茎，具有广泛的抗炎抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、增强记忆、免疫调节以及滋补强壮等功效，其中苯乙醇苷类化成分能够改善能源物质的贮存、减轻乳酸堆积、减少肌肉损伤。两种药物组合具有较好的抗氧化和抗疲劳作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种效果显著的具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物。
为解决上述问题，本发明所述的一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，其特征在于：该组合物由下述原料按重量份配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷1~10份和栀子黄色素1~10份。
所述药剂为药剂学上的任何一种剂型。
所述剂型是指注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、口服液、片剂中的一种。
所述肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为5~90%。
所述栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为5~90%。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明能显著延长小鼠抗常压密闭缺氧、亚硝酸钠缺氧的时间，降低急性缺氧的死亡率，具有较好的抗缺氧作用。
【1】材料和仪器
1.1实验动物
清洁级，BalB/C小鼠150只，体重20±2g，由兰州军区兰州总医院动物实验科提供，生产合格证号：SCXK（军）2012-0020；使用合格证号：SCXK（军）2012-0029。
1.2实验药材和试剂
栀子黄色素（潜江市绿宝生物技术有限公司，批号：XH15-07-02）；肉苁蓉苯乙醇苷（长春泰仁生物科技有限公司）；灭菌注射用水（四川科伦药业股份有限公司，批号：M15111005）；红景天胶囊（中国人民解放军西藏军区红景天研制中心，批号：130604，规格：0.38×30粒）；钠石灰（天津市化学试剂六厂三分厂，20150418）；其余试剂均为分析纯。
1.3实验仪器
高效液相色谱仪-美国Waters公司；BP210S-电子分析天平-德国Sartorius公司；FLYDWC50-ⅡC-低压低氧动物试验舱-贵州风雷航空军械有限公司；XH-X型-漩涡匀浆机-美国Sigma公司。
【2】实验方法
2.1常压密闭缺氧实验
50只BalB/C小鼠随机平均分为空白组（灭菌注射用水）、阳性药组（红景天胶囊，0.5g.kg-1.d-1）、给药低剂量组（0.1 g.kg-1.d-1）、给药中剂量组（0.3 g.kg-1.d-1）以及给药高剂量组（0.5 g.kg-1.d-1）。灌胃给药，连续3天。末次给药1h后将常压密闭组小鼠放入盛有5 g钠石灰（吸收二氧化碳和水）的200 ml广口磨口瓶内，每瓶放1只小鼠，并且用凡士林涂抹瓶口，盖严防止漏气，立即计时。以小鼠呼吸停止（小鼠胸部不起伏）时间为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。
2.2亚硝酸钠缺氧实验
动物分组与给药同2.1。第3天给药1h后，小鼠腹腔注射300 mg/ kg的亚硝酸钠溶液，观察记录小鼠血液性缺氧的死亡时间。
2.3急性低压缺氧实验
动物分组与给药同2.1。第3天给药1h后，将小鼠放入低压低氧动物试验舱，设置海拔10000 m，上升速度为20 m/s，待海拔达到10000 m时开始计时，观察小鼠在15min内的死亡现象，并统计小鼠的死亡率。
2.4 统计学处理
结果以表示，组间比较采用方差分析和 t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
【3】结果
3.1常压密闭抗缺氧结果
与空白组相比，阳性药与给药各剂量组小鼠抗缺氧时间均延长，且具有统计学差异（P<0.05），其中给药组高剂量组具有将强的抗缺氧作用（P<0.01）。结果见表1。
表1 各组小鼠常压密闭抗缺氧时间（，n＝10）
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.2亚硝酸钠缺氧结果
与空白组相比，阳性药组与给药各剂量组小鼠抗缺氧时间均延长，且具有统计学差异（P<0.05），其中给药低剂量与给药高剂量组抗缺氧作用更明显（P<0.01）。结果见表2。
表2 各组小鼠抗亚硝酸钠缺氧的时间（，n＝10）
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.3急性低压缺氧结果
与空白组比较，小鼠放入低压低氧动物试验舱15 min内，阳性药与给药各剂量组死亡率明显降低，其中给药高剂量组小鼠死亡率最低。结果见表3。
表3 急性低压缺氧小鼠死亡情况以及死亡率
2、本发明能够显著延长小鼠力竭游泳时间，具有较好的抗运动性疲劳的作用。其作用可能通过减少不良代谢产物生成与堆积、提高氧化应激能力、增强能量代谢酶活性、增加能源物质储备等多方面实现。
【1】材料和仪器
1.1实验动物
清洁级，BalB/C小鼠60只，体重20±2g，由兰州军区兰州总医院动物实验科提供，生产合格证号：SCXK（军）2012-0020；使用合格证号：SCXK（军）2012-0029。
1.2实验药材和试剂
栀子黄色素（潜江市绿宝生物技术有限公司，批号：XH15-07-02）；肉苁蓉苯乙醇苷类提取物（长春泰仁生物科技有限公司）；灭菌注射用水（四川科伦药业股份有限公司，批号：M15111005）。BCA蛋白测定试剂盒（批号：20160524）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号：20160523）；血尿素氮试剂盒（BUN，批号：20160522）；丙酮酸试剂盒（批号：20160524）；乳酸试剂盒（LD，批号：20160527）；乳酸脱氢酶试剂盒（LDH，批号：20160524）；还原性谷胱甘肽试剂盒（GSH，批号：20160523）；总超氧化物气化酶试剂盒（T-SOD，批号：20160522）；苹果酸脱氢酶试剂盒（MDH，批号：20160523）；琥珀酸脱氢酶试剂盒（SDH，批号：20160523）；Na+-K+-ATP酶试剂盒（批号：20160525），Ga2+-Mg2+-ATP酶（批号：20160525）；肝/肌糖原（批号：20160524），以上试剂盒均购买于南京建成有限责任公司；MSF（批号：ST506-1）、RIPA（批号：ST506-2），购买于碧云天生物技术研究所；10×PBS磷酸缓冲液（批号：20161127）、4%多聚甲醛（批号：20161121）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号2016115）、4×上样蛋白缓冲液（批号：20170209）、甘氨酸（批号：1203P0612）、SDS（批号：707F033）、TRIS（批号：907R074）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号：20151116）、10×TBST（批号：20161121）、脱脂奶粉（批号：909C0510），ECL Plus超敏发光液（批号：20161213）均购买于北京索莱宝科技有限公司；Maker （Prestained protein ladder，批号：00318120），购买于美国Thermo公司；β-actin（Mouse Anti-βactin，批号：16AV0212）、辣根酶标记山羊抗小鼠（批号：122627）、辣根酶标记山羊抗兔（批号：125946），购买于中杉金桥生物技术有限公司；caspase-3多克隆抗体（批号：0017），购买于Ceel Signaling 公司；Anti-Bax抗体（批号GR151406-45）、Anti-Bcl-2抗体（批号GR95625-11），购买于英国Aabcam公司；PVDF膜（批号：K5PA92821），购买于Immobilon-P@ Transfer Membranes公司；无水甲醇（批号：2017224）、无水乙醇（批号：20170119）购买于兰州爱华化工有限公司。其余试剂均为分析纯。
1.3试验仪器
高速冷冻离心机（3K15，美国Sigma公司）；电子天平（BP210S，德国Sartorius公司）；电热恒温水槽（DK-8A，上海精宏实验设备有限公司）；全自动荧光酶标仪（SpectraMax®i3，Molecular公司）；-80℃冷冻冰柜（Harris Manufacturing Co.Ltd）；组织切片机（HM340E，德国美康公司）；生物组织自动包埋机（TB-718E，湖北泰雅电子技术有限公司）；光学显微镜（E200，日本Nikon公司）；电动匀浆机（POLYTRON®PT 1200E，瑞士KINEMATICA AG公司）；紫外可见分光光度计（HP-98453，美国惠普公司）；漩涡混匀器（XH-C，美国Sigma公司）；恒温水浴摇床（TS-1 ORBITAL SHAKER，西安昊兴生物科技有公司）；电泳仪和电泳槽（PowerpacTMBasic，美国BIO-RAD公司）。
【2】实验方法
2.1动物分组
60只小鼠随机平均分为空白对照组（灭菌注射用水）；阳性对照组（红景天胶囊，0.5g.kg-1.d-1）以及给药组（低剂量0.1 g.kg-1.d-1，中剂量组0.3 g.kg-1.d-1，高剂量组0.5g.kg-1.d-1）。灌胃给药，连续7天。
2.2常压力竭游泳实验
末次给药1h后，进行负重游泳实验，测定小鼠力竭游泳时间。以小鼠体质量7%的负荷(铅丝）系于1/3尾巴处，放入18 cm深的水槽（50 cm×40 cm×30 cm）中，水温控制在（25±1）℃，进行负重游泳，记录小鼠从放入水槽至小鼠沉入水下7 s未能浮在水面上的时间，即小鼠力竭游泳时间。
2.3生化指标检测
力竭游泳后，小鼠眼眶取血，并取肝脏，脑以及肌肉组织。根据试剂盒说明书测定小鼠血清、肝匀浆、脑匀浆以及肌肉匀浆的丙酮酸、BUN、LD、LDH、GSH、T-SOD、MDH、SDH、Na+-K+-ATP酶、Ga2+-Mg2+-ATP酶以及肝/肌糖原水平。
2.4 Western Blotting检测小鼠肝脏和脑组织中蛋白的表达
根据SDS-PAGE 凝胶电泳方法对小鼠肝脏和脑组织中的Bax、Bcl-2以及CaspaseⅢ蛋白的表达进行测定。
2.5 统计学处理
结果以表示，组间比较采用方差分析和 t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
【3】结果
3.1常压力竭游泳时间
与空白组相比，阳性药与给药各剂量组小鼠常压力竭游泳均延长，且具有统计学差异（P<0.05）。结果见表4。
表4 各组小鼠力竭游泳时间（，n＝10）
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.2各组小鼠BUN以及丙酮酸含量
与空白对照组相比，给药各剂量组均能显著降低血尿素氮的含量，升高丙酮酸水平，差异具有显著性（P<0.05）。结果见表5。
表5各组小鼠BUN以及丙酮酸含量
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.3各组小鼠LD及LDH含量变化
与空白对照组相比，给药各剂量组小鼠LD及LDH含量均显著增加（P <0.05）。结果见表6。
表6各组小鼠LD及LDH含量
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.4各组小鼠GSH及T-SOD含量变化
与空白对照组相比，给药各剂量组小鼠LD及LDH含量均显著增加（P<0.05）。结果见表7。
表7各组小鼠GSH及T-SOD含量
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.5各组小鼠SDH及MDH含量变化
与空白对照组相比，给药各剂量组小鼠LD及LDH含量均显著增加（P<0.05）。结果见表8。
表8 各组小鼠SDH及MDH含量
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.5各组小鼠Na+-K+-ATP酶，Ga2+-Mg2+-ATP酶以及肝糖原和肌糖原的含量变化
与空白对照组相比，给药各剂量组小鼠LD及LDH含量均显著增加（P <0.05）。结果见表9。
表9各组小鼠Na+-K+-ATP酶，Ga2+-Mg2+-ATP酶以及肝糖原和肌糖原的含量
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.6 Western Blotting 检测小鼠鼠肝脏和脑组织中相关凋亡蛋白的表达
3.6.1小鼠肝脏组织中Bax、Bcl-2以及Caspase-3蛋白的表达
与空白游泳组相比，给药低剂量组和红景天组小鼠肝脏组织中Bax/Bcl-2值显著降低（P<0.05），而给药高剂量组小鼠肝脏组织中Bax/Bcl-2值降低更显著（P<0.01）；与空白游泳组相比，给药低剂量组和高剂量组小鼠肝脏组织中Caspase-3蛋白显著下调（P<0.05），而给药高剂量组小鼠肝脏组织中Caspase-3蛋白显著下调（P<0.01）。详细结果见表10以及图1。
表10小鼠肝脏组织中Bax、Bcl-2以及Caspase-3蛋白的表达结果（）
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3.6.2小鼠脑组织中Bax、Bcl-2以及Caspase-3蛋白的表达
与空白游泳组相比，给药低剂量组、高剂量组以及红景天组小鼠脑组织中Bax/Bcl-2值显著降低（P<0.01）；与空白组相比，给药中剂量、高剂量组以及红景天组小鼠脑组织中Caspase-3蛋白表达显著下调（P<0.01）。详细结果见表11以及图2。
表11小鼠脑组织中Bax、Bcl-2以及Caspase-3蛋白的表达结果（）
注：*P<0.05，**P<0.01；给药组vs空白组。
3、本发明能够延长大鼠在模拟高原条件下的力竭游泳时间；降低不良代谢产物的堆积，增加能源储备，提高自由基清除能力，升高相关代谢酶的活性；降低凋亡蛋白的表达水平；抑制炎性细胞的浸润。具有显著的抗缺氧抗疲劳作用。
【1】材料和仪器
1.1实验动物
清洁级，Wister大鼠120只，体重180±20g，由兰州军区兰州总医院动物实验科提供，生产合格证号：SCXK（军）2012-0020；使用合格证号：SCXK（军）2012-0029。
1.2实验药材和试剂
栀子黄色素（潜江市绿宝生物技术有限公司，批号：XH15-07-02）；肉苁蓉苯乙醇苷（长春泰仁生物科技有限公司）；灭菌注射用水（四川科伦药业股份有限公司，批号：M16111005）；BCA法蛋白定量测定测试盒（批号：20161128）、考马斯亮蓝法蛋白定量测定测试盒（批号：20161124）、血尿素氮测试盒（BUN，批号：20161121）、肌酐测试盒（GRE，批号：20161121）、尿酸测试盒（UA，批号：20161121）、肌酸激酶测试盒（CK，批号：20161123）；丙酮酸测试盒（PA，批号：20161128）、丙酮酸激酶测试盒（PK，批号：20161124）、乳酸测试盒（LD，批号：20161127）、乳酸脱氢酶测试盒（LDH，批号：20161125）、谷胱甘肽过氧化物酶测试盒（GSH-PX，批号：20161125）、总超氧化物气化酶测试盒（T-SOD，批号：20161125）、过氧化氢酶测试盒（CAT，批号：20161125）、一氧化氮测试盒（NO，批号：20161127）、一氧化氮合酶（NOS，批号20161125）、丙二醛测试盒（MDA，批号：20161125）、ATP含量测试盒（ATP，批号：20161128）、肝/肌糖原测试盒（批号：20161128），测试盒均购买于南京建成生物工程研究所；PMSF（批号：ST506-1）、RIPA（批号：ST506-2），购买于碧云天生物技术研究所；10×PBS磷酸缓冲液（批号：20161127）、4%多聚甲醛（批号：20161121）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号2016115）、4×上样蛋白缓冲液（批号：20170209）、甘氨酸（批号：1203P0612）、SDS（批号：707F033）、TRIS（批号：907R074）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号：20151116）、10×TBST（批号：20161121）、脱脂奶粉（批号：909C0510），ECL Plus超敏发光液（批号：20161213）均购买于北京索莱宝科技有限公司；Maker（Prestained protein ladder，批号：00318120），购买于美国Thermo公司；β-actin（Mouse Anti-βactin，批号：16AV0212）、辣根酶标记山羊抗小鼠（批号：122627）、辣根酶标记山羊抗兔（批号：125946），购买于中杉金桥生物技术有限公司；Anti-Bax抗体（批号GR151406-45）、Anti-Bcl-2抗体（批号GR95625-11）、Anti-AMPKalpha 1+ AMPKalpha2抗体（批号GR87459-20）、Anti-Nox2/gp91phox抗体（批号GR226001-11），购买于英国Aabcam公司；PVDF膜（批号：K5PA92821），购买于Immobilon-P@Transfer Membranes公司；无水甲醇（批号：2017224）、无水乙醇（批号：20170119）购买于兰州爱华化工有限公司。
1.3实验仪器
模拟高原低压低氧动物实验舱（DYC-9070，贵州风雷航空军械有限责任公司）；高速冷冻离心机（3K15，美国Sigma公司）；电子天平（BP210S，德国Sartorius公司）；电热恒温水槽（DK-8A，上海精宏实验设备有限公司）；全自动荧光酶标仪（SpectraMax®i3，Molecular公司）；-80℃冷冻冰柜（Harris Manufacturing Co.Ltd）；组织切片机（HM340E，德国美康公司）；生物组织自动包埋机（TB-718E，湖北泰雅电子技术有限公司）；光学显微镜（E200，日本Nikon公司）；电动匀浆机（POLYTRON®PT 1200E，瑞士KINEMATICA AG公司）；紫外可见分光光度计（HP-98453，美国惠普公司）；漩涡混匀器（XH-C，美国Sigma公司）；恒温水浴摇床（TS-1ORBITAL SHAKER，西安昊兴生物科技有公司）；电泳仪和电泳槽（PowerpacTM Basic，美国BIO-RAD公司）；
【2】实验方法
2.1动物分组
120只大鼠随机平均分为常氧空白对照组（NC，灭菌注射用水）、低氧空白对照组（HC，灭菌注射用水）、低氧定量游泳空白组（QC，灭菌注射用水）、低氧定量游泳阳性对照组（QP，红景天胶囊，0.5.kg-1.d-1）、低氧定量游泳给药组（QD，0.5.kg-1.d-1）、低氧力竭游泳空白组（EC，灭菌注射用水）、低氧力竭游泳阳性对照组（EP，红景天胶囊，0.5.kg-1.d-1）以及低氧力竭游泳给药组（ED，0.5.kg-1.d-1），每组15只。除常氧空白对照组组外，其他组大鼠均置于模拟海拔8000m的环境中，并与每天8点-9点在3500m的环境中给药，连续给药5天。
2.2力竭游泳实验
末次给药1h后，低氧力竭游泳空白组、低氧力竭游泳阳性对照组以及低氧力竭游泳给药组大鼠进行负重游泳实验，测定大鼠力竭游泳时间。以大鼠体质量9%的负荷(铅丝）系于1/3尾巴处，放入18 cm深的水槽（50 cm×40 cm×30 cm）中，水温控制在（25±1）℃，进行负重游泳，记录大鼠从放入水槽至沉入水下7 s未能浮在水面上的时间，即大鼠力竭游泳时间。
2.3定量游泳实验
末次给药1h后，低氧定量游泳空白组、低氧定量游泳阳性对照组以及低氧定量游泳给药组大鼠进行定量15min的游泳实验，以大鼠体质量7%的负荷(铅丝）系于1/3尾巴处，放入18 cm深的水槽（50 cm×40 cm×30 cm）中，水温控制在（25±1）℃，进行负重定量游泳。
2.4指标测定
大鼠断头取血，并取肝脏组织，脑组织以及肌肉组织。根据试剂盒说明书对大鼠血清以及组织中的BUN、尿酸、肌酐、丙酮酸、CK、CAT、GSH-PX、MDA、NOS、NO、LD、LDH、T-SOD、ATP含量及肝糖原和肌糖原水平急性测定。
2.5Western Blotting蛋白测定
根据SDS-PAGE 凝胶电泳方法对小鼠肝脏和脑组织中的Bax、Bcl-2、Nox2以及AMPK蛋白的表达进行测定以及CaspaseⅢ蛋白的表达你进行测定。
2.6大鼠组织病理切片的制备与观察
取大鼠的脑组织、肝脏组织以及肌肉组织，用4%的多聚甲醛溶液固定72h 后进行常规HE染色，切片并在光学显微镜下观察大鼠脑组织、肝脏组织以及肌肉组织的病理学变化。
2.7统计学处理
结果以表示，组间比较采用方差分析和 t 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
【3】结果
3.1力竭游泳实验
3.1.1力竭游泳时间
与低氧力竭游泳空白组相比，低氧力竭游泳阳性对照组以及低氧力竭游泳给药组大鼠的力竭游泳时间显著延长，且具有统计学差异（P<0.05）。结果见表12。
表12大鼠力竭游泳时间（，n＝15）
注：**P<0.01，与EC组相比。
3.1.2各组大鼠血清中生化指标检测结果
3.1.2.1 BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸的含量
与NC组相比，其他组大鼠血清中的BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸含量均显著增高（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠血清中的BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸含量显著降低（P<0.05）。结果见表13。
表13各组大鼠血清中BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸的含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.1.2.2 LD、LDH、NO以及NOS的含量
与NC组相比，其他组大鼠血清中的LD、LDH、NO以及NOS的含量均显著增高（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠血清中的LD、LDH、NO以及NOS的含量显著降低（P<0.05）。结果见表14。
表14各组大鼠血清中BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸的含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.1.2.3 CK、MDA以及GSH-PX的含量
与NC组相比，其他组大鼠血清中的CK、MDA的含量均显著增高，GSH-PX的含量显著降低（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠血清中的CK、MDA的含量显著降低，GSH-PX的含量显著增高（P<0.05）。结果见表15。
表15各组大鼠血清中CK、MDA以及GSH-PX的含量
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.1.3大鼠组织中的生化指标检测
3.1.3.1 LD和LDH含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的LD和LDH的含量均显著增高（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠组织中的LD和LDH的含量显著降低（P<0.05）。
结果见表16。
表16各组大鼠LD和LDH含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.1.3.2NO以及NOS含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的NO和NOS的含量均显著增高（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠组织中的NO和NOS的含量显著降低（P<0.05）。结果见表17。
表17各组大鼠NO和NOS含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.1.3.3丙酮酸以及CK含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的丙酮酸和CK的含量均显著增高（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠组织中的丙酮酸和CK的含量显著降低（P<0.05）。结果见表18。
表18各组大鼠丙酮酸和CK含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.1.3.4GSH-PX以及T-SOD含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的GSH-PX和T-SOD的含量均显著降低（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠组织中的GSH-PX和T-SOD的含量显著增高（P<0.05）。结果见表19。
表19各组大鼠GSH-PX和T-SOD含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.1.3.5CAT以及MDA含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的CAT含量显著降低，MDA的含量显著增高（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠组织中的CAT含量显著增高， MDA的含量显著降低（P<0.05）。结果见表20。
表20各组大鼠CAT和MDA含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.1.4大鼠组织中能源物质检测结果
与NC组相比，其他组大鼠组织中的ATP含量以及肝糖原和肌糖原含量显著降低（P<0.05）；与EC组相比，EP组与ED组大鼠组织中的ATP含量以及肝糖原和肌糖原含量显著增高（P<0.05）。结果见表21。
表21各组大鼠糖原和ATP含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比；#p<0.05，##p<0.01，与EC组相比。
3.2定量游泳实验结果
3.2.1各组大鼠血清中生化指标检测结果
3.2.1.1 BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸的含量
与NC组相比，其他组大鼠血清中的BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸含量均显著增高（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组大鼠血清中的BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸含量显著降低（P<0.05）。结果见表22。
表22各组大鼠血清中BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸的含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.2.1.2 LD、LDH、NO以及NOS的含量
与NC组相比，其他组大鼠血清中的LD、LDH、NO以及NOS的含量均显著增高（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组大鼠血清中的LD、LDH、NO以及NOS的含量显著降低（P<0.05）。结果见表23。
表23各组大鼠血清中BUN、尿酸、肌酐以及丙酮酸的含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.2.1.3 CK、MDA以及GSH-PX的含量
与NC组相比，其他组大鼠血清中的CK、MDA的含量均显著增高，GSH-PX的含量显著降低（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组大鼠血清中的的CK、MDA的含量显著降低，GSH-PX的含量显著增高（P<0.05）。结果见表24。
表24各组大鼠血清中CK、MDA以及GSH-PX的含量
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.2.2大鼠组织中的生化指标检测
3.2.2.1 LD和LDH含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的LD和LDH的含量均显著增高（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组大鼠组织中的的LD和LDH的含量显著降低（P<0.05）。结果见表25。
表25各组大鼠LD和LDH含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.2.2.2NO以及NOS含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的NO和NOS的含量均显著增高（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组大鼠组织中的NO和NOS的含量显著降低（P<0.05）。结果见表26。
表26各组大鼠NO和NOS含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.2.2.3丙酮酸以及CK含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的丙酮酸和CK的含量均显著增高（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组大鼠组织中的丙酮酸和CK的含量显著降低（P<0.05）。结果见表27。
表27各组大鼠丙酮酸和CK含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.2.2.4GSH-PX以及T-SOD含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的GSH-PX和T-SOD的含量均显著降低（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组大鼠组织中的GSH-PX和T-SOD的含量显著增高（P<0.05）。结果见表28。
表28各组大鼠GSH-PX和T-SOD含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.2.2.5CAT以及MDA含量
与NC组相比，其他组大鼠组织中的CAT含量显著降低，MDA的含量显著增高（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组大鼠组织中的CAT含量显著增高， MDA的含量显著降低（P<0.05）。结果见表29。
表29各组大鼠CAT和MDA含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.2.3大鼠组织中能源物质检测结果
与NC组相比，其他组大鼠组织中的ATP含量以及肝糖原和肌糖原含量显著降低（P<0.05）；与QC组相比，QP组与QD组的ATP含量以及肝糖原和肌糖原含量显著增高（P<0.05）。结果见表30。
表30各组大鼠糖原和ATP含量（，n＝15）
注：*p<0.05，**p<0.01，与NC组相比，#p<0.05，##p<0.01，与QC组相比。
3.3Western Blotting 检测大鼠肝脏和脑组织中相关蛋白的表达
3.3.1肝脏组织中Bax、Bcl-2、Nox2蛋白表达结果
与NC相比，其他组大鼠肝脏组织中的Bax/Bcl-2以及Nox2的表达均显著上调（P<0.05）；与HC组相比，QC组合EC组大鼠肝脏组织中的Bax/Bcl-2以及Nox2的表达均显著增高；与QC组相比，QP组合QD组大鼠肝脏组织中的Bax/Bcl-2以及Nox2的表达均显著下调（P<0.05）；与EC组相比，EP组和ED组大鼠大鼠肝脏组织中的Bax/Bcl-2以及Nox2的表达均显著下调（P<0.05）。详细结果见表31以及图3。
表31肝脏组织中Bax、Bcl-2、Nox2蛋白的表达结果（）
注：ap<0.05，aap<0.01，与NC组相比；bp<0.05，bbp<0.01，与QC组相比；Cp<0.05，CCp<0.01，与EC组相比。
3.3.2脑组织中Bax、Bcl-2、Nox2蛋白表达结果
与NC比，其他组大鼠脑组织中的Bax/Bcl-2、Nox2以及Ampk的表达均显著上调（P<0.05）；与HC组相比，QC组合EC组大鼠脑组织中的Bax/Bcl-2、Nox2以及Ampk的表达均显著增高；与QC组相比，QP组和QD组大鼠脑组织中的Bax/Bcl-2、Nox2以及Ampk的表达均显著下调（P<0.05）；与EC组相比，EP组和ED组大鼠脑组织中的Bax/Bcl-2、Nox2以及Ampk的表达均显著下调（P<0.05）。详细结果见表32以及图4。
表32肝脏组织中Bax、Bcl-2、Nox2以及Ampk蛋白的表达结果（）
注：ap<0.05，aap<0.01，与NC组相比；bp<0.05，bbp<0.01，与QC组相比；Cp<0.05，CCp<0.01，与EC组相比。
3.4大鼠组织病理学变化
3.4.1对大鼠肝脏组织病理学变化的影响结果
大鼠肝脏组织病理切片实验结果如图5所示：HE染色在200倍光学显微镜下能够清楚的观察到大鼠肝脏组织的的病理学改变情况。NC组大鼠肝脏组织形态结构完整，，中央静脉周围的细胞排列紧密，层次清晰可见，没有出现坏死的细胞以及其他病理学变化；HC组大鼠肝脏中央静脉周围的细胞排列略见疏松，细胞形态基本正常；力竭游泳组大鼠肝脏中央静脉结构严重紊乱，细胞排列疏松，细胞体积明显增大，细胞间出现水肿，细胞坏死明显，其中以EC组大鼠病理变化最为严重，ED组和EP大鼠肝脏病理结果与EC组相比得到了显著改善；定量游泳组大鼠肝脏组织病理变变比力竭游泳组大鼠轻，但中央镜脉依旧紊乱，周围铣刨排列疏松，QD组和QP组大鼠病理结果与QC组相比，得到了显著地改善。
3.4.2对大鼠脑组织病理学变化的影响结果
大鼠脑组织病理切片实验结果如图6所示：HE染色在200倍光学显微镜下能够清楚的观察到大鼠脑组织的的病理学改变情况。NC组大鼠脑组织形态结构正常，细胞结构清晰，细胞核明显；HC组大鼠脑组织细胞间质出现明显的水肿；力竭游泳组大鼠中心静脉周围的脑组织间质水肿明显，并且血管出现水肿充血病变，其中EC组大鼠的组织病变情况最为严重，ED组和EP大鼠脑组织病理结果与EC组相比得到了显著改善；定量游泳组大鼠脑组织病理变化比力竭游泳组大鼠轻，但依旧出现细胞水肿和充血等病理现象，并且QD组和QP组大鼠脑组织病理变化与QC组相比得到了显著改善，且QP组大鼠脑组织病理变化基本恢复正常，细胞水肿明显减轻，细胞结构清晰可见。
3.4.3对大鼠肌肉组织病理学变化的影响结果
大鼠肌肉组织病理切片实验结果如图7所示：HE染色在200倍光学显微镜下能够清楚的观察到大鼠肌肉组织的的病理学改变情况。NC组大鼠肌肉组织形态结构正常、细胞结构清晰、细胞核分散、排列整齐、横纹结构整齐、没有炎性细胞浸润；HC组大鼠肌肉组织细胞核出现堆积现象、细胞出现肿大；力竭游泳组大鼠肌肉组织细胞核出现明显的堆积现象、肌束界模糊不清、横纹出现断裂、组织水肿明显、间隙较大、大量炎性细胞出现浸润，其中EC组大鼠的组织病变情况最为严重，ED组和EP大鼠组织病理结果与EC组相比有了一定的改善；定量游泳组大鼠肌肉组织病理变化比力竭游泳组大鼠轻，偶见炎性细胞浸润、细胞核堆积、细胞略见肿胀、部分细胞核堆积，QD组和病理结果与QC组相比，得到了显著地改善，且QP组大鼠组织病理基本恢复，细胞排列整齐、细胞核结构清楚。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1 为本发明小鼠肝脏组织中Bax、Bcl-2以及Caspase-3蛋白表达结果。其中：(A)空白组， (B) 低剂量组， (C) 中剂量组， (D) 高剂量组， (E) 红景天组。
图2为本发明小鼠脑组织中Bax、Bcl-2以及Caspase-3蛋白表达结果。其中：(A) 空白组， (B) 低剂量组， (C) 中剂量组， (D) 高剂量组， (E) 红景天组。
图3为本发明肝脏组织中Bax、Bcl-2、Nox2蛋白的表达结果。其中(A) NC，(B) HC，(C) QC，(D) QP，(E) QD， (F) EC，(G) EP，(H) ED。
图4为本发明脑组织中Bax、Bcl-2、Nox2以及Ampk蛋白的表达结果。其中：(A) NC，(B) HC， (C) QC，(D) QP，(E) QD， (F) EC，(G) EP，(H) ED。
图5为本发明大鼠肝脏组织HE染色（×400）。其中：(A) NC，(B) HC， (C) QC，(D)QP，(E) QD， (F) EC，(G) EP，(H) ED。
图6为本发明 大鼠脑组织HE染色（×400）。其中：(A) NC，(B) HC， (C) QC，(D)QP，(E) QD， (F) EC，(G) EP，(H) ED。
图7为本发明大鼠肌肉组织HE染色（×400）。其中：(A) NC，(B) HC， (C) QC，(D)QP，(E) QD， (F) EC，(G) EP，(H) ED。
具体实施方式
实施例1 一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，该组合物由下述原料按重量份（g）配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷1份和栀子黄色素1份。
其中：肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为5%。
栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为5%。
实施例2 一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，该组合物由下述原料按重量份（g）配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷1份和栀子黄色素3份。
其中：肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为15%。
栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为15%。
实施例3 一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，该组合物由下述原料按重量份（g）配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷1份和栀子黄色素5份。
其中：肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为25%。
栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为25%。
实施例4 一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，该组合物由下述原料按重量份（g）配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷1份和栀子黄色素10份。
其中：肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为45%。
栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为45%。
实施例5 一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，该组合物由下述原料按重量份（g）配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷10份和栀子黄色素1份。
其中：肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为55%。
栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为55%。
实施例6 一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，该组合物由下述原料按重量份（g）配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷5份和栀子黄色素1份。
其中：肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为75%。
栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为75%。
实施例7 一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，该组合物由下述原料按重量份（g）配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷3份和栀子黄色素1份。
其中：肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为90%。
栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为90%。
上述实施例1~7中的药剂为药剂学上的任何一种剂型，这些剂型是指注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、口服液、片剂中的一种。
实施例8 制备颗粒剂
取肉苁蓉苯乙醇苷与栀子黄色素细粉等比例混合200 g，加入淀粉20g混合均匀，以质量浓度为10~12%的淀粉浆为粘合剂，湿法制粒，过12~14目筛后在65~75℃进行减压干燥，整粒，分装，每袋10 g，制得20袋。
实施例9 制备胶囊剂
取肉苁蓉苯乙醇苷与栀子黄色素细粉等比例混合200 g，加入0.6 g的微粉硅胶，混合均匀后，在JF-B胶囊分装机上进行自动分装，每粒0.35 g，制得胶囊560粒，然后在通过DXD铝塑复合袋包装机进行包装，每板10粒，每盒2板，共制得28盒。
上述实施例是对本次发明的详细说明，但不对本发明造成任何限制。在没有脱离本发明上述主要思想的前提下，根据本发明的内容而做出的任何相关变更，均在本发明的内容之内。

Claims (5)

1.一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，其特征在于：该组合物由下述原料按重量份配以药学上或生理学上可接受的载体，以常规的中药制备工艺制成的药剂：肉苁蓉苯乙醇苷1~10份和栀子黄色素1~10份。
2.如权利要求1所述的一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，其特征在于：所述药剂为药剂学上的任何一种剂型。
3.如权利要求2所述的一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，其特征在于：所述剂型是指注射剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊、粉剂、丸剂、口服液、片剂中的一种。
4.如权利要求1所述的一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，其特征在于：所述肉苁蓉苯乙醇苷是指从中药材肉苁蓉中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异毛蕊花糖苷总含量为5~90%。
5.如权利要求1所述的一种具有抗高原缺氧疲劳作用的中药组合物，其特征在于：所述栀子黄色素是指从中药材栀子中采用天然药物提取方法富集提取的混合物，其中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为5~90%。
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