CN103432462B

CN103432462B - 黑青稞籽皮类黄酮及其制备方法与应用

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Publication number: CN103432462B
Application number: CN201310400124.4A
Authority: CN
Inventors: 于群; 王璇琳; 贺敏; 李伟静; 任素萍; 苏丽华; 丁雪洁; 乔志新
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2033-09-05
Also published as: CN103432462A

Abstract

本发明一种黑青稞籽皮类黄酮及其制备方法与应用，属于植物有效成分的提取领域。本发明将未经粉碎的黑青稞籽皮分别经乙醇粗提、絮凝剂纯化、乙酸乙酯萃取和富集，得到黑青稞籽皮类黄酮。实验证明，该黑青稞籽皮类黄酮具有预防和治疗缺氧损伤，特别是心、脑缺氧损伤的功效，可替代资源短缺的红景天用于制备预防和治疗缺氧损伤药物，有广阔的工业应用前景。

Description

黑青稞籽皮类黄酮及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物有效成分的提取工艺，特别是涉及一种黑青稞籽皮中主要活性成分类黄酮的提取方法及其在制备预防和治疗缺氧损伤(特别是心、脑缺氧损伤)药物中的应用。

背景技术

青稞(Hordeumvulgaressp.vulgare)，又称裸大麦，是禾本科大麦属作物，在世界许多国家和地区作为主要粮食作物已有几千年历史。在西藏，青稞品种资源很丰富，不同颜色、不同形状的品种多达十几个，有时在同一地区能发现7-8个青稞品种。青稞分为白青稞、黑青稞、墨绿色青稞等种类，其中，黑青稞是西藏特有品种，喜马拉雅山北麓的山南地区措美县因气候、土壤特殊而盛产黑青稞，将其加工成糌粑后口感好，营养高，而且长期服用对治疗糖尿病、胃病等有明显的疗效，这是白青稞不具备的。

黑青稞富含膳食纤维、多种矿物质、维生素，能促进人体健康发育，所含的β-葡聚糖可预防结肠癌，有学者从黑青稞中提取花色素，而有关其中更丰富的类黄酮物质的相关研究至今未见报道。

随着食品科学的发展，黑色健康食品越来越受到人们的关注，黑色食品是指带天然黑色或紫红色的各种动植物食品，黑色食品的保健功能在我国古代的医学论著中有过许多论述：《本草纲目》中谈及黑米名为“粳谷奴”，具有滋养肝肾、健脾和胃、活血明目等功能，久食可延年益寿；在论述服黑豆时说它可“加气力、补虚损”、“又益阳道”；在《本经》上说到芝麻有“益气力、长肌肉、填髓脑”作用，对乌骨鸡、木耳、海带、香菇的健身评价也都很高。这些黑色健康食品所含有益于健康的成分黑色素成分就是类黄酮的一种。然而分析表明，更广泛的类黄酮具有保健功能，如抑制血小板凝固、预防血栓和心脏病、降血脂、抗癌、抗炎、保护视力、延缓衰老等。在黑青稞提取中，赵桃等介绍了一种黑青稞花色素的提取工艺(赵桃，马林，李嘉佳，杜静君，杨娟，杨凡，《食品研究与开发》2010年09期)，以黑青稞为原料，考察提取溶剂、酸化剂、提取温度、提取时间、料液比、提取次数和籽粒粉碎度等7个单因素对其花色素提取率的影响，确定了青稞色素的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度50％，温度53℃，时间3h，此时最大提取率为108.33μg/g。然该研究需将黑青稞籽粒粉碎，工艺复杂且影响提取率，且仅停留在花色素提取层面，只适于粗提，提取物难以分离，不适于工业化生产。迄今为止，尚未得到黑青稞籽皮类黄酮物质的提取方法及其应用的相关报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种可工业化实施的从黑青稞籽皮中提取类黄酮的方法。

本发明一种黑青稞籽皮类黄酮的制备方法，将未经粉碎的黑青稞籽皮分别经乙醇粗提、絮凝剂纯化、乙酸乙酯萃取和富集，得到黑青稞籽皮类黄酮。

所述粗提，是将黑青稞籽皮加入浓度为20％-60％(体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1：6-10(g:ml)，调pH值为2.0-5.0，40-60℃水浴2-5h，得到类黄酮粗提物的醇提液；优选粗提条件为乙醇浓度40％，pH2.0，水浴温度50℃，水浴时间3h。

所述絮凝剂为101絮凝剂；所述纯化为向乙醇粗提的醇提液中加入101絮凝剂，101絮凝剂的添加量为1％-2％(g/100ml)，在40-60℃水浴下搅拌，然后在3000-5000r/min条件下离心，取上清液，减压回收，馏出物为类黄酮粗品。

具体的，该方法包括以下步骤：

1)粗提：将黑青稞籽皮加入浓度为20％-60％(体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1：6-10(g:mL)，调pH值为2.0-5.0，40-60℃水浴2-5h，得到类黄酮粗提物的醇提液；

2)纯化：向类黄酮粗提物的醇提液中加入101絮凝剂，101絮凝剂的添加量为1％-2％(g/100ml)，在40-60℃水浴下搅拌，然后在3000-5000r/min条件下离心，取上清液，减压回收，馏出物为类黄酮粗品；

3)萃取：用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取：先将类黄酮粗品与水按体积比1：5-1：10混合，得到类黄酮粗品水悬液，再将类黄酮粗品水悬液加入乙酸乙酯中，类黄酮粗品水悬液与乙酸乙酯的体积比为1：5-1：10，振荡充分，静置，常温过夜，减压回收，馏出物为类黄酮精制物，在-20℃至-70℃下低温干燥，得到类黄酮精制物粉末；

4)富集：类黄酮精制物粉末溶于去离子水中配成溶液用于上样，用SephadexLH-20柱进行梯度洗脱，洗脱液为不同浓度的乙醇水溶液，水与乙醇的体积比依次为100:0、90:10、50:50、0:100，将洗脱物真空干燥，得到黑青稞籽皮类黄酮。

其中：所述步骤1)中优选的提取条件为乙醇浓度40％，pH2.0，水浴温度50℃，水浴时间3h。

所述步骤2)和步骤3)中减压回收条件为水浴50℃，压力0.09Mpa，冷水冷凝。

本发明的另一目的在于提供可替代花青素使用的食物来源的产品。该产品即为用以上方法获得的黑青稞籽皮类黄酮或中间品。所述中间品包括类黄酮粗提物的醇提液、类黄酮粗品、类黄酮精制物和类黄酮精制物粉末；所述黑青稞籽皮类黄酮纯度为95-98％。

本发明重要目的在于提供所述的黑青稞籽皮类黄酮或中间品在制备预防和治疗缺氧损伤药物或中的应用，所述缺氧损伤包括心衰、急性肺损伤、失血、脑缺血、心脑血管疾病、重创、淹溺和急性呼吸窘迫综合征等引起的缺氧症状。

本发明重要目的还在于提供黑青稞籽皮类黄酮或中间品在制备预防和治疗心、脑缺氧损伤药物中的应用，所述心、脑缺氧损伤包括心悸、胸闷、气促、头晕目眩、记忆障碍、神志不清、机体反应迟钝、酸痛乏力、手脚发麻。

实验证明，用本发明方法得到的黑青稞籽皮类黄酮具有预防和治疗缺氧损伤(特别是心、脑缺氧损伤)的功效，所述缺氧损伤包括心衰、急性肺损伤、失血、脑缺血、心脑血管疾病、重创、淹溺和急性呼吸窘迫综合征等引起的缺氧症状，所述心、脑缺氧损伤包括缺氧的一般表现为头晕、头痛、耳鸣、眼花、四肢软弱无力，继之有恶心、呕吐，呼吸浅快而弱，心跳快而无力。随着缺氧的加重，会渐次出现意识模糊，全身皮肤、嘴唇、指甲青紫、血压下降、瞳孔散大、昏迷，最后因呼吸困难、心跳停止、缺氧窒息而死亡。因此，黑青稞籽皮类黄酮在制备预防和治疗缺氧损伤药物，特别是预防和治疗心、脑缺氧损伤药物中的应用也属于本发明的保护范围。

应用中，所述药物含有黑青稞籽皮类黄酮或中间品，产品本身可成药，也可加入其它药用辅料；药物剂型可为口服制剂、静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或腹腔注射制剂；其中，口服制剂的剂型具体可为散剂、溶液剂、颗粒剂、片剂或胶囊等，口服制剂中黑青稞籽皮类黄酮的含量为200mg-500mg/片；注射制剂中黑青稞籽皮类黄酮的含量为50mg-100mg/支。

黑青稞籽皮类黄酮的有效治疗剂量为0.5-5g/kg体重，小鼠实验优选为1.75-3.5g/kg体重，因此，上述口服药物的人的用量一般为300mg-800mg/kg体重/day，疗程一般为5-7天；注射药物的用量一般为0.83mg-1.66mg/kg体重/day，疗程一般为3-5天。用量和疗程可根据实际情况进行调整，本申请仅提供数据支持，不对具体使用给出任何限制。

采用以上方案，本发明提供了从黑青稞籽皮中提取类黄酮的方法、产品及其新用途。本发明制备工艺，直接使用原态黑青稞籽皮，未经粉碎，简化了工艺而能达到很好的提取效果；通过絮凝剂的纯化，有效除去了粗提物醇提液中的杂蛋白，并进而结合萃取和柱富集，能够得到纯度较高黑青稞籽皮类黄酮，使产业生产和应用成为可能。实验证明，本发明提供的黑青稞籽皮提取物(类黄酮)显著延长了小鼠密闭缺氧后的存活时间，说明对脑缺氧或心肌缺血有改善作用，小鼠灌胃3天既能看到显著延长常压耐缺氧的存活时间；在断头实验中，脑血液供应中断，但脑中原有的血和营养物质尚能使脑功能维持一段时间，表现在小鼠规律地喘气，实验结果表明黑青稞籽皮提取物可明显延长小鼠的喘气时间，能够使脑耗能减少，对断头脑缺氧有保护作用；通过三种不同类型的细胞缺氧损伤实验，证明黑青稞籽皮提取物能够有效防治过氧化氢、百草枯、连二亚硫酸钠对H9C2(大鼠胚胎心肌)细胞的缺氧损伤，说明黑青稞籽皮提取物对大鼠心肌细胞各种缺氧损伤均具有保护作用，即具有心肌细胞保护作用；通过小鼠负重游泳实验说明黑青稞籽皮提取物还具有较好的抗疲劳功能。上述实验证明，黑青稞籽皮提取物(类黄酮)具有预防和治疗缺氧损伤(特别是心、脑缺氧损伤)的功效，所述缺氧损伤包括心衰、急性肺损伤、失血、脑缺血、心脑血管疾病、重创、淹溺和急性呼吸窘迫综合征等引起的缺氧症状，所述心、脑缺氧损伤包括心悸、胸闷、气促、头晕目眩、记忆障碍、神志不清、机体反应迟钝、酸痛乏力、手脚发麻等。因此，可以黑青稞籽皮提取物(类黄酮)为活性成分制备预防和治疗缺氧损伤药物，特别是预防和治疗心、脑缺氧损伤药物，应用前景广阔。

本发明更实际意义及优势在于：本发明黑青稞籽皮类黄酮来源于食物，具有服用安全的特点，而在耐缺氧方面与红景天具备相似功效，由于红景天属于珍贵的藏药资源，资源有限，因此有望以天然、绿色、低成本食品来源的黑青稞替代藏药来源的红景天。目前，进藏防治高原缺氧主要采用提前服用红景天系列产品的方法，大多数以红景天复方为主，由于体质原因，服用后出现部分人群过敏现象，而本发明产品为单方成分，可以避免过敏现象发生，这是本发明产品黑青稞籽皮类黄酮的优势所在。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为乙酸乙酯萃取后的醇提物的硅胶薄层层析结果

图2为乙酸乙酯萃取后的醇提物的紫外-可见光谱图

图3A为黑青稞籽皮提取物的紫外-可见光谱全波长扫描图

图3B为类黄酮标准品的紫外-可见光谱全波长扫描图

图4A为黑青稞籽皮提取物的外观形态

图4B为黑青稞籽皮提取物分离单体的外观形态

图5A为常压耐缺氧实验中小鼠体重的变化情况

图5B为黑青稞籽皮提取物对小鼠常压耐缺氧实验中生存时间的影响

图6A为小鼠急性脑缺血实验中小鼠体重的变化情况

图6B为黑青稞籽皮提取物对小鼠急性脑缺血实验中存活时间的影响

图7A为黑青稞籽皮提取物预防过氧化氢(H₂O₂)对H9C2细胞损伤的结果

图7B为黑青稞籽皮提取物治疗过氧化氢(H₂O₂)对H9C2细胞损伤的结果

图8A为黑青稞籽皮提取物预防百草枯(PQ)对H9C2细胞损伤的结果

图8B为黑青稞籽皮提取物治疗百草枯(PQ)对H9C2细胞损伤的结果

图9A为黑青稞籽皮提取物治疗连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)对H9C2细胞损伤2.5h的结果

图9B为黑青稞籽皮提取物治疗连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)对H9C2细胞损伤7.0h的结果

图10为黑青稞籽皮提取物对H9C2细胞线粒体膜电位的影响

图11为黑青稞籽皮提取物对H9C2细胞凋亡的影响

图12A为黑青稞籽皮提取物对线粒体膜电位的影响

图12B为黑青稞籽皮提取物对BCl-2蛋白的影响

图13为黑青稞籽皮提取物对小鼠负重游泳抗疲劳的影响

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明提出的黑青稞籽皮类黄酮，是将原态黑青稞籽皮(无需粉碎)经乙醇粗提、絮凝剂纯化、乙酸乙酯萃取和富集后得到。

具体的，从黑青稞籽皮中提取类黄酮可包括以下步骤：

1)粗提：将黑青稞籽皮加入浓度为20％-60％(体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1：6-10，调pH值为2.0-5.0，40-60℃水浴2-5h，得到类黄酮粗提物的醇提液；

2)纯化：向类黄酮粗提物的醇提液中加入101絮凝剂，101絮凝剂的添加量为1％-2％(g/100ml)，在40-60℃水浴下搅拌以40-80r/min搅拌2-4min，然后在3000-5000r/min条件下离心5-10min，取上清液，减压回收(减压回收条件为水浴50℃，压力0.09Mpa，冷水冷凝)，馏出物为类黄酮粗品；

3)萃取：用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取，萃取法方法为：先将类黄酮粗品与水按体积比1：5-1：10混合，得到类黄酮粗品水悬液，再将类黄酮粗品水悬液加入乙酸乙酯中，类黄酮粗品水悬液与乙酸乙酯的体积比为1：5-1：10，振荡充分，静置，常温过夜(10-12小时)，减压回收(减压回收条件为50℃，压力0.09Mpa，冷水冷凝)馏出物为类黄酮精制物，在-20℃至-70℃下低温干燥，得到类黄酮精制物粉末；

4)富集：类黄酮精制物粉末溶于微量去离子水中配成溶液用于上样，用SephadexLH-20柱进行梯度洗脱(分离、浓缩)，洗脱液为不同浓度的乙醇水溶液，水与乙醇的体积比依次为100:0、90:10、50:50、0:100，将洗脱物真空干燥，得到黑青稞籽皮类黄酮。

在上述从黑青稞籽皮中提取类黄酮的方法中，本发明进一步优化了工艺参数：

步骤1)中将黑青稞籽皮用乙醇进行浸提是因为大部分类黄酮物质易溶于一定浓度乙醇，乙醇浓度选择20％-60％(体积百分比浓度)是因为本发明原料黑青稞籽皮中大部分水溶性及中等极性的类黄酮物质在此浓度下可被溶出；选择黑青稞籽皮与乙醇的体积比为1：6-10，是以最经济的溶剂获得最大提取率；pH值2.0-5.0(优选2.0，用柠檬酸调pH值)，考虑类黄酮物质成分在酸性条件下可获得较为稳定的保护；40-60℃水浴2-5h条件下浸提，是因为某些类黄酮物质成分受到高温(60℃以上)易发生变化。进一步，步骤1)优选的提取条件为乙醇浓度40％，pH2.0，水浴温度50℃，水浴时间3h。

步骤2)中用絮凝剂絮凝纯化的目的主要是去除蛋白和鞣质，可选择的中药絮凝剂有鞣酸、明胶、蛋清、101絮凝剂、ZTC澄清剂、壳聚糖等，101絮凝剂可最大限度保留药液的类黄酮有效成分，去除蛋白和鞣质，因此为本发明的优选。101絮凝剂为商购产品，食品级，以天然铝硅酸盐粘土为原料，经精制、复配而成。其功效为：有效吸附提取液中的蛋白质、鞣质等成分。步骤2)中离心的目的是保留类黄酮物质，去除蛋白；减压回收的目的是浓缩提取物。

所述步骤3)中用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取的目的是精制类黄酮提取物；低温干燥的目的是不破坏类黄酮化学结构。

所述步骤4)用SephadexLH-20柱进行分离、浓缩的目的是分离类黄酮单体确定功效成分，选择SephadexLH-20柱的原因是其对类黄酮物质分离效果好；真空干燥的目的是合并浓缩提取物。

经检测，用上述方法从黑青稞籽皮中提取的类黄酮的纯度为95-98％。

本发明的粗提工艺以正交试验确定：

正交试验：提取工艺的确定

本发明在黑青稞综合开发中，首先利用正交试验，筛选了实验条件(表1所示)下黑青稞籽皮类黄酮的最佳粗提工艺。

表1正交试验因素及水平选取

粗提操作：按表2所示因素变化将黑青稞籽皮加入乙醇溶液中浸提，黑青稞籽皮质量M与乙醇的体积V比为1：10(g:ml)，调pH值，水浴加热浸提，得到类黄酮粗提物的醇提液。

粗提物的提取率以类黄酮物质的花色素含量为参考指标：

提取率＝A535×V×N×1000/98.2×M

公式中：提取率μg/g；A535为535nm处的吸光度；V为稀释后的体积(单位ml)；N为稀释倍数；1000为单位换算倍数(mg/g--μg/g)；98.2为花色素的平均消光系数；M为样品(黑青稞籽皮)重量(单位，g)。

正交实验结果参见表2、表3、表4-1～表4-4所列数据。

表2正交试验结果L9(3⁴)

表3正交试验方差分析

DependentVariable：含量

表4-1浸提pH

DependentVariable：含量

表4-2浸提时间h

DependentVariable：含量

表4-3浸提温度

DependentVariable:含量

表4-4乙醇浓度

DependentVariable:含量

正交试验结果表明：①四个因素对提取结果都有影响。表2的试验结果表明，9组试验中，2号试验的含量最高，提取效果最好，相应的水平组合A₁B₂C₂D₂是提取黑青稞籽皮类黄酮的最佳工艺，即pH2.0，提取时间3h，水浴温度为50℃，乙醇浓度40％。

②4个因素对提取效果的影响程度不同。表3结果表明，4个因素对提取效果的影响顺序为：pH>乙醇浓度>提取温度>提取时间。pH极差值最大是水浴浸提法提取工艺的关键控制因素。

③方差分析表3结果表明，ABCD四个条件对提取效果均具有极显著性差异，最佳提取工艺为A₁B₂C₂D₂，即pH2.0，提取时间3h，水浴温度为50℃，乙醇体积浓度40％提取效果最好。

实施例、获得黑青稞籽皮提取物

黑青稞籽皮提取物的获得方法，包括以下步骤：

1)将粒状未经粉碎的黑青稞籽皮(直接使用原态黑青稞的皮)加入浓度为20％-60％(体积百分比浓度)的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1：6-10(按照传统的提取经验，小于1:6提取不充分，大于1:10会提高生产成本)，调pH值为2.0-5.0，40-60℃水浴2-5h。

优选的提取条件为乙醇浓度40％，pH2.0，水浴温度50℃，水浴时间3h，得到类黄酮粗提物的醇提液；

2)用101絮凝剂(购自北京沃特利源环保科技有限公司)絮凝纯化类黄酮粗提物的醇提液，101絮凝剂的添加量为1％-2％(质量/体积(g/V)百分比浓度)，絮凝条件为40-60℃水浴，搅拌40-80r/min，搅拌时间2-4min，然后在3000-5000r/min条件下离心5-10min，得到含类黄酮的上清液，减压回收(减压回收条件为水浴50℃，压力0.09，冷水冷凝)，得到类黄酮粗品；

3)用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取，萃取法方法为：先将类黄酮粗品与水按体积比1：5-1：10混合，得到类黄酮粗品水悬液，再将类黄酮粗品水悬液加入乙酸乙酯中，类黄酮粗品水悬液与乙酸乙酯的体积比为1：5-1：10，振荡充分，常温过夜(10-12小时)，减压回收(减压回收条件为50℃，压力0.09，冷水冷凝)类黄酮精制物，在-20℃至-70℃下低温干燥，得到类黄酮精制物粉末；

4)用SephadexLH-20柱(购自GE公司)对类黄酮精制物粉末进行梯度洗脱(分离、浓缩)，洗脱液为不同浓度的乙醇水溶液，水与乙醇的体积比依次为100：0、90：10、50：50、0：100，真空干燥，得到黑青稞籽皮类黄酮。

对以上方法得到的产物进行鉴定：

步骤3)中乙酸乙酯萃取后的醇提物的硅胶薄层层析结果如图1(1：氯化矢车菊素；2：矢车菊素葡萄糖苷；3：花青素鼠李葡糖苷；4：矢车菊素-3,5-二-氧-葡萄糖苷；5：氯化花翠素；6：氯化花葵素；7：天竺葵素-3-氧-葡萄糖苷；8：锦葵色素；样1：pH2.0条件下的醇提物；样2：pH7.0条件下的醇提物)所示，可以看出，黑青稞籽皮醇提物的主要成分为类黄酮。

从硅胶薄层层析结果来看，提取物中既含有花色素，又含有其它类黄酮物质(花色素属于类黄酮物质的一种)。

步骤3)中乙酸乙酯萃取后的醇提物的紫外-可见光谱如图2所示，可以看出，在290nm-330nm处有吸收峰，说明存在酰基化的类黄酮。

步骤4)获得的黑青稞籽皮提取物的紫外-可见光谱全波长扫描图如图3A所示，可以看出，黑青稞籽皮提取物在275nm、530nm附近有吸收峰，属于黑青稞籽皮提取物的特征吸收峰，类黄酮标准品的紫外-可见光谱全波长扫描图如图3B所示，可以看出在275nm处均出现类黄酮物质的特征吸收峰，进一步判断黑青稞籽皮提取物的主要成分为类黄酮。在290nm-330nm处有吸收峰，说明存在酰基化的类黄酮。经检测，黑青稞籽皮提取物中类黄酮的纯度为95-98％。黑青稞籽皮提取物的外观形态如图4A所示，为黄褐色粉末，黑青稞籽皮提取物分离单体的外观形态如图4B所示。

以下使用实施例1中步骤1)优选提取工艺，经过步骤2)-步骤4)得到的黑青稞籽皮类黄酮进行实验。

实验例1、黑青稞籽皮提取物(类黄酮)延长小鼠常压耐缺氧的生存时间

昆明小鼠，全雄，30只，18-22g，每组10只，对照组灌胃给予生理盐水，连灌3天，体积0.2mL，中剂量组1.75g黑青稞籽皮提取物/kg(体重)，高剂量3.5g黑青稞籽皮提取物/kg(体重)，黑青稞籽皮提取物配成终浓度为35g/mL。最后一次灌胃完毕1个小时进行常压耐缺氧实验。

具体实验方法：将小鼠放入广口磨口瓶中密封，瓶内放钠石灰10g，吸收二氧化碳和水，垫滤纸用于吸收尿液，记录小鼠存活时间，以呼吸停止为指标。

实验结果如表5和图5A、图5B所示，小鼠在密闭容器中受缺氧因素损害，主要反应在心和脑缺氧，常压耐缺氧为非特异性缺氧(非特异性缺氧是指不属于病理性、生理性、运动性和环境性缺氧类型)，体重变化情况显示黑青稞籽皮提取物对小鼠体重无影响，说明黑青稞籽皮提取物对小鼠是安全的，缺氧存活时间显示黑青稞籽皮提取物高剂量组较对照组显著延长了小鼠的存活时间，说明对脑缺氧或心肌缺血有改善作用。

表5小鼠常压耐缺氧实验结果

注：**表示与生理盐水组相比p＜0,01

实验例2、黑青稞籽皮提取物(类黄酮)延长小鼠急性脑缺血存活时间

昆明小鼠，体重18-22g，随机分为2组，每组10只，对照组腹腔注射生理盐水0.02mL/g，实验组腹腔注射黑青稞籽皮提取物2.0g黑青稞籽皮提取物/kg(体重)，黑青稞籽皮提取物配成终浓度为35g/mL。10min后，不需麻醉，用大剪刀在耳下部快速断头，记录喘气时间并进行t检验。

实验结果如表6和图6A、图6B所示，在断头实验中，脑血液供应中断，但脑中原有的血和营养物质尚能使脑功能维持一段时间，表现在小鼠规律地喘气，黑青稞籽皮提取物对小鼠体重无影响，说明黑青稞籽皮提取物对小鼠是安全的。存活时间反映出黑青稞籽皮提取物较对照组可明显延长小鼠的喘气时间，能够使脑耗能减少，对断头脑缺氧有保护作用。

表6小鼠急性脑缺血实验结果

注：*表示与生理盐水组相比p＜0,05

实验例3、黑青稞籽皮提取物(类黄酮)对大鼠心肌胚胎细胞(H9C2)缺氧损伤的防治作用

一、黑青稞籽皮提取物预防和治疗过氧化氢(H₂O₂)对H9C2细胞的损伤

1、H9C2细胞(购自上海基免生物科技有限公司)铺入96孔板中

①细胞传代；②细胞计数，以每孔4.0×10⁴个/mL计数所需细胞体积；③用培养基稀释细胞浓度至4.0×10⁴个/mL，吹打均匀；④向96孔板中，每孔加入100μL上述细胞溶液(四周孔除外)；⑤放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育54h。

2、H9C2细胞损伤预防和治疗处理

①配制细胞损伤液：30％H₂O₂溶液用DMEM稀释成0.03％H₂O₂溶液作为损伤液；

②配制系列浓度梯度的黑青稞籽皮提取物溶液：原液用100mg/mL提取物，稀释液用含血清的培养基，稀释配制成800、400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL的黑青稞籽皮提取物溶液；

③将96孔板中原培养基用注射器吸出：(1)空白对照组加入含15％血清的正常培养基，损伤对照组和治疗组加入损伤液，每孔100μL；观察细胞形态变化：H₂O₂损伤10min后，吸出损伤液，空白对照和损伤对照组加入含血清的正常培养基，治疗组加入分别加入上述浓度梯度的提取物溶液，每孔100μL，将96孔板放入37℃、5％CO₂培养箱中继续培养18h；(2)空白对照和损伤对照组加入含血清的正常培养基，预防治疗组加入上述系列浓度梯度的提取物溶液，每孔100μL，将96孔板放入37℃、5％CO₂培养箱中培养18h后，将96孔板内液体吸出，空白对照组加入含血清的正常培养基，损伤对照和治疗组加入损伤液，H₂O₂损伤10min。

3、MTT检测

①孵育相应时间后每孔加入10μLMTT溶液，放入培养箱中继续孵育4h；②每孔加入100μLSDS，再放入培养箱中孵育12h；③酶标仪读数OD570值。

实验结果如图7A、图7B所示，过氧化氢(H₂O₂)损伤主要是由于产生的大量氧自由基对大鼠心肌细胞(H9C2)产生的急性损伤，从实验结果可以看出，黑青稞籽皮提取物在一定剂量范围(75μg/mL-300μg/mL)下对该损伤具有预防和治疗作用。

二、黑青稞籽皮提取物预防和治疗百草枯(PQ)对H9C2细胞的损伤

1、H9C2细胞铺入96孔板中

2、H9C2细胞损伤预防和治疗处理

①配制细胞损伤液：称取1.03mgPQ(百草枯)溶解到10mL含15％血清的培养基中，即得到400μMPQ溶液(细胞损伤液)；

③将96孔板中原培养基用注射器吸出：(1)空白对照组加入含15％血清的正常培养基，损伤对照组和治疗组加入损伤液，每孔100μL；观察细胞形态变化：PQ损伤18h后，吸出损伤液，空白对照和损伤对照组加入含血清的正常培养基，治疗组加入分别加入上述浓度梯度的提取物溶液，每孔100μL，将96孔板放入37℃、5％CO₂培养箱中继续培养18h；(2)空白对照和损伤对照组加入含血清的正常培养基，预防治疗组加入上述系列浓度梯度的提取物溶液，每孔100μL，将96孔板放入37℃、5％CO₂培养箱中培养18h后，将96孔板内液体吸出，空白对照组加入含血清的正常培养基，损伤对照和治疗组加入损伤液，PQ损伤18h。

3、MTT检测

实验结果如图8A、图8B所示，百草枯(PQ)损伤主要是由于产生的大量氧自由基对大鼠心肌细胞(H9C2)产生的慢性损伤，从实验结果可以看出，黑青稞籽皮提取物在一定剂量范围(6.25μg/mL-800μg/mL)下对该损伤具有预防和治疗作用。

三、黑青稞籽皮提取物治疗连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)对H9C2细胞的损伤

1、H9C2细胞铺入96孔板中

2、H9C2细胞低氧损伤处理

①配制细胞低氧损伤液：称取14mgNa₂S₂O₄溶于10mL低糖DMEM中，即得到8mMNa₂S₂O₄溶液(损伤液)，现用现配，避光；

②将96孔板中原培养基用注射器吸出，用PBS漂洗后，空白对照组加入不含Na₂S₂O₄的低糖DMEM，损伤对照组和给药组加入上述损伤液，每孔均加100μL；

③将96孔板放入37℃、5％CO₂培养箱中，每10min镜下观察细胞形态变化；

④90min后，细胞形态发生改变，不再呈长梭形，形态各异，呈细长条状、分枝状等，部分细胞从壁上脱落，且细胞数量减少。

3、H9C2细胞缺氧前(预防)、后(治疗)给药

①配制系列浓度梯度的黑青稞籽皮提取物溶液：原液用100mg/mL黑青稞籽皮提取物溶液，稀释液用含血清的培养基，稀释配制成1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8μg/mL的花色苷溶液；②将原低糖DMEM和损伤液吸出，空白对照和损伤对照组加入正常含血清的培养基，给药组分别加入上述浓度梯度的提取物溶液，每孔均加100μL；③放入培养箱中孵育。

4、MTT检测

实验结果如图9A、图9B所示，连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)通过制造缺氧微环境对H9C2细胞进行损伤，从实验结果可以看出，黑青稞籽皮提取物治疗2.5h和7h显示出对该损伤的显著治疗作用。

四、黑青稞籽皮提取物(类黄酮)对H9C2损伤细胞线粒体膜电位的影响

1、H9C2细胞损伤处理

①配制细胞低氧损伤液：称取7mgNa₂S₂O₄溶于7.3mL低糖DMEM中，配成6mMNa2S2O4溶液，现用现配，避光；

②原培养基用注射器吸出，用100μLPBS漂洗后吸出，空白对照组和本底加入低糖DMEM，损伤对照组加入损伤液，均为100μL；

③放入培养箱中损伤15，21min。

2、黑青稞籽皮提取物(类黄酮)对H9C2损伤细胞的干预

①给药，药物浓度为75，150，300μg/mL，给药5h；

②将损伤液用注射器吸出，加入正常培养基，每孔100μL；

③给药组药物浓度为75，150，300μg/mL，给药5h3、JC-1染色工作液的配制。

六孔板每孔所需JC-1(C₂₅H₂₇Cl_4IN₄)染色工作液的量为1mL，其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每50-100万细胞需0.5mLJC-1染色工作液。取适量JC-1(200×)，按照每50μlJC-1(200×)加入8mL超纯水的比例稀释JC-1。剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mLJC-1染色缓冲液(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液，该染色液的作用是显示线粒体膜的完整性。

4、阳性对照的设置

把线粒体膜电位检测(jc-1)试剂盒(购自碧云天)中提供的CCCP(10mM)推荐按照1：1000的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处理细胞20分钟。随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10μMCCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。

5、细胞操作

a.取10-60万细胞，重悬于0.5mL细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

b.加入0.5mLJC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

c.在孵育期间，按照每1mLJC-1染色缓冲液(5×)加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1×)，并放置于冰浴。

d.37℃孵育结束后，600g、4℃离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

e.用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次：加入1mLJC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞，600g、4℃离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入1mLJC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞，600g、4℃离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。

f.再用适量JC-1染色缓冲液(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

实验结果如图10(横坐标表示药物剂量，纵坐标表示红绿荧光的比值；normal表示阴性对照组，ant0、ant75、ant150、ant300分别表示阳性对照组和不同药物剂量组损伤完毕(先进行损伤然后加入药物)加入黑青稞籽皮提取物进行干预，ant0、ant75、ant150、ant300分别表示阳性对照组、75μg/mL药物处理组、150μg/mL药物处理组、300μg/mL药物处理组)；***表示p<0.001)所示，可以看出，黑青稞籽皮提取物对H9C2损伤细胞的线粒体膜电位具有显著的修复作用。

五、黑青稞籽皮提取物(类黄酮)对H9C2细胞凋亡的影响

使用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒：北京宝赛生物技术有限公司(货号：CX1001)

①H9C2细胞凋亡处理方法：细胞传代及铺板，每孔细胞数2.5×105，孵育15h；6mM连二亚硫酸钠损伤15min；收集培养基，用PBS洗涤细胞后，用胰酶消化，PBS冲洗孔壁，收集所有液体于15mL离心管中，1000rpm离心10min后弃上清；用1mLPBS重悬后，4℃，1000rpm离心10min后弃上清，重复2次。

②黑青稞籽皮提取物(类黄酮)进行干预的方法：PBS润洗①中损伤细胞后加入培养基同时给药，药物浓度为75，150，300μg/mL，给药5h。

检测包括以下步骤：

1、收集细胞：收集细胞{数目约(1-5)×10⁶个/mL}，500-1000r/min离心5min，弃去培养液。

2、细胞洗涤：3mLPBS洗涤1次。

3、乙醇固定：离心去PBS，加入冰预冷的70％乙醇固定，4℃、1-2小时。

4、细胞重悬：离心弃去固定液，3mLPBS重悬5min。

5、细胞过滤：400目的筛网过滤1次，500-1000r/min离心5min，弃去PBS。

6、染色：用1mLPI染液染色，4℃避光30min。

7、流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

实验结果如图11(横坐标表示不同的药物剂量组，纵坐标表示红绿荧光比值；normal表示阴性对照组，ant0、ant75、ant150、ant300分别表示阳性对照组、不同药物剂量组损伤完毕(先进行损伤然后加入药物)加入黑青稞籽皮提取物进行干预，ant0、ant75、ant150、ant300分别表示阳性对照组、75μg/mL药物处理组、150μg/mL药物处理组、300μg/mL药物处理组)；***表示p<0.001，**表示p<0.01)所示，可以看出，黑青稞籽皮提取物对H9C2损伤细胞的凋亡具有保护作用，它能阻止自由基等不利因素对细胞的损伤，阻止细胞凋亡的发生。

六、黑青稞籽皮提取物(类黄酮)对BCl-2(膜整合蛋白，又称Bcl-2)蛋白的影响

H9C2细胞凋亡处理和黑青稞籽皮提取物(类黄酮)对H9C2损伤细胞的干预方法同于实施例1中五①②

实验按照经典蛋白免疫印迹(Westernblot)操作方法进行，具体方法为包括以下步骤：

分组：阴性对照组、阳性对照组、75μg/mL,150μg/mL,300μg/mL药物处理组(一)蛋白质样品(细胞总蛋白)获得：H9C2凋亡细胞加200μL的工作(WR)液(工作液(WR)配比方法：试剂A(配方：①1L：分别称取10gBCA(1％)，20gNa₂CO₃·H₂O(2％)，1.6gNa₂C₄H₄O₆·2H₂O(0.16％)，4gNaOH(0.4％)，9.5gNaHCO₃(0.95％)，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO₃调节pH值至11.25)：试剂B(配方：50ml：取2gCuSO₄·5H₂O(4％)，加蒸馏水至50ml)＝50：1，机械或超声波室温匀浆0.5-1min，然后4℃、13,000g离心15min，取上清液作为样品。

(二)电泳：制备电泳凝胶，进行15％分离胶、5％浓缩胶的SDS-PAGE。

(三)转移：(半干式转移)

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm²，转移1.5h。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50％甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

(四)免疫反应：

1、用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

2、加入封闭液(配方：5％的脱脂奶粉溶液)，平稳摇动，室温2h。

3、弃封闭液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗(一抗为BCl-2抗体(购自CellSignalTechnology)，按合适稀释比

例用0.01MPBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃放置12h以上。阴性对照，以1％BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5、弃一抗和1％BSA，用0.01MPBS分别洗膜，5min×4次。

6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(二抗为IRDye800CW(购自Li-CoR)，按合适稀释比例用0.01MPBS稀释)，平稳摇动，室温1h。

7、弃二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

对线粒体膜电位影响实验结果如图12A所示，对BCl-2蛋白影响的实验结果如图12B所示，图中：ant0-、ant0+、ant75、ant150、ant300分别表示阴性对照组、阳性对照组、不同药物剂量组(损伤完毕加入黑青稞籽皮提取物进行干预，药物浓度75μg/mL、150μg/mL、300μg/mL)，Gapdh表示内参蛋白。图中可以看出，黑青稞籽皮提取物通过上调Bcl-2蛋白的表达发挥影响线粒体膜电位的作用，Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的编码产物，是细胞存活促进因子，属膜整合蛋白，分子量为26kDa，定位于线粒体、内质网和连续的核周膜，在胚胎组织中广泛表达。Bcl-2蛋白家族是一个特别的家族，目前已发现25种Bcl-2家族同源蛋白，其成员中有些促进凋亡，如Bad、Bid、Bax，有些成员阻止细胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w。Bcl-2能够阻止细胞色素c从线粒体释放到细胞质，从而抑制了细胞凋亡。

实验例4、黑青稞籽皮提取物(类黄酮)对小鼠负重游泳抗疲劳的影响

实验方法为：取雄性昆明小鼠，筛选出的20只合格小鼠随机分为2组，每组10只。各组分别灌胃给予生理盐水或黑青稞籽皮提取物3.5g/kg体重，连续3天，末次给药后1h，在鼠尾根部负荷5％体重的铅皮，置于水温26±1℃、水深约30cm的游泳箱中游泳，至小鼠沉入水底6s后不再浮起作为力竭死亡标准，记录自游泳开始至死亡时间，作为小鼠负重游泳时间。

实验结果如图13(横坐标表示两个剂量组，纵坐标表示小鼠存活时间；*表示p<0.05具有显著性差异)所示，可以看出，游泳是全身消耗性运动，剧烈的运动消耗大量的能量和氧气，同时产生大量的乳酸。黑青稞籽皮提取物使机体更节省利用糖原和三磷酸腺苷为肌肉活动提供更充分的能量。

Claims

1.一种黑青稞籽皮类黄酮的制备方法，将未经粉碎的黑青稞籽皮分别经乙醇粗提、絮凝剂纯化、乙酸乙酯萃取和富集，得到黑青稞籽皮类黄酮其特征在于，包括以下步骤：

1)粗提：将黑青稞籽皮加入体积百分比浓度为20％-60％的乙醇中浸提，黑青稞籽皮与乙醇的质量/体积比为1g：(6-10)mL，调pH值为2.0-5.0，40-60℃水浴2-5h，得到类黄酮粗提物的醇提液；

2)纯化：向类黄酮粗提物的醇提液中加入用于去除蛋白和鞣质的絮凝剂，絮凝剂与所述类黄酮粗提物的醇提液的质量体积比为(1-2)g/100mL，在40-60℃水浴下搅拌，然后在3000-5000r/min条件下离心，取上清液，减压回收，馏出物为类黄酮粗品；

3)萃取：用乙酸乙酯对类黄酮粗品进行萃取：先将类黄酮粗品与水按体积比(1：5)-(1：10)混合，得到类黄酮粗品水悬液，再将类黄酮粗品水悬液加入乙酸乙酯中，类黄酮粗品水悬液与乙酸乙酯的体积比为(1：5)-(1：10)，振荡充分，静置，常温过夜，减压回收，馏出物为类黄酮精制物，在-20℃至-70℃下低温干燥，得到类黄酮精制物粉末；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的提取条件为乙醇浓度40％，pH2.0，水浴温度50℃，水浴时间3h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)中减压回收条件为水浴50℃，压力0.09Mpa，冷水冷凝。

4.权利要求1-3任一所述方法获得的黑青稞籽皮类黄酮或中间品，所述中间品包括类黄酮粗提物的醇提液、类黄酮粗品、类黄酮精制物和类黄酮精制物粉末；所述黑青稞籽皮类黄酮纯度为95-98％。

5.权利要求4所述的黑青稞籽皮类黄酮或中间品在制备预防和治疗缺氧损伤药物中的应用，所述缺氧损伤为脑缺血、脑缺氧或心肌缺血引起的缺氧症状。

6.权利要求4所述的黑青稞籽皮类黄酮或中间品在制备预防和治疗心、脑缺氧损伤药物中的应用，所述心、脑缺氧损伤包括心悸、胸闷、气促、头晕目眩、记忆障碍、神志不清、机体反应迟钝、酸痛乏力、手脚发麻。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述药物含有黑青稞籽皮类黄酮或中间品；剂型为口服制剂、静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或腹腔注射制剂；其中，口服制剂的剂型具体为散剂、溶液剂、颗粒剂、片剂或胶囊，口服制剂中黑青稞籽皮类黄酮的含量为200mg-500mg/片；注射制剂中黑青稞籽皮类黄酮的含量为50mg-100mg/支。