CN111588716A - 一种药物组合物及其在制备治疗前列腺炎产品应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药物组合物及其在制备治疗前列腺炎产品应用。本发明药物组合物,包括如下质量份的组分制成:番茄红素1份;槲皮素0.5~2份;姜黄素0.5~2份。一种药物的活性成分为上述的药物组合物。本发明药物组合物或药物应用于制备治疗动物和/或人前列腺炎产品中。本发明药物组合物中番茄红素、槲皮素和姜黄素联合应用,能够协同作用,从而提高治疗前列腺炎的作用效果;本发明番茄红素、槲皮素和姜黄素联合应用,能够减少番茄红素的用量,从而减少因番茄红素价格导致的生产成本;本发明番茄红素、槲皮素和姜黄素联合应用,为临床开发新型治疗慢性前列腺炎药物提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物组合物及其在制备治疗前列腺炎产品应用,属于生物技术及医药制备领域。
背景技术
前列腺炎是成年男性的常见疾病,特别是慢性非细菌性前列腺炎,其发病机制尚不明确,临床缺乏有效的治疗手段,给患者和医生造成了巨大的困扰和挑战。因此,寻找新型、有效的治疗前列腺炎药物,具有重要的科研和临床价值。
番茄红素是一种重要的类胡萝卜素,含有11个共轭双键,这种高共轭结构使其具有强抗氧化作用,另外还具有较强的抗炎、细胞生长代谢起调控作用、可以调节胆固醇的代谢、保健作用、预防和抑制肿瘤的作用。
番茄红素、槲皮素和姜黄素见于多种炎性疾病的基础研究,如肝炎、胰腺炎、葡萄膜炎、缺血再灌注损伤等,但是在治疗前列腺炎领域涉及甚少,且番茄红素、槲皮素和姜黄素联合用药的研究尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种药物组合物及其在制备治疗前列腺炎产品应用,本发明药物组合物中番茄红素、槲皮素和姜黄素能协同作用,治疗动物和/或人前列腺炎。
本发明提供的一种药物组合物,包括如下质量份的组分制成:
番茄红素 1份;
槲皮素 0.5~2份;
姜黄素 0.5~2份。
上述的药物组合物中,所述药物组合物具体可由如下质量份的组分制成:
番茄红素 1份;
槲皮素 1份;
姜黄素 1份。
本发明还提供了一种药物,该药物的活性成分为上述的药物组合物。
上述的药物中,所述药物的剂型为口服制剂。
上述的药物中,所述药物的剂型为混悬剂或片剂,优选混悬剂。
本发明中,制成上述剂型的所述药物的辅料为药学上可接受的常见辅料。
上述的药物中,所述药物的混悬剂为番茄红素、槲皮素混和姜黄素的混合物制成的混悬液,具体可为番茄红素混悬液、槲皮素混悬液和姜黄素混悬液混合得到的混合物。
上述的药物中,所述药物的混悬剂为番茄红素混悬液、槲皮素混悬液和姜黄素混悬液组成,即为单独混悬液组成的套装。
上述的药物中,当所述药物为混悬剂时,所述番茄红素混悬液、所述槲皮素混悬液和所述姜黄素混悬液的浓度均为5~20mg/ml,具体可为10mg/ml、5~10mg/ml、10~20mg/ml或7.5~15mg/ml。
上述的药物中,所述番茄红素混悬液为番茄红素溶解于玉米油制得;
所述槲皮素混悬液为槲皮素溶解于质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液、醋酸乙酯或冰醋酸制得,优选为槲皮素溶解于质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液;
所述姜黄素混悬液为姜黄素溶解于所述质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液、醋酸乙酯或冰醋酸制得,优选为姜黄素溶解于质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液;
所述质量百分含25%羟丙基-β-环糊精母液的制备如下:将羟丙基-β-环糊精溶解于水(具体为双蒸水或蒸馏水)中得到;具体可为将100g羟丙基-β-环糊精溶解于双蒸水,定容至400ml,制成质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液,4℃保存备用。
本发明还提供了上述的药物的混悬剂的制备方法,包括如下步骤:将所述番茄红素、所述槲皮素和所述姜黄素分别制成番茄红素混悬液、槲皮素混悬液和姜黄素混悬液,然后混合或不混合,即到所述药物的混悬剂。
本发明中,当所述药物为片剂时,按照本领域常规的制备方法制备得到。
本发明进一步提供了上述的药物组合物或上述药物在制备治疗动物和/或人前列腺炎产品或制备如下1)-4)中至少一种功能的产品中的应用:
1)降低动物和/或人前列腺组织的前列腺指数;
2)降低患有前列腺炎的动物和/或人前列腺组织的炎症细胞浸润;
3)降低患有前列腺炎的动物和/或人前列腺组织的炎症评分;
4)降低患有前列腺炎的动物和/或人前列腺组织的中炎症因子水平。
本发明中,所述前列腺指数为本领域公知的名词,定义为:前列腺指数=(大鼠前列腺重量/大鼠体重)×10000,前列腺指数是反映前列腺炎症的一个重要的大体指标,其值随炎症程度加重而增加。
本发明中,所述前列腺组织的炎症评分按照如下进行评分:常规HE染色用0~4分代表炎症程度:
0分:无炎症;
1分:轻度,但明确的血管周围单个核细胞套状聚集(浸润);
2分:中等程度的血管周围单个核细胞浸润;
3分:显著的血管周围单个核细胞浸润,出血,以及间质内较多的炎症细胞浸润;
4分:显著的血管周围单个核细胞浸润,出血,以及间质内大量的单个核细胞和肥大细胞浸润。
上述的应用中,所述产品包括药品和/或保健品;
所述前列腺炎为非细菌性前列腺炎,所述非细菌性前列腺炎具体可包括慢性前列腺炎或急性前列腺炎,优选为对慢性前列腺炎效果好。
上述的应用中,所述动物为大鼠;
所述炎症因子包括IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1和MIP-1α中的至少一种。
本发明进一步提供上述的药物组合物的使用方法,包括如下步骤:将所述的药物组合物或所述药物给药患有前列腺炎的动物或人;
所述的药物组合物或所述药物中所述番茄红素、所述槲皮素和所述姜黄素的给药剂量分别为10mg/kg/d、50mg/kg/d、50mg/kg/d。
本发明进一步提供一种治疗动物或人前列腺炎的方法,包括如下步骤:将所述药物组合物或所述药物给药患有前列腺炎的动物或人,实现治疗动物或人前列腺炎的目的。
上述方法中,所述药物组合物或所述药物中所述番茄红素、所述槲皮素和所述姜黄素的给药剂量分别为10mg/kg/d、50mg/kg/d、50mg/kg/d。
本发明具有以下优点:
本发明番茄红素、槲皮素和姜黄素联合应用,能够协同作用,从而提高治疗前列腺炎的作用效果;
本发明番茄红素、槲皮素和姜黄素联合应用,能够减少番茄红素的用量,从而减少因番茄红素价格导致的生产成本;
本发明番茄红素、槲皮素和姜黄素联合应用,为临床开发新型治疗慢性前列腺炎药物提供基础,为临床治疗慢性前列腺炎提供新的可行的方法。
附图说明
图1为本发明实施例2中大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型建立过程。
图2为本发明实施例2中各组前列腺指数;图2中,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001。
图3为本发明实施例2中各组HE染色结果。
图4为本发明实施例2中各组炎症评分结果;图4中,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001。
图5为本发明实施例2中各组炎症因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-1α水平的结果;图5中,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001。
图2-5中,三素组指的是番茄红素、槲皮素和姜黄素联合用药组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、番茄红素、槲皮素和姜黄素组成的药物组合物及其制备
药物组合物由如下质量份的组分制成:
番茄红素1份;
槲皮素1份;
姜黄素1份。
一种药物为上述的药物组合物作为活性成分制成,剂型为口服制剂,且为混悬剂。
上述的药物的混悬剂的制备方法,包括如下步骤:1)番茄红素混悬液为番茄红素溶解于玉米油制得,浓度为10mg/ml;
槲皮素混悬液为槲皮素溶解于质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液制得,浓度为10mg/ml;
姜黄素混悬液为姜黄素溶解于质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液制得,浓度为10mg/ml;
质量百分含25%羟丙基-β-环糊精母液的制备如下:将100g羟丙基-β-环糊精溶解于双蒸水,定容至400ml,制成质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液,4℃保存备用;
2)将所述番茄红素、所述槲皮素和所述姜黄素分别制成番茄红素混悬液、槲皮素混悬液和姜黄素混悬液不混合,即得到本发明药物。
实施例2、番茄红素、槲皮素和姜黄素联用对前列腺炎动物模型用药
一、大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型的构建(《大鼠非细菌性前列腺炎模型的复制》杨小荣等,实验与检验医学)
1)实验动物:6-8周龄雄性SD大鼠30只,体重260-280g,常规饲养1周后进行实验。
2)动物分组:随机分为正常组、模型组、番茄红素治疗组、槲皮素治疗组、姜黄素治疗组和联合用药组(即番茄红素、槲皮素和姜黄素联合用药组,为本发明实施例1中制备得到的药物),每组6只。
3)构建大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型:模型组和4个治疗组(即番茄红素治疗组、槲皮素治疗组、姜黄素治疗组和联合用药组)大鼠,以6%水合氯醛0.5ml/kg腹腔麻醉,碘伏消毒腹部皮肤,取下腹部正中纵行切口约1cm,打开腹腔,用棉签于膀胱下方找到前列腺并暴露良好,于前列腺腹叶注入完全弗氏佐剂(CFA)0.1ml,生理盐水冲洗防止粘连,以可吸收线逐层缝合切口,碘伏消毒皮肤。
以上为大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型构建过程(图1)。
二、给药处理
25%羟丙基-β-环糊精母液:将100g羟丙基-β-环糊精溶解于双蒸水,定容至400ml,制成质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液,4℃保存备用;
槲皮素混悬液或姜黄素混悬液的配置:准确秤量适量番茄红素,按10mg/ml比例溶解于玉米油,得到番茄红素混悬液;准确秤量适量槲皮素或姜黄素,按10mg/ml比例溶解于25%羟丙基-β-环糊精母液,得到槲皮素混悬液或姜黄素混悬液;
给药量:大鼠用药量番茄红素组为10mg/kg/d,即按1ml/kg剂量给药;槲皮素组、姜黄素组大鼠用药量为50mg/kg/d,即按5ml/kg剂量给药。
正常组:将雄性SD大鼠常规饲养;
模型组:将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予用药组等量溶剂(即25%羟丙基-β-环糊精母液)灌胃处理;
番茄红素治疗组:将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予番茄红素混悬液10mg/kg/d灌胃;
槲皮素治疗组:将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予槲皮素混悬液50mg/kg/d灌胃;
姜黄素治疗组:将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予姜黄素混悬液50mg/kg/d灌胃;
联合用药组:将大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型给予番茄红素混悬液、槲皮素混悬液和姜黄素混悬液分别为10mg/kg/d、50mg/kg/d、50mg/kg/d灌胃。
以上各组自建模第2天连续用药30日。
三、检测
将上述各组所有SD大鼠在处理30d称重后处死,取前列腺组织称湿重,计算前列腺指数;前列腺组织常规4%多聚甲醛固定、脱水、包埋,进行HE染色;组织炎性细胞因子水平的测定。
1、计算前列腺指数
前列腺指数=前列腺湿重(mg)/大鼠体重(10g),反映炎症程度的大体指标。
结果如图2,模型组前列腺指数较正常组明显升高,用药后前列腺指数呈不同程度下降,图2中三素组联用组(即联合用药组)优于单药(即番茄红素治疗组、槲皮素治疗组、姜黄素治疗组)效果。*:正常组与模型组相比有统计学差异(P<0.05);#:联合用药组与模型组相比有统计学差异(P<0.05)。
2、HE染色
各组前列腺组织常规4%多聚甲醛固定、脱水、包埋,分别进行HE染色:
1)石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。
2)苏木素染细胞核:切片入Harris苏木素染3-8min,自来水洗,1%的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,0.6%氨水返蓝,流水冲洗。
3)伊红染细胞质:切片入伊红染液中染色1-3min。
4)脱水封片:将切片依次放入95%酒精I 5min-95%酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。
5)显微镜镜检,图像采集分析。
染色结果:细胞核蓝色,细胞质红色。
结果如图3所示,A-F分别为正常组、模型组、槲皮素组、姜黄素组、番茄红素组和三素组(即联合用药组)模型组,由图3可以看出,正常组几乎没有炎症;模型组炎症表现最重;三药联用组炎症最轻,优于单独用药组(槲皮素组、姜黄素组、番茄红素组)。
将各组前列腺组织通过组织学评分进行评价,采用双盲的方法对每个腺体的几个切面进行评分,用总的评分除以切面数获得最终评分,具体如下:
用0-4分代表炎症程度(常规HE染色):
0分:无炎症;
1分:轻度,但明确的血管周围单个核细胞套状聚集(浸润);
2分:中度的血管周围单个核细胞浸润;
3分:显著的血管周围单个核细胞浸润,出血,以及少量间质内单个核细胞浸润;
4分:显著的血管周围单个核细胞浸润,出血,以及大量间质内单个核细胞浸润。
炎症评分结果如图4所示,由图4可以看出,与模型组或单独用药组相比,联合用药组降低患有前列腺炎的动物或人前列腺组织的炎症评分,正常组与模型组相比有统计学差异(P<0.05)(*)。
3、联合用药组与模型组组织炎性细胞因子水平的测定
用MILLIPLEX MAP多因子检测试剂盒测量前列腺组织中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1和MIP-1α的表达水平。该试剂盒可以一次加样品同时测定所有待测的细胞因子水平。
3.1.提取组织蛋白
将前列腺组织用预冷的0.01M PBS缓冲液洗涤2-3次,去除组织内的血以及表面杂质。洗干净的组织置于含有二硫苏糖醇(1.0mM)和蛋白酶抑制剂混合物(1μL)的100μlT-PER组织蛋白提取试剂(Thermo Scientific Pierce)的1.5ml微量离心管中,用剪刀剪碎。T-PER是为提取总蛋白而设计的组织细胞裂解液。使用组织匀浆器进行充分匀浆,于冰上静置30分钟。之后,将组织匀浆在4摄氏度下以12,000rpm离心30分钟,收集上清液,即为总蛋白溶液。整个蛋白提取过程在冰上进行。
3.2.使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。
3.2.1.准备标记好的样品置于冰盒内,准备好5mg/ml标准蛋白,准备好2.5μL、20μL和200μL微量移液器、移液用枪头、PBS缓冲液、96孔板。
3.2.2.配制BCA显色液:按招50:1的比例,计算好A液与B液各自的用量,配制显色液,充分混匀。现用现配。
3.2.3.于第1排标准曲线各孔加20μLPBS缓冲液,于待测样品(前列腺组织)孔依次加18μL PBS缓冲液。
3.2.4.于第1排第1孔加20μL 5mg/ml标准蛋白,用移液器轻轻吹打十数次,以充分混匀,注意吹打过程不要有气泡产生。然后从第1孔吸取20μL稀释液加入第2孔,吹打混匀,依次加到第7孔后,吸取20μL稀释液弃掉。建立浓度依次为2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、0.15625mg/ml、0.078125mg/ml、0.0390625mg/ml、0mg/ml浓度梯度。
3.2.5.于样品孔依次加入待测蛋白匀浆2μL,相当于稀释10倍。
3.2.6.每孔加入BCA显色液200μL。
3.2.7.将96孔板放置于37摄氏度恒温烤箱内,准确孵育30分钟。打开全波长酶标仪,设置好参数。
3.2.8.打开全波长酶标仪,调整各项参数,调整波长为562nm,测定OD值。
3.2.9.用Excel软件绘制标准曲线,套入公式,计算各待测蛋白(前列腺组织)的浓度。
3.3.Milliplex Map多因子检测操作流程
3.3.1.调整样品(前列腺组织)蛋白的浓度,确保每检测孔加入30μg的蛋白质,以使细胞因子测量值标准化。
3.3.2.测定时,在预包被板子每个孔中加入200μL分析缓冲液,密封,在室温(20~25摄氏度)振荡混匀10分钟。
3.3.3弃掉板子中的分析缓冲液,将板子扣过来,快速拍打到吸水纸上数次,以使孔内残余液体完全清除。
3.3.4.用微量移液器小心吸取25μL标准品或对照,分别加入适当的孔中,这些孔中不加分析缓冲液。
3.3.5.将25μL分析缓冲液用移液器小心地加入到每个样品孔,不要产生气泡。
3.3.6.在背景孔、标准孔和对照孔中用微量移液器小心地加入25μL适当的基质溶液。
3.3.7.然后向样品孔中分别加入25μL(1:2比例稀释)相应的样品(前列腺组织)。
3.3.8.将盛装磁珠的瓶子在旋涡混匀器上充分混合后,在每个孔中加入25μL混合后的磁珠,为了防止磁珠在加样过程中沉淀,注意在整个过程中时刻摇晃瓶子使磁珠混匀。
3.3.9.用密封膜封闭板子,外面包裹铝箔,在平板振荡器上室温孵育2小时。
3.3.10.小心地倒掉内容物,用200μL洗涤缓冲液洗板两次。
3.3.11.将25μL检测抗体(IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1和MIP-1α)加入到每个孔中,检测抗体需恢复到室温后使用。
3.3.12.封闭,用铝箔包裹,在室温下振荡孵育1小时。注意,此步不需要倾倒内容物。
3.3.13.每孔中加入Streptavidin-Phycoerythrin 25μL,封闭,用铝箔包裹,在室温下振荡孵育30分钟。
3.3.14.轻轻倒掉内容物,用200μL洗涤缓冲液洗板两次。
3.3.15.用移液器向所有孔中小心地准确加入125μL鞘液。然后将板子在平板振荡器振荡摇匀5分钟,以使磁珠充分悬浮。
3.3.16.在Luminex 200TM上读取中值荧光强度(MFI),并使用5参数逻辑曲线拟合法分析样品中待测因子的浓度。
如图5所示,可以看出,番茄红素治疗组、槲皮素治疗组、姜黄素治疗组、联合用药组相对于模型组组都具有统计学差异;并且本发明联合用药组相对于番茄红素治疗组、槲皮素治疗组、姜黄素治疗组具有统计学差异(其中*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001)。
Claims (10)
1.一种药物组合物,其特征在于:该药物组合物包括如下质量份的组分制成:
番茄红素1份;
槲皮素0.5~2份;
姜黄素0.5~2份。
2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于:所述药物组合物由如下质量份的组分制成:
番茄红素1份;
槲皮素1份;
姜黄素1份。
3.一种药物,其特征在于:该药物的活性成分为权利要求1或2所述的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物,其特征在于:所述药物的剂型为口服制剂。
5.根据权利要求3或4所述的药物,其特征在于:所述药物的剂型为混悬剂或片剂。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的药物,其特征在于:所述药物的混悬剂为番茄红素、槲皮素混和姜黄素的混合物制成的混悬液;和/或
所述药物的混悬剂为番茄红素混悬液、槲皮素混悬液和姜黄素混悬液组成。
7.根据权利要求5或6所述的药物,其特征在于:当所述药物为混悬剂时,所述番茄红素混悬液、所述槲皮素混悬液和所述姜黄素混悬液的浓度均为5~20mg/ml;和/或
所述番茄红素混悬液为番茄红素溶解于玉米油制得;
所述槲皮素混悬液为槲皮素溶解于质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液、醋酸乙酯或冰醋酸制得;
所述姜黄素混悬液为姜黄素溶解于所述质量百分含量25%羟丙基-β-环糊精母液、醋酸乙酯或冰醋酸制得;
所述质量百分含25%羟丙基-β-环糊精母液的制备如下:将羟丙基-β-环糊精溶解于水中得到。
8.权利要求3-7中任一项所述的药物的混悬剂的制备方法,包括如下步骤:将所述番茄红素、所述槲皮素和所述姜黄素分别制成番茄红素混悬液、槲皮素混悬液和姜黄素混悬液,然后混合或不混合,即得到所述药物的混悬剂。
9.权利要求1或2中所述药物组合物或3-7中任一项所述的药物在制备治疗动物和/或人前列腺炎产品或制备如下1)-4)中至少一种功能的产品中的应用:
1)降低动物和/或人前列腺组织的前列腺指数;
2)降低患有前列腺炎的动物和/或人前列腺组织的炎症细胞浸润;
3)降低患有前列腺炎的动物和/或人前列腺组织的炎症评分;
4)降低患有前列腺炎的动物和/或人前列腺组织的中炎症因子水平。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述产品包括药品和/或保健品;
所述前列腺炎为非细菌性前列腺炎,所述非细菌性前列腺炎具体包括慢性前列腺炎或急性前列腺炎;
所述动物为大鼠;
所述炎症因子包括IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1和MIP-1α中的至少一种。
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