CN111514209A

CN111514209A - 一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用

Info

Publication number: CN111514209A
Application number: CN201910804521.5A
Authority: CN
Inventors: 张�杰; 金春慧
Original assignee: Guiyang Xin Tian Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Guiyang Xin Tian Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明涉及一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，所述中药组合物的制备原料包括熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶和茯苓。该中药组合物可以显著控制卵巢切除后大鼠的体重增长，可以显著减少卵巢切除后大鼠心肌缺血再灌注损伤后的梗死面积；显著降低心肌缺血再灌注后的血清LDH和血清CK的水平，减少心肌损伤；其能显著抑制和降低心肌缺血再灌注后的GRP78蛋白、CHOP蛋白、Active‑caspase12蛋白和Active‑caspase3蛋白的表达，从而抑制心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡。

Description

一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，涉及一种中药组合物的新应用，具体涉及一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，尤其提供一种中药组合物在制备预防和/或治疗卵巢切除后心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

背景技术

心血管疾病的严重后果是缺血性心脏病的发生，随着冠状动脉介入及溶栓治疗的广泛开展，心肌缺血再灌注损伤已经成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题，预防及减轻心肌缺血再灌注损伤，可明显降低心血管疾病患者的死亡率。然而其发病机制复杂，关于心肌缺血再灌注损伤的准确机制尚未明确，已知的有多种信号途径参与，如内质网应激，钙离子浓度升高等。在心脏中，过强或过久的内质网应激会触发心肌细胞凋亡，最终导致心力衰竭；而钙离子浓度升高激活钙离子依赖性磷脂酶，促进氧自由基生产导致心肌损伤。

CN101375857A公开了红豆杉多糖在制备预防和控制心肌缺血再灌注损伤药物中的应用，药物为任何药学上认可的制剂，制剂中红豆杉多糖的重量百分含量为不低于60％；红豆杉多糖能提高心肌缺血再灌注后的LV-dp/dXmaX和SOD能力，改善心肌顺应性，显著降低心肌缺血再灌注后的血清LDH、血清cTnT和MDA水平，减少心肌损伤；其能显著抑制和降低心肌缺血再灌注后的FaSmRNA及其蛋白表达、MCP-1mRNA及其蛋白表达和NCF-47KmRNA及其蛋白表达，从而抑制心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡。

CN108324725A公开了蝉花虫草、蛹虫草、粉被虫草等虫草活性物质N6-(2-羟乙基)腺苷(HEA)在制备预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。HEA能有效地提高经缺氧再复氧处理后的心肌细胞活力，HEA具有诱导心肌细胞自噬，修复自噬流的作用。HEA能够通过激活A1受体，有效地提高大鼠心肌缺血再灌注后的心功能水平，减少心肌梗死面积，减少细胞凋亡、改善心肌组织形态，修复心肌自噬流，还能降低心肌缺血再灌注引起的炎性反应，从多方面证实了HEA具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用。

CN102423308B公开了两种溴酚类化合物及其可药用盐在制备心肌缺血再灌注损伤保护药物中的应用。这两种化合物及其可药用盐能在大鼠心脏急性缺血时对心肌细胞进行保护，从而使得大鼠心脏的功能完整。常规静脉给药后，能提高心肌缺血再灌注后SOD能力，改善心肌顺应性，显著降低心肌缺血再灌注后的血清LDH、血清CK、血清cTnT和MDA水平，减少心肌损伤，还能显著抑制和降低心肌缺血再灌注后的FasmRNA，从而抑制心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡。从而为临床治疗心肌缺血再灌注损伤提供新的方法和手段，为临床用药开辟新的方向。

但现有技术中关于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物的策略还很有限，因此，开发出一种新的预防或治疗心肌缺血再灌注损伤的策略是非常有意义的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种中药组合物的新应用，具体提供一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，尤其提供一种中药组合物在制备预防和/或治疗卵巢切除后心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，所述中药组合物的制备原料包括熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶和茯苓。

本发明创造性地发现可以将熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶和茯苓制备得到的中药组合物用于制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中，尤其是预防和/或治疗卵巢切除后心肌缺血再灌注损伤的药物中。通过利用所述中药组合物对卵巢切除后大鼠的干预实验发现，其可以显著控制卵巢切除后大鼠的体重增长，可以显著减少卵巢切除后大鼠心肌缺血再灌注损伤后的梗死面积；显著降低心肌缺血再灌注后的血清LDH和血清CK的水平，减少心肌损伤；其能显著抑制和降低心肌缺血再灌注后的GRP78蛋白、CHOP蛋白、Active-caspase12蛋白和Active-caspase3蛋白的表达，从而抑制心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡。

优选地，所述中药组合物的制备原料按重量份数计包括熟地黄25-35份、黄连10-20份、白芍10-20份、黄芩10-20份、阿胶1-10份和茯苓1-10份。

所述中药组合物的制备原料需经上述重量份数的合理搭配才能发挥更好的治疗心肌缺血再灌注损伤的效果。

所述熟地黄的重量份数可以为25份、26份、27份、28份、29份、30份、31份、32份、33份、34份或35份等。

所述黄连的重量份数可以为10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份等。

所述白芍的重量份数可以为10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份等。

所述黄芩的重量份数可以为10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份等。

所述阿胶的重量份数可以为1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份等。

所述茯苓的重量份数可以为1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份等。

优选地，所述中药组合物的制备原料按重量份数计包括熟地黄28-32份、黄连13-17份、白芍13-17份、黄芩13-17份、阿胶3-7份和茯苓3-7份。

优选地，所述中药组合物的制备原料按重量份数计包括熟地黄30份、黄连15份、白芍15份、黄芩15份、阿胶5份和茯苓5份。

所述中药组合物的制备原料在上述重量份数的搭配下其能发挥最好的治疗心肌缺血再灌注损伤的效果，当然，每种制备原料若在上述份数的基础上上下浮动2份，也是能取得类似的效果的。

在本发明中，所述中药组合物的制备方法包括以下步骤：

(1)将茯苓、阿胶混合粉碎成粉；黄芩加沸水煮煎，过滤得滤液；

(2)熟地黄、黄连和白芍混合后加沸水煮煎，过滤得滤液，将其与步骤(1)得到的滤液合并，浓缩至膏状，干燥，得干膏粉，将其与步骤(1)得到的粉混合，得到所述中药组合物。

优选地，步骤(1)所述加沸水煮煎的次数为1-3次，过滤得滤液后合并滤液。

优选地，步骤(2)所述加沸水煮煎的次数为1-3次，过滤得滤液后合并滤液。

优选地，所述干燥为冷冻干燥。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料包括赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如赋形剂和稀释剂的组合、载体和调味剂的组合、粘合剂和填充剂的组合、调味剂和粘合剂以及填充剂的组合等，其他任意的组合方式便不在此一一赘述。

优选地，所述载体包括脂质体、胶束、树状大分子、微球或微囊。

本发明所述中药组合物可以负载于常用药用载体上作为预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物，实现更好的生物相容性、靶向性、生物安全性和给药效果。

优选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、注射剂、喷雾剂、膜剂或滴剂。

用本发明所述中药组合物为活性成分的药物可以根据实际需要被制备成上述任一种药物剂型，各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

优选地，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或经皮给药。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

附图说明

图1是各组大鼠心脏TTC染色图(①为OVXsham组，②为OVXsham+I/R组，③为OVX组，④为OVX+I/R组，⑤为OVX+I/R+NS组，⑥为OVX+I/R+KTL组，⑦为OVX+I/R+KTM组，⑧为OVX+I/R+KTH组)；

图2是各组大鼠心脏HE染色图(①为OVXsham组，②为OVXsham+I/R组，③为OVX组，④为OVX+I/R组，⑤为OVX+I/R+NS组，⑥为OVX+I/R+KTL组，⑦为OVX+I/R+KTM组，⑧为OVX+I/R+KTH组)；

图3是各组的Western blot分析后心肌组织中GRP78、Active caspase12、Activecaspase3、CHOP和β-actin蛋白的表达情况(1为OVXsham组，2为OVXsham+I/R组，3为OVX组，4为OVX+I/R组，5为OVX+I/R+NS组，6为OVX+I/R+KTL组，7为OVX+I/R+KTM组，8为OVX+I/R+KTH组)；

图4是LDH水平统计图；

图5是CK-MB水平统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中的缩写具有本领域内的常规含义，具体含义如下：

MIRI：心肌缺血再灌注损伤

CVD：心血管疾病

OVX：卵巢切除

LDH：乳酸脱氢酶

CK：肌酸激酶

I/R：缺血-再灌注

下述实施例所涉及的动物均为SPF级健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，来自北京维通利华实验动物技术有限公司，9周龄，体重220±10g，转入动物房适应性喂养一周后进行实验。动物房环境参数：全年温度：22±2℃，相对湿度：40％-68％，24小时通风，12/12h光照/黑暗交替，可自由饮食饮水。

下述实施例所涉及的药物为本发明所述中药组合物，其制备原料按重量份数计含有熟地黄30份、黄连15份、白芍15份、黄芩15份、阿胶5份和茯苓5份。其制备方法为：

(1)将茯苓、阿胶混合粉碎成粉；黄芩加沸水煮煎2次，过滤得滤液，合并滤液；

(2)熟地黄、黄连和白芍混合后加沸水煮煎2次，过滤得滤液，合并滤液，将其与步骤(1)得到的滤液合并，浓缩至膏状，干燥，得干膏粉，将其与步骤(1)得到的粉混合，得到所述中药组合物。

下述实施例所涉及的主要试剂均为市场购买后直接使用，来源如下：

四甲基乙二胺(TEMED)，来自美国Sigma公司；

异氟烷来自上海雅培制药有限公司；

RIPA裂解液、蛋白质Marker，来自美国Thermo公司；

蛋白酶抑制剂来自北京索莱宝科技公司；

磷酸酶抑制剂、Tween-20，来自美国Amresco公司；

30％丙烯酰胺、Tris Base、十二烷基硫酸钠(SDS)来自中国碧云天公司；

5×蛋白上样缓冲液来自美国Invitrogen公司；

脱脂奶粉来自美国BD公司；

PVDF膜来自美国Pall公司；

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG来自中国Abmart公司；

辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG来自北京中山金桥公司；

ECL超敏发光液来自北京普利莱公司；

抗CHOP抗体来自美国Abcam公司；

内参β-actin抗体、抗GRP78抗体、抗caspase12抗体、抗caspase3抗体来自美国Proteintech Group公司；

苏木精、伊红来自美国Sakura公司；

Tunel试剂盒来自美国罗氏公司；

乳酸脱氢酶测定试剂盒、肌酸激酶测定试剂盒来自日本Wako公司；

TTC染色液来自北京索莱宝公司；

瑞氏-姬姆萨复合染液来自北京索莱宝公司。

实施例1

实验分组和MIRI大鼠模型的建立：

(1)实验分组

96只大鼠适应性喂养1周后随机分为8组，每组12只，分别为OVXsham组(卵巢切除假手术组)、OVXsham+I/R组(卵巢切除假手术+缺血再灌注组)、OVX组(卵巢切除术组)、OVX+I/R组(卵巢切除术+缺血再灌注组)、OVX+I/R+NS组(生理盐水组0.5mL/100g/d)、OVX+I/R+KTL组(低剂量治疗组0.4g/Kg/d)、OVX+I/R+KTM组(中剂量治疗组0.8g/Kg/d)、OVX+I/R+KTH组(高剂量治疗组1.6g/Kg/d)。

所述生理盐水组是指每天每100g大鼠施用0.5mL的生理盐水；所述低剂量治疗组是指每天每Kg大鼠施用0.4g药物；所述中剂量治疗组是指每天每Kg大鼠施用0.8g药物；所述高剂量治疗组是指每天每Kg大鼠施用1.6g药物。

(2)MIRI大鼠模型的建立

由于卵巢的机能减退或缺失会使体内的雌激素水平降低，内分泌功能紊乱，心血管疾病的发病率会明显升高，因此此处选用卵巢切除大鼠的心肌缺血再灌注损伤进行研究，具体操作步骤如下：

(Ⅰ)建立卵巢切除SD大鼠模型：(1)麻醉。选取96只符合本实验要求的SD雌性大鼠，采用异氟烷吸入麻醉，先将大鼠置于麻醉诱导箱中，调节麻醉机使异氟烷输出浓度为3％对大鼠进行诱导麻醉，待大鼠翻正反射消失后，取出大鼠改用面罩吸入维持麻醉，异氟烷吸入浓度为1.5％。(2)备皮消毒。行OVX时将大鼠俯卧式固定于手术台，剃毛机剃除大鼠背部毛发，医用酒精和碘酒消毒背部皮肤。(3)定位。以一侧背部最后一根肋骨下两横指与距同侧脊椎1横指交叉处为手术切口处。(4)卵巢切除。纵向切开此处背部皮肤约1.0cm，分离皮下肌肉及系膜，用小号止血钳撑开此处皮肤及肌肉，可见腹腔内白色脂肪团，用钝头镊轻轻夹带出该处脂肪组织，可见其下方有一绿豆大小红色菜花状卵巢。在卵巢下方用4-0缝合线结扎输卵管并切除卵巢，将余下组织原位送回腹腔。(5)关腹消毒。逐层缝合肌肉和皮肤并消毒。另一侧卵巢切除同上。假手术组与其的区别仅在于不切除卵巢，其他操作全部相同。

(Ⅱ)术后2周后给予本发明中药组合物干预4周，灌胃给药。

(Ⅲ)建立MIRI模型：(1)麻醉。选取乌拉坦(1g/kg，i.p)对大鼠进行麻醉。(2)机械通气。将大鼠置于手术台上仰卧位固定四肢及头部，从颈部正中位置切开大鼠表面皮肤，分离出气管进行插管机械通气，呼吸比为1:2，潮气量为3mL/100g。(3)右颈动脉置管。分离大鼠右颈动脉置管连接PowerLab生物信号采集处理系统并记录血流动力学指标。(4)监测心电。用Ⅱ导联电极接大鼠四肢，监测心电。(5)备皮消毒。取大鼠左胸部备皮、消毒、铺巾。(6)定位开胸。于2-4肋间位置纵向切开皮肤分离肌层，剪断大鼠3-4肋，用小动物开胸器小心撑开肋间开胸。(7)心肌缺血再灌注(I/R)。撕开大鼠心包膜，以暴露大鼠心脏，采用6-0带针缝合线，进针位置为左心耳下缘1mm左右，出针位置为肺动脉圆锥旁，结扎时置一直径约1mm、长约0.5cm实心硅胶棒于活结内，使硅胶棒正压于冠状动脉前降支(Left anteriordescending coronary artery，LAD)上阻断血管血流，造成大鼠心肌缺血。当Ⅱ导联心电图显示ST段抬髙>0.15mV时，缺血结扎操作成功，关胸；缺血30min后再次开胸取下硅胶棒，恢复左前降支血流，再灌注120min。

(Ⅳ)造模成功后收集大鼠的血清和心脏组织：(1)血清的采集：使用10mL注射器通过腹主动脉采血，采血量为5mL，静置15min后离心3500rpm/min×10min，取上清，-80℃保存。(2)心脏标本采集：待血清采集完后，用于HE、Tunel染色的大鼠心脏组织生理盐水清洗表面残留血液，医用纱布吸尽水分，置于4％多聚甲醛中固定；心脏组织用于TTC染色、Western blot实验的大鼠待血清采集完后，通过右颈动脉留置管注入10mL左右生理盐水灌流冲洗心脏，灌流结束，用于TTC染色的心脏组织于-20℃快速冷冻冰箱冻存，用于Westernblot实验的心脏组织于-80℃冰箱冻存。

实施例2

心脏TTC染色实验，具体方法如下：

TTC染色原理：TTC是脂溶性光敏感复合物，它的主要组成成分存在于呼吸链中，是吡啶-核苷结构酶系统的质子受体，在哺乳动物中，正常组织的脱氢酶可以和此复合物发生反呈现现红色，如果组织缺血，则因为其中脱氢酶活性低，将不能产生变化，肉眼观呈现白色。将实施例1中各组采集到的心脏标本放入-20℃冰箱中速冻20min左右，便于切片。手持超薄刀片，从心尖开始切片，切面垂直于心脏长轴，切至心底结束，心脏组织薄片厚度2mm左右。将组织置于2％TTC染色液中，锡箔纸包裹避光。放入37℃温箱中染色15min左右，每5min观察一次颜色变化，当颜色不再变化时结束染色。Image-Pro Pluse6.0分析软件对染色结果进行分析，根据灰度值计算心肌梗死面积比例。

结果如表1和图1所示。

表1

由表1数据可知：本发明中药组合物低中高剂量干预各组大鼠心肌缺血再灌注损伤后梗死面积百分数为：(27.78±2.82)％、(23.78±2.83)％、(22.50±3.59)％，较OVXsham+I/R组梗死面积(17.27±2.46)％明显增加(P<0.05)；而较OVX+I/R组(28.05±1.70)％明显减少(P<0.05)。说明本发明的中药组合物在高中低剂量下均可显著减少OVX大鼠心肌缺血再灌注损伤后的梗死面积。*表示该组与OVXsham+I/R组相比有统计学意义(P<0.05)；#表示该组与OVX+I/R组相比有统计学意义(P<0.05)。

图1为各组大鼠心脏TTC染色图，其中白色部分代表梗死区，红色部分代表非梗死区；①为OVXsham组，②为OVXsham+I/R组，③为OVX组，④为OVX+I/R组，⑤为OVX+I/R+NS组，⑥为OVX+I/R+KTL组，⑦为OVX+I/R+KTM组，⑧为OVX+I/R+KTH组。

实施例3

心脏HE染色实验，具体方法如下：

将实施例1中各组采集到的心脏组织置于4％多聚甲醛溶液固定24h，随后脱水过夜，制备石蜡包埋标本，切片待用。将切片放入脱蜡液中进行脱蜡，共3次，每次5min。切片水化，按浓度梯度依次经过无水乙醇、95％乙醇及75％乙醇溶液，每次2min，结束后蒸馏水漂洗一遍。苏木素染色5min，自来水漂洗3次，每次1min，镜下观察核蓝染的情况。1％稀盐酸酒精分化5s，自来水漂洗1min。1％稀氨水反蓝2s，自来水漂洗1min。伊红染色1min，自来水漂洗3次，每次1min。逐级酒精脱水，依次经过75％乙醇溶液、95％乙醇及无水乙醇。透明，切片置于二甲苯中2min，风干后，中性树脂胶封片。

结果如图2(心肌HE染色图(400×光镜))所示，①为OVXsham组，②为OVXsham+I/R组，③为OVX组，④为OVX+I/R组，⑤为OVX+I/R+NS组，⑥为OVX+I/R+KTL组，⑦为OVX+I/R+KTM组，⑧为OVX+I/R+KTH组。由图2可知，组①和组③损伤最小，无明显梗死区域；组②次之；组④和组⑤损伤较为严重，镜下均见梗死区域，细胞损伤、坏死较为严重；其余3组行药物干预者均出现了一定程度的心肌损伤，但与组④和组⑤两组相比损伤较小(N＝3)。

实施例4

TUNEL染色检测细胞凋亡实验，具体方法如下：

按罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书进行操作，以核棕黄色为阳性，使用Image-Pro Plus6.0分析软件对结果进行计算分析，每张切片随机选取10个视野(400×)，根据灰度值计算凋亡指数。凋亡指数(apoptotic index，AI)＝凋亡细胞数/总细胞数×100％。

表2为TUNEL法检测药物对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的影响结果(*代表该组与OVXsham相比有统计学意义(P<0.05)；。#、##代表该组与OVX+I/R组相比有统计学意义(#：P<0.05，##：P<0.01))。

表2

实施例5

Western blot分析实验，具体方法如下：

配制组织裂解液：98％RIPA，1％PMSF，1％PI。

称取实施例1中各组采集到的心脏组织30mg，放入1.5mL EP管中，加入组织裂解液360μL置冰上用组织研磨器进行匀浆。待研磨充分后于冰上静置20min，充分反应至完全裂解。低温4℃，高速12000r/min离心20min。取上清，Bradford法测定蛋白浓度。Bradford法测量蛋白浓度后，根据蛋白样品的体积，加入1/4蛋白体积的5×loading buffer，震荡混匀后，95℃水浴加热10min使蛋白充分变性，置于冰上冷却。

配制不连续SDS-PAGE，上层均为5％浓缩胶，下层根据目的蛋白分子量大小，配制10％-15％分离胶。每孔依次上样总蛋白样品40μg。待蛋白电泳及转膜结束，取出PVDF膜置于TBS溶液中洗5min，然后置于5％脱脂奶粉中，室温摇床孵育2h，封闭非特异性抗原。将封闭后的条带置于配好的一抗中，4℃摇床过夜。一抗浓度分别为：内参β-actin(1:2000)，抗CHOP(1:500)，抗Active caspase12(1:1000)，抗ATF6(1:500)，抗GRP 78(1:1000)，抗Active caspase3(1:1000)。取出孵育一抗后的PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10min。后加入相应种属的二抗(1:2000稀释)，二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次。ECL超敏发光液化学发光，在GE Image Quant成像系统中显影拍照；使用ImageJ对条带进行灰度值半定量分析。

结果如图3所示，显示Western blot分析各处理组心肌组织中GRP78、Activecaspase12、Active caspase3、CHOP、β-actin蛋白的表达情况(N＝3)。1为OVXsham组，2为OVXsham+I/R组，3为OVX组，4为OVX+I/R组，5为OVX+I/R+NS组，6为OVX+I/R+KTL组，7为OVX+I/R+KTM组，8为OVX+I/R+KTH组。由图3可知：OVX+I/R组大鼠心肌缺血再灌注后CHOP、Activecaspase12、Active caspase3蛋白表达较OVXsham组大鼠明显上调；而OVX+I/R+KTL、OVX+I/R+KTM、OVX+I/R+KTH较OVX+I/R组可显著降低GRP78、CHOP、Active caspase12、Activecaspase3蛋白表达水平。该实验表明本发明所涉及的中药组合物可通过抑制MIRI诱导的心肌内质网应激(ERS)减少心肌细胞凋亡。

实施例6

当心肌发生缺血梗死时，血清LDH、CK-MB水平均可显著升高，LDH、CK-MB能敏感地反应心肌损伤程度，是心肌损伤时重要的血清标志物。本实施例进行血清中LDH和CK水平分析实验，具体方法如下：

本实验血清LDH、CK-MB指标检测采用日本Wako公司乳酸脱氢酶测定试剂盒、肌酸激酶测定试剂盒，按照说明书加样后于日立全自动生化分析仪中检测。

结果如图4和图5所示(图4为LDH水平统计图，图5为CK-MB水平统计图)：OVX+I/R组大鼠行心肌缺血再灌注后血清LDH、CK水平显著升高，相较于OVXsham组具有显著性统计学差异(P<0.01)；OVXsham+I/R、OVX+I/R+KTL、OVX+I/R+KTM、OVX+I/R+KTH组较OVXsham组大鼠血清LDH、CK-MB水平均明显升高(P<0.05)，而较OVX+I/R组大鼠，给予本发明所述中药组合物干预后各组血清LDH、CK-MB水平均下降(P<0.05)，进一步证实本发明所述中药组合物可减少心肌缺血再灌注时心肌细胞的损伤，对心血管系统有保护作用(*表示该组与OVXsham相比有统计学意义，(*P<0.05；**P<0.01)；&表示该组与OVX+I/R组相比有统计学意义(&：P<0.05，&&：P<0.01)；N＝12)。

实施例7

对大鼠体重的监测实验，具体方法如下：

本实施例对各组大鼠的初始体重、卵巢切除1周后、卵巢切除2周后的体重以及药物干预1周后、药物干预2周后、药物干预3周后、药物干预4周后的体重进行监测和记录，结果如表3所示。

表3

由表3可知：大鼠OVX后体重较OVXsham组明显增加，OVX+I/R+KTL、OVX+I/R+KTM、OVX+I/R+KTH组大鼠体重控制效果较OVX后未行药物干预组明显更显著。OVX组大鼠在卵巢切除术后2周体重显著增加，给予本发明中药组合物干预后，与OVX+I/R组相比可以明显控制体重增长且有统计学意义(P<0.05)，超重或肥胖是心血管疾病风险的重要危险因素之一，超重或配胖患心血管疾病的风险更高(*表示该组与OVXsham相比有统计学意义(P<0.05)；#表示该组与OVX+I/R组相比有统计学意义(P<0.05))。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备原料包括熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶和茯苓。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备原料按重量份数计包括熟地黄25-35份、黄连10-20份、白芍10-20份、黄芩10-20份、阿胶1-10份和茯苓1-10份。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备原料按重量份数计包括熟地黄28-32份、黄连13-17份、白芍13-17份、黄芩13-17份、阿胶3-7份和茯苓3-7份；

4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的制备方法包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述加沸水煮煎的次数为1-3次，过滤得滤液后合并滤液；

优选地，步骤(2)所述加沸水煮煎的次数为1-3次，过滤得滤液后合并滤液；

优选地，所述干燥为冷冻干燥。

6.如权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述辅料包括赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述载体包括脂质体、胶束、树状大分子、微球或微囊。

9.如权利要求1-8中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、注射剂、喷雾剂、膜剂或滴剂。

10.如权利要求1-9中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或经皮给药。