WO2015070619A1

WO2015070619A1 - 鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用

Info

Publication number: WO2015070619A1
Application number: PCT/CN2014/080938
Authority: WO
Inventors: 曾春雨; 韩愈; 王震; 陈垦; 李郁
Original assignee: 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院
Priority date: 2013-11-16
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2015-05-21
Also published as: US20160296598A1; CN103585620B; CN103585620A; US9682121B2

Abstract

本发明公开了鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，实验结果表明，鸢尾素能够减小缺血再灌注引起的心肌梗死面积和降低缺血再灌注引起的乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白（cTnI）、肌酸激酶（CK）等心肌酶标志物的含量增加，同时降低心肌缺血再灌注引起的炎性反应，心肌细胞凋亡和氧化应激反应，并促进过氧化物酶体增殖物激活受体Y核移位和抑制核转录因子NF-κΒ核移位，从而减弱缺血再灌注引起的心肌结构损伤和负荷增加，因此能够用于预防和减弱心肌再灌注损伤，对治疗心肌缺血具有重要的临床意义。

Description

鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。背景技术缺血心肌病是全球致死率最主要的疾病之一，严重危害着人们的健康。缺血性心肌病是由于冠状动脉硬化或者血栓造成的血管堵塞，血流循环受阻或中断使得心肌氧和能量供应平衡被打破，心肌能量代谢紊乱，从而导致心肌梗塞、心衰等组织病理损害。目前克服缺血最有效的治疗方法是重新疏通血流、恢复血液供应，包括球囊扩张、动静脉溶栓、体外循环、冠脉搭桥等，即再灌注。但是，自从 I960年第一次提出了心肌缺血再灌注损伤之后，这一难题就一直困扰着医学工作者，大量动物实验和临床结果表明，再灌注虽然极大地改善了心肌供血的问题，但是由于大量富含氧和其他营养物质的血液进入缺血区，反而会导致缺血时产生的组织损伤进一歩加剧，引起心律失常、心脏破裂、心衰等并发症。临床研究显示，心肌缺血再灌注损伤在心血管外科手术中非常常见，其在冠脉搭桥早期死亡、心肌梗死、心脏移植失败等情况中占着很大的比例。因此，如何预防和减弱心肌再灌注损伤已成为重大的临床课题。

心肌缺血再灌注损伤的具体机制仍然不是很清楚。心肌缺血时导致能量代谢不足， ATP耗竭，再灌注过程中细胞内钙超载、产生大量氧自由基，直接或间接破坏膜磷脂、蛋白质、 DNA; 同时，中性粒细胞等炎症细胞的趋化、浸润以及炎症因子的产生和分泌在心肌再灌注损伤中也起着重要作用，这些炎症反应不仅直接损伤心肌组织，还会造成免疫性血管损伤。但是，通过清除自由氧（超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽等）、改善缺血组织代谢（如护心通、万爽力等）、添加免疫抑制剂等防治心肌再灌注损伤在临床中应用的效果并不佳。因此，亟需一种有效而副作用小的治疗方法或药剂来实现预防和治疗心肌缺血再灌注损伤。

过氧化物增殖激活受体协同激活子（PGC-l ci ) 是一种转录共激活因子，介导了很多能量代谢有关的生物过程，尤其是在多种细胞进行的调节线粒体生物合成和氧化代谢。 2012年， BostrSm发现运动促使骨骼肌表达 PGC-1 α 增强，而 PGC-1 α 又使纤维连结蛋白 III型域包含蛋白 5 (FNDC5 )水平上升， FNDC5是一种全长 196氨基酸的纤维连结蛋白 III型域包含蛋白的跨膜蛋白，是一种强有力的诱导棕色脂肪形成的诱导剂，其水解片段可分泌入血进入血液循环， FNDC5在心肌的含量很丰富，其对心脏的功能影响目前尚不清楚，并且临床研究发现在心衰患者中 FNDC5表达有所下降。 FNDC5切除 Ν端信号肽后在 GLU142处被裂解形成约 110个氨基酸的多肽，该多肽被命名为鸢尾素（Irisin)。鸢尾素是否对心肌缺血再灌注损伤有影响目前仍然未知。发明内容有鉴于此，本发明的目的之一在于提供鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

为实现上述发明目的，提供如下技术方案：

鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。其中鸢尾素的氨基酸序列如下 SEQ ID NO. 1所示，具体为：

Asp Ser Pro Ser Ala Pro Val Asn Val Thr Val Thr Val Arg His Leu Lys Ala Asn Ser Ala Val Val Ser Trp Asp Val Leu Glu Asp Glu Val Val l ie Gly Phe Ala l ie Ser Gin Gin Lys Lys Asp Val Arg Met Leu Arg Phe l ie Gin Glu Val Asn Thr Thr Arg Ser Cys Ala Leu Trp Asp Leu Glu Glu Asp Thr Glu Tyr l ie Val His Val Glu Ala l ie Ser lie Gin Gly Glu Ser Pro Ala Ser Glu Pro Val Leu Phe Lys Thr Pro Arg Glu Ala Glu Lys Met Ala Ser Lys Asn Lys Asp Glu Val Thr Met Lys Glu

进一歩，鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注引起心肌梗死的药物中的应用。

进一歩，鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注引起心肌酶标志物升高的药物中的应用。

更进一歩，所述心肌酶标志物为乳酸脱氢酶、肌钙蛋白或肌酸激酶。

进一歩，鸢尾素在制备预防肌缺血再灌注引起炎性反应的药物中的应用。进一歩，鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注引起氧化应激的药物中的应用。

进一歩，鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注引起心肌细胞凋亡的药物中的应用。

进一歩，鸢尾素在制备促进过氧化物酶体增殖物激活受体 Y 核移位的药物中的应用。

进一歩，鸢尾素在制备抑制核转录因子 NF- ic B核移位的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，通过构建 SD大鼠心肌缺血再灌注模型，探究鸢尾素对缺血再灌注引起的心脏功能障碍的作用影响，通过实验证明了外源性鸢尾素能够明显减弱缺血再灌注引起的心肌梗死面积扩大和心肌酶谱标志物（cTnI、 LDH和 CK) 的释放，抑制缺血再灌注引起的左心室射血分数的下降和收缩、舒张末期容积的上升，因此鸢尾素能够减弱缺血再灌注引起的心肌结构损伤和负荷增加；此夕卜，鸢尾素明显降低了缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡、炎症因子合成和释放、炎症细胞浸润以及氧化应激，进一歩证明了鸢尾素抵抗心肌缺血再灌注损伤的作用；本发明还通过体外 H9C2心肌细胞实验（包括缺 /复氧和 0₂处理），模拟体内心肌缺血再灌注，探讨鸢尾素对心肌细胞缺 /复氧损伤的作用和影响，体外实验与体内实验结果相似，即外源性的鸢尾素有效抑制缺 /复氧引起的心肌细胞活力下降，减少缺 /复氧引起的心肌细胞 LDH的释放，并且呈剂量依赖的关系；通过免疫荧光实验表明，当心肌细胞缺 /复氧时，进入心肌细胞胞浆的鸢尾素增多，加入过量外源性的鸢尾素后，心肌细胞的 DNA凝集现象明显减弱；鸢尾素对 0₂处理的心肌细胞的影响与前者相似；这些结果证明了鸢尾素确实具有抵抗心肌细胞缺 /复氧损伤的作用。

本发明还对鸢尾素抵抗缺血再灌注损伤的部分信号机制作了研究，结果表明在缺血再灌注的心肌细胞中，鸢尾素促进 PPAR Y从胞浆向胞核的转位而抑制 NF- ic B从胞浆向胞核的转位；从而证实了鸢尾素部分通过 PPAR Y发挥抵抗心肌细胞损伤的作用；同时本发明对鸢尾素在心肌细胞中是怎么影响 PPAR Y 的转位也做了研究，当加入过量 Nystatin后，鸢尾素抵抗心肌缺氧损伤的作用明显下降，鸢尾素可能部分通过脂筏进入细胞内调节 PPAR γ及 NF- ic B而发挥作用；而脂筏的主要构成成分为小窝蛋白 1，是一种重要的支架蛋白，因此鸢尾素可能会引起的小窝蛋白 1上调，鸢尾素可能部分通过小窝蛋白 1促进 PPAR Y 的核转位抑制 NF- ic B核转位，从而发挥保护作用。

本发明第一次发现鸢尾素可以用于预防和治疗心肌缺血再灌注损伤（心梗面积扩大，心肌标志物释放增加，心肌负荷增加，炎症反应、氧化应激和凋亡增加），抑制炎性反应可以通过以下的机制解释：通过促进 PPARs向核移位而抑制了 NF- κ B相关的炎性因子表达，减少了炎症细胞对组织的浸润，明显降低了再灌注后的炎性反应。本发明首次提出并证明了鸢尾素具有抵抗组织器官缺血再灌注损伤的作用，不仅仅拓宽了鸢尾素的研究和应用，同时也为预防和治疗缺血再灌注损伤提供了新的靶点和视野。由于鸢尾素是人体自身的分泌蛋白，其所带来的副作用相对较小，因此可应用于药品和保健品之中。附图说明本发明的进一歩特点在下面的图示中进行了更加全面的描述：图 1为 TTC染色法测量心肌缺血再灌注梗死面积的结果（*表示与对照组比较， #表示与 I/R组比较， P〈0.05， n=12) 。

图 2为心肌缺血再灌注心肌酶谱表达结果（A: cTnl表达结果； B: LDH表达结果； C: CK表达结果， *表示与对照组比较， #表示与 I/R 组比较， P〈0.05， n=12) 。

图 3为 irisin对心肌缺血再灌注的影响（A: irisin对心肌缺血再灌注的超声图片； B: 为左心室射血分数测量结果， C: 左心室舒张末容积； D: 左心室收缩末容积； *表示与对照组比较， #表示与 I/R 组比较， P〈0.05， n=12) 。

图 4为不同浓度鸢尾素对心肌缺血再灌注心肌酶谱表达结果（A: cTnl表达结果； B: LDH表达结果； C: CK表达结果， *表示与对照组比较， #表示与 I/R组比较， P〈0.05， n=12) 。

图 5为左心室射血分数测量结果。

图 6为缺血前（30min) 和缺血后使用鸢尾素对心肌缺血再灌注损伤的影响（A: cTnl表达结果； B: LDH表达结果； C: CK表达结果； *表示与对照组（control)比较， #表示与 I/R组比较， P〈0.05, n=13)。

图 7为 TUNEL染色法测量心肌凋亡的结果。

图 8为凋亡蛋白 Bcl-2、 Bax和 caspase-3的表达结果。

图 9为凋亡蛋白 caspase-3活性检测结果。图 10为缺血再灌注后的氧化应激指示检测结果（A: MP0检测结果； B: MDA检测结果； C: SOD检测结果）。

图 11为血浆炎性因子生成的测量结果（A: TNF- α 检测结果； B: IL-6检测结果) 。

图 12为心肌组织炎性因子含量的测量结果（A: TNF- α 检测结果； B: IL-6检测结果) 。

图 13为免疫荧光技术测定鸢尾素对 H9C2心肌细胞缺 /复氧的影响。

图 14为 Irisin对 H9C2心肌细胞 HR后细胞活力和 LDH测量结果 (A: 细胞活力； B: LDH测量结果）。

图 15为（A: 免疫荧光技术测定鸢尾素及鸢尾素与网格蛋白抑制剂介导胞吞途径 CPZ、脂筏介导胞吞途径抑制剂 Nystatin或巨胞吞抑制剂 DMA组合物对缺 /复氧 H9C2心肌细胞的影响； B:细胞活力； C: LDH测量结果）。

图 16为 Irisin对 0₂处理的 H9C2心肌细胞的影响（A: LDH测量结果； B: 细胞活力）。

图 17为免疫荧光技术结果图（A : 鸢尾素对 PPAR Y核移位的影响； B: 鸢尾素对 NF- κ Β核移位的影响）。

图 18为蛋白质印迹法测量 PPAR Y、 NF- IC B核移位的结果。具体实施方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版， J. 萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验所用的动物是由第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供的重 250-260g的 SD大鼠，实验过程中的手术操作符合大坪医院实验动物协会的规定。

以下实施例采用 SPSS 12.0统计分析软件对实验数据进行分析，所有数据以 "均值士标准差"表示，采用 AN0VA (单因素方差分析）组间两两对比分析差异， P〈0.05具有显著统计学意义。

一、鸢尾素有效改善心肌缺血再灌注引起的心功能障碍将 SD大鼠随机分为五组，分别为对照组（假手术处理）；缺血再灌注（IR) 组；缺血再灌注 +鸢尾素组（IR+ Irisin); 缺血再灌注 + 鸢尾素和抗体复合物（1:5) 组（IR+ Irisin/Ab); 缺血再灌注 +高温失活处理的鸢尾素组（IR+ Irisin (HI))。将缺血再灌注 +鸢尾素组；缺血再灌注 +鸢尾素和抗体复合物（1:5) 组；缺血再灌注 +高温失活处理的鸢尾素组手术前 30分钟分别注射 5 g/kg鸢尾素， 5 g/kg 鸢尾素和抗体复合物（质量浓度比为 1:5) 和 5 μ g/kg高温失活处理的鸢尾素，然后对所有实验 SD大鼠腹腔内注射 50mg/kg的戊巴比妥钠进行麻醉，并对 SD大鼠做左侧胸廓切开术，结扎冠状动脉的左前降支 30分钟，之后松开结扎处进行缺血再灌注，同时对缺血再灌注 + 鸢尾素组；缺血再灌注 +鸢尾素和抗体复合物（1:5)组；缺血再灌注 +高温失活处理的 SD大鼠分别注射 5 μ g/kg鸢尾素， 5 μ g/kg鸢尾素和抗体复合物（质量浓度比为 1:5) 和 5μ g/kg高温失活处理的鸢尾素。手术期间，大鼠一直被放置在保温板上保持体温 (37°C)。手术之后，切口被缝合，提供足够的能量和水以便大鼠恢复。恢复灌注 24 小时之后，收集血液和心肌组织测量心肌梗死面积和心肌酶谱表达，从而了解鸢尾素对心肌缺血再灌注引起的心功能障碍的作用及影响。

梗死面积测量：首先取实验 SD大鼠心脏，然后用生理盐水溶液冲洗掉冠状动脉的血液，之后将左前降支结扎并从颈静脉处注射 1% 的伊凡斯兰。再将心脏横切成 5片，将这些横切片在 37°C环境中用 1%TTC溶液染色 15分钟，通过 Image J测定梗死面积，结果如图 1 所示。由图 1可知，缺血再灌注 +鸢尾素组的梗死面积明显小于其它实验组，表明鸢尾素可能具有降低缺血再灌注损伤的效果。

心肌酶谱测量：收集实验 SD大鼠血液，在转速为 3000g条件下离心 10分钟，收集血清然后置于冰浴中以供使用。分别使用 Beckman Coulter AU 临床生化试剂盒和免疫检测试剂盒测定样品中乳酸脱氢酶（LDH)和肌钙蛋白（cTnI )、肌酸激酶（CK)含量，检测方法按试剂盒说明书进行，检测结果如图 2所示。由图 2可知，与对照组相比， IR组的 LDH、 cTnl和 CK的表达明显增高，而注射鸢尾素后极大地降低了 LDH、 cTnl和 CK的表达量。当使用的是鸢尾素与其抗体的复合物或者是高温失活处理的鸢尾素时，其对心肌的保护作用几乎消失。

心脏 B超的检测心功能：将实验 SD大鼠麻醉后固定于操作板上，使用 76( Hz的超声探头，测定左室长轴切面情况，然后根据超声检测结果计算左心室射血分数（LVEF)、左心室舒张末容积（LVEDV)、左心室收缩末容积（LVESV) , 每只大鼠分别测定 3 次，取其平均值并计算标准差，其结果如图 3所示。结果显示再灌注后左心室射血分数显著下降，而舒张末和收缩末的容积显著升高，但使用鸢尾素后这些变化有了明显的减小；使用鸢尾素与其抗体复合物（1 : 5 ) 或高温失活处理的鸢尾素时该作用几乎消失。由此可见，适当浓度的鸢尾素可以有效改善心肌缺血再灌注引起的心功能障碍，而且发挥作用的是鸢尾素的功能成分而不是结构成分。

按照与缺血再灌注 +鸢尾素组相同的方法进行操作，区别在于分别注射 0. 1 μ g/kg, 0. 5 μ g/kg, 1 μ g/kg和 5 μ g/kg鸢尾素，然后使用与上述相同的方法测定实验 SD大鼠 LDH、 cTnl和 CK含量，结果如图 4所示。由图 4可知，灌注鸢尾素后能够降低缺血再灌注 SD大鼠 LDH、 cTnl和 CK含量，并呈现剂量依赖关系，鸢尾素浓度越高，改善作用越明显， 5 μ g/kg鸢尾素作用最强。

将实验 SD大鼠制备心肌缺血模型，并于手术前 30分钟（pro) 或手术后（post ) 注射 5 μ g/kg鸢尾素，同时以假手术模型为对照，然后测定左心室射血分数和心肌酶谱。左心室射血分数测量结果如图 5所示，心肌酶谱结果如图 6所示。由图 5和图 6可知，缺血前（30min) 和缺血后使用鸢尾素都可以较明显地降低缺血再灌注引起的心肌梗死面积、乳酸脱氢酶、肌钙蛋白、肌酸激酶的上升，其中缺血前施药效果更加明显，证明了鸢尾素既可用于预防也可用于治疗再灌注损二、鸢尾素降低心肌缺血再灌注引起的炎性反应、氧化应激和凋 TUNEL染色法测定心肌调亡，具体为：利用原位细胞死亡探测盒 (购自罗氏生物科技有限公司）分别对对照组（假手术处理），缺血再灌注（IR) 组和缺血再灌注 +鸢尾素组（IR+ Irisin) 实验 SD大鼠的心脏切片，然后将组织切片置于 65°C环境中加热水化，之后用二甲苯清洗浸泡脱蜡，再依次用体积分数为 100%， 95%, 80%, 70%的酒精进行再水化，然后将切片置于含有 20 μ g/mL蛋白激酶 K的溶液中，在 37°C条件下处理 60分钟后将切片置于质量分数为 1%的三硝基甲苯 X-100 中处理 8分钟，然后将切片用 PBS溶液冲洗两次，最后加入 50 μ L的 TUNEL反应混合物，将切片在 37°C避光的水浴箱中孵育 60 分钟，核用 DAPI染色，其结果如图 7所示。由图 7可知，与对照组相比， IR组在 200 X的视野中测得的 TUNEL阳性细胞数显著升高，但是使用了鸢尾素之后下降非常明显，表明鸢尾素具有抑制细胞凋亡的作用。

利用蛋白质印迹检测凋亡蛋白 Bcl-2、 Bax和 caspase-3的表达量，具体为：分别收集对照组（假手术处理），缺血再灌注（I/R) 组和缺血再灌注 +鸢尾素组实验 SD大鼠的梗死的心肌组织，匀浆后分离上清，取 50mg的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转移到 PVDF膜上并在含有 5% (体积百分比）无脂牛奶的 TBS溶液中封闭 1小时，然后将 PVDF膜分别在稀释浓度为 1 : 500 的 Bcl-2抗体、 1 : 500的 Bax 抗体、 1 : 500的 caspase-3抗体或 1 : 1000的 β 肌动蛋白抗体中 4°C 过夜培养，然后用 TBS溶液将 PVDF膜冲洗三次，最后将膜置于稀释浓度为 1 : 10000的羊抗兔 IgG二抗中室温培养 1小时，染色观察，结果如图 8所示。由图 8可知，与对照组相比， IR组 caspase-3和 BAX 凋亡蛋白表达量明显上升， Bcl-2表达量下降，但是使用了鸢尾素之后 caspase-3和 BAX表达量明显下降，但 Bcl_2表达量反而升高，上述结果表明了鸢尾素具有明显的抑制凋亡的作用。

检测凋亡蛋白 caspase-3的活性，具体为：按照每 10mg组织加入 100 裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆，然后将匀浆液转移到 1. 5mL离心管中，冰浴裂解 5分钟，然后在 4°C、 16， OOOg条件下离心 10 分钟，离心后将上清转移到冰浴预冷的离心管中。取样品用 Bradford 法测定蛋白浓度，使每 10 待测样品中含有 10 蛋白，样本测定加入待测缓冲液、样本蛋白和 Ac-DEVD-pNA (2mM)加入 37°C孵育 60分钟；空白对照加入待测缓冲液和 Ac-DEVD-pNA (2mM)，发现颜色变化比较明显时即可测定 405nm条件下的吸光度。样品 A_4Q5扣除空白对照的 A_4Q5，即为样品中 caspase 3催化产生的 pNA产生的吸光度，计算结果如图 9 所示。由图 9可知，与对照组相比， IR组 caspase-3活性升高，但使用鸢尾素后 caspase-3明显降低，此结果同样表明了鸢尾素具有明显的抑制凋亡的作用。

ELISA实验检测缺血再灌注后的氧化应激指标（过氧化物酶 MP0、丙二酸 MDA和超氧化物歧化酶 SOD ) ，具体为：分别取对照组（假手术处理），缺血再灌注（I/R )组和缺血再灌注 +鸢尾素组 SD大鼠的心脏组织，在预冷的组织裂解缓冲液中用研磨器混匀，然后在 4°C、 1600g 条件下离心 10分钟，取上清液用于检测 MP0，MDA和 S0D含量（检测试剂盒由上海碧云天生物技术有限公司提供），检测结果如图 10所示。按照上述准备组织样品，用 R&D Systems公司的 ELISA试剂盒检测血浆和心肌组织中炎性因子含量，血浆中炎性因子检测结果如图 11所示，心肌组织中炎性因子检测结果如图 12所示。

由图 10〜12可知， MP0、 IL-6和 TNF- α 的测量结果中， IR组炎性因子水平明显比对照组要高得多，而使用鸢尾素后有效地降低了氧化应激指标和炎性因子的水平；反映了鸢尾素对抑制炎性和氧化应激反应的作用。 MDA测量结果和前面的相似，而 SOD测量结果中， IR组的水平明显下降，使用鸢尾素后则大幅度的升高。这些结果同样表明了鸢尾素可以明显抑制再灌注引起的炎性反应和氧化应激反应。

三、鸢尾素减少缺 /复氧和 0₂引起的心肌细胞损伤

H9C2心肌细胞系放置于 DMEM溶液中，其中含有体积分别为 10% 的高温灭活的 FBS， lOOU/mL青霉素 G， 100mg/mL链霉素和 2mM的 L- 谷氨酰胺。将培养细胞分为 3组：一组为对照组，不做任何处理，第二组为 HR组（通入 N₂)，第三组为 HR+irisin组（通入 N₂，并在通入 N₂处理前 30分钟加入不同浓度的鸢尾素于细胞培养液中）。将 H9C2 心肌细胞培养板置于缺 /复氧模型盒中，盒盖上有两个孔，一孔接通空气，另一孔通入过量 N₂使模型盒内排尽空气后，立即密闭两孔；将模型盒放到 37°C缺氧环境中进行缺复 16小时复氧 3小时从而形成缺氧复氧模型。然后用免疫荧光技术测定对照组和缺 /复氧组鸢尾素对 H9C2心肌细胞缺 /复氧的影响，结果如图 13所示。由图 13可知，缺 /复氧时心肌细胞的染色质凝集明显要强得多，且有更多的鸢尾素会向胞浆聚集，这一现象说明了鸢尾素在心肌细胞缺 /复氧时可能参与细胞修复，也解释了心肌缺血再灌注后血液中鸢尾素的含量会下降这一现象。

将上述 3组的实验 H9C2心肌细胞用 MTT法测定细胞活力，具体方法为：将细胞混合液去上清，用 PBS溶液清洗细胞 3次，在细胞培养板各孔加入 200 5%的噻唑兰溶液培养 4小时，培养结束后，小心移去孔内的培养液，再各加入 150 L的 DMS0溶液，轻微震荡 10 分钟，最后将该孔板用酶标仪在 490nm波长处进行检测光密度值，结果如图 14A所示。同时利用试剂盒测量 LDH含量，结果如图 14B所示。结果表明，当心肌细胞在正常的培养条件下，鸢尾素对细胞活力并没有明显的影响；而在缺 /复氧的情况下，可看到 0D值明显减小，但使用鸢尾素后能够某种程度恢复 0D值，并且该作用与鸢尾素呈剂量依赖关系，当鸢尾素的剂量超过 500ng/mL后，其能力最强， 0D值与细胞活力近似成正比，因此，说明鸢尾素可以增强心肌细胞活力，抵抗缺 /复氧引起的细胞活力减退。由于心肌缺 /复氧时，胞内的 LDH释放到保外，引起 LDH浓度增高；从 14B可以看出， HR组的 LDH浓度远远高于对照组，而使用了鸢尾素后 LDH浓度降低，呈现剂量依赖关系，使用 500ng/mL鸢尾素时效果最明显。

将 HR+irisin组再分为 4个亚组：一组为 HR+irisin，第二组为 HR+irisin+CPZ (网格蛋白抑制剂），第三组为 HR+irisin+Nystatin (脂筏抑制剂），第四组为 HR+irisin+DMA (巨胞吞抑制剂），并利用免疫荧光技术测定鸢尾素对 H9C2心肌细胞缺 /复氧的影响（图 15A)， LDH含量（图 15B) 和 490nm波长处的光密度值（图 15C)。由结果可见， HR组的 OD值与对照组相比明显减低了，使用鸢尾素之后 0D值水平明显上调，加入 CPZ和 DMA后对鸢尾素抑制 0D值下调的作用无明显影响，而加入 Nystatin之后几乎完全阻断了鸢尾素抑制 0D值下调的能力。在 LDH浓度水平测定结果中，同样 CPZ和 DMA对鸢尾素抑制缺 /复氧引起的 LDH浓度升高的能力无明显作用，而 Nystatin则很大程度地抑制了鸢尾素的作用。鸢尾素对 0₂处理的心肌细胞的影响与缺 /复氧结果相似。这两部分的结果说明鸢尾素抵抗缺 /复氧损伤的作用部分由脂筏介导的。

按照与上述相同的方法培养 H9C2心肌细胞，然后分为 3组，一组为对照组，不做任何处理，第二组为 0₂组（将 H9C2心肌细胞加入 ¾0₂至终浓度为 ΙΟΟ μ Μ, 然后于 37°C、 5% C0₂细胞培养箱中培养 24小时），第三组为 H₂0₂+irisin组 (向 H9C2心肌细胞中加入鸢尾素， 30分钟后加入 0₂至终浓度为 ΙΟΟ μ Μ, 然后于 37°C、 5% C0₂细胞培养箱中培养 24小时），将模型盒放到 37°C缺氧环境中进行缺复 16小时复氧 3小时从而形成缺氧复氧模型，然后利用试剂盒测定 LDH含量，并在 490nm波长处检测光密度值，结果如图 16所示。由图 16可知，鸢尾素对 0₂处理的心肌细胞的影响与缺 /复氧结果相似。从 0D值和 LDH浓度这两方面来看，鸢尾素具有明显的抵抗心肌细胞缺 /复氧损伤的能力。

四、鸢尾素促进缺 /复氧后 PPAR y 的核移位而抑制 NF- κ Β的核移位，发挥抑制 I/R心肌炎症、氧化应激作用

将上述对照组、 HR组和 HR+irisin组的 H9C2心肌细胞采用免疫荧光染色检测，具体为：吸除培养液，用 PBS洗涤 1次，加入固定液，固定 30分钟，移去固定液， PBS洗涤 3次，用 0.3%的甲醇处理后，免疫染色封闭液室温封闭一小时，移去封闭液，按 1: 50加入 PPAR- y 一抗， 4°C孵育过夜，之后 PBS洗涤 3次，再加入 TRITC标记二抗（羊抗兔）， 37°C孵育 40min; 再用 DAPI显色， PBS洗后常规脱水，甘油封片，激光共聚焦观察。吸除培养液，用 PBS洗涤 1次，加入固定液，固定 15分钟； PBS洗涤 3次，加入免疫染色封闭液，室温封闭一小时；移除封闭液，加入 NF-icB p65抗体， 4°C孵育过夜， PBS洗涤 3 次；加入抗兔 Cy3，室温孵育 1小时， PBS洗涤 2次；加入 DAPI, 室温染色 5分钟， PBS洗涤 3次；滴加适当量的抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片后荧光显微镜下观察，结果如图 17可知。由图可知，对照组中 PPAR-γ 主要位于细胞质中，胞浆 NF-κΒ的含量较高，而胞核 NF-κΒ的含量较少； HR组中 PPAR-γ 在胞浆和胞核均有表达，胞浆 I B的含量大幅度减少，胞核 NF- κ B的含量增高； HR+irisin组中 (与 HR组相比）， PPAR- y 主要分布在细胞核，胞浆小窝蛋白 1 和 NF-κΒ表达增加，胞核 NF-κΒ的含量降低。

同时用蛋白质印迹法测量对照组、 HR组和 HR+irisin组中细胞核和细胞质中 PPAR γ和 NF-κ B表达情况，结果如图 18所示。 PPAR-γ 正常情况下主要分布于细胞质，发生缺 /复氧时，由于小窝蛋白 1表达下降，使得 PPAR-γ 不能有效转位于细胞核抑制 NF-icB 活性； NF- κ B正常情况下在胞浆中与 NF- κ B结合成复合体，由于缺 /复氧使得 NF-κΒ含量下降，从而导致 NF- κΒ向核转位增加。表明鸢尾素上调小窝蛋白 1表达从而促进 PPAR- γ 向核转位， PPAR-γ在细胞核内与 NF-ic Β结合抑制其与炎性因子相关靶基因的转录活性；同时鸢尾素上调 ΙκΒ, 使得 NF-κΒ向核转位减少。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求书

1. 鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。

2. 根据权利要求 1所述的应用，其特征在于：鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注弓 I起心肌梗死的药物中的应用。

3. 根据权利要求 1所述的应用，其特征在于：鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注引起心肌酶标志物升高的药物中的应用。

4. 根据权利要求 3所述的应用，其特征在于：所述心肌酶标志物为乳酸脱氢酶、肌钙蛋白或肌酸激酶。

5. 根据权利要求 1所述的应用，其特征在于：鸢尾素在制备预防肌缺血再灌注引起炎性反应的药物中的应用。

6. 根据权利要求 1所述的应用，其特征在于：鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注引起氧化应激的药物中的应用。

7. 根据权利要求 1所述的应用，其特征在于：鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注引起心肌细胞凋亡的药物中的应用。

8. 根据权利要求 1所述的应用，其特征在于：鸢尾素在制备促进过氧化物酶体增殖物激活受体 Y核移位的药物中的应用。

9. 根据权利要求 1所述的应用，其特征在于：鸢尾素在制备抑制核转录因子 NF- ic B核移位的药物中的应用