CN110320084B

CN110320084B - 一种he染色切片的制作方法

Info

Publication number: CN110320084B
Application number: CN201910471080.1A
Authority: CN
Inventors: 王宽松; 粟诗童; 傅春燕; 谢斌; 周建华; 周训检; 禹灿平; 马苛文; 戚嘉琳; 胡祯敏
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110320084A

Abstract

本发明公开了一种HE染色切片的制作方法，包括以下步骤：将白片烤片、脱蜡、水化、HE染色和封片，所述水化与HE染色之间还包括以下步骤：将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理。本发明在制作HE染色切片时，水化与HE染色步骤之间增加金属离子络合剂溶液处理，金属离子络合剂能有效减少或消除组织裂缝，使其组织形态更加清晰，并可有效减少细胞固缩、重叠，大大增加了对组织、细胞判读的准确性、可靠性。

Description

一种HE染色切片的制作方法

技术领域

本发明属于病理组织切片制备技术领域，尤其涉及一种HE染色切片的制作方法。

背景技术

精准治疗的前提是精准诊断，其重中之重是精准病理诊断。优质的HE染色切片是临床病理诊断的基础，HE制片质量的好坏很大程度上会影响病理医师作出精准病理诊断。

通过临床病理质控发现，目前HE制片主要存在以下几个问题：(1)组织裂缝；(2)细胞重叠、挤压，染色不佳。此类缺陷降低了HE制片质量，严重影响了病理诊断。目前，上述现象在各级医院病理科广泛存在，尚无较好的解决方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是以上背景技术中提到的HE制片中的缺陷与不足，提供一种HE染色切片的制作方法，该制作方法可以消除HE染色切片中的组织裂缝，同时减少细胞重叠、挤压。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种HE染色切片的制作方法，包括以下步骤：将白片烤片、脱蜡、水化、HE染色和封片，所述水化与HE染色之间还包括以下步骤：将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液(优选的为螯合剂)处理。

上述制作方法中，所述切片为裱有组织薄片的防脱载玻片，病理术语称之为白片。利用金属离子络合剂溶液处理主要作用在于消除或减少组织裂缝。

上述制作方法中，优选的，所述金属离子络合剂溶液中金属离子络合剂包括EDTA、EDTA盐、柠檬酸或柠檬酸盐中的至少一种，所述金属离子络合剂的浓度为0.0001-0.1mol/L，所述金属离子络合剂溶液的pH值为8.0-9.0。更优选的，所述金属离子络合剂溶液中金属离子络合剂包括EDTA或EDTA盐，所述金属离子络合剂的浓度为0.0001-0.01mol/L。我们研究表明，金属离子络合剂采用EDTA或EDTA盐消除组织裂缝的效果更好。

上述制作方法中，更优选的，上述金属离子络合剂溶液中还加入0.001-0.01mol/L的表面活性剂，表面活性剂种类的确定以保证表面活性剂与金属离子络合剂相互配合作用，以发挥更好的效果。

上述制作方法中，更优选的，上述金属离子络合剂溶液中还加入0.001-0.01mol/L的Tris(三羟甲基氨基甲烷)。我们研究发现，Tris的加入可以与络合剂共同作用，络合剂的效果更好，同时还能有效减少细胞固缩、重叠。

上述制作方法中，更优选的，所述金属离子络合剂溶液为经过蒸馏水稀释的EDTA抗原修复液(主要成分为EDTA(或EDTA-2Na)和Tris)，稀释倍数以控制EDTA抗原修复液中EDTA(或EDTA-2Na)和Tris的浓度为0.001-0.01mol/L，所述金属离子络合剂溶液的pH值为8.0-9.0。

本发明中，EDTA抗原修复液可为采购的成品，也可为现配的溶液。EDTA抗原修复液目前在临床上主要运用于免疫组织化学染色前的抗原修复，其原理在于高温(300℃左右)高压下EDTA会破坏细胞间的“桥粒”链接，使细胞团分散为单个细胞，从而使细胞表面抗原充分暴露，从而易于免疫组化抗体与之结合。本发明中，我们意外的发现将EDTA抗原修复液用于HE染色切片制作过程中，通过对处理环境的适当控制，可以消除或减少组织裂缝。本发明中，我们用更优选的金属离子络合剂溶液处理经脱蜡、水化后的白片对组织损伤小，处理效果更好。

上述制作方法中，优选的，将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理时，控制处理温度不超过80℃，处理时间为2-10min。更优选的，所述处理温度为50-70℃(进一步优选为60℃)，处理时间为5-8min。研究表明，采用上述处理条件，可以得到组织裂缝更少的HE染色切片，效果更好，温度过高反而会导致相反的效果，温度过低、时间过短时，效果不明显。

上述制作方法中，优选的，将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理后，再将白片上所裱组织洗涤至中性。

上述制作方法中，优选的，所述脱蜡处理为将白片置于松节油中处理5-10min，再利用乙醇洗去白片上残留的松节油。

上述制作方法中，优选的，所述HE染色包括以下步骤：苏木精染液染色、流水冲洗、1％的盐酸乙醇漂洗、蒸馏水漂洗、0.5％的伊红水溶液染色、蒸馏水漂洗、乙醇漂洗、二甲苯透明。

上述制作方法中，优选的，所述封片为采用中性树胶封片。

上述制作方法中，具体步骤如下：

(1)使用全新切片刀切取组织薄片，避免在组织上产生刀痕，并用防脱载玻片裱片获得白片；

(2)在65℃烤箱内烤片1h，使组织薄片与载玻片充分贴合，防止掉片。

(3)将白片置于松节油中充分脱蜡5-10min，并依次经过100％、95％、70％的乙醇洗涤各5min，将松节油洗净；

(4)将白片放入蒸馏水中1-2min，水化组织，确保组织pH值为中性；

(5)将白片置于金属离子络合剂溶液(如浓度为0.01mol/L、0.001mol/L的EDTA-2Na，pH值为8.0-9.0)中，50-70℃下水浴加热2-8min；

(6)将处理后的白片在流水中冲洗1min，再放入蒸馏水中10s，使组织再次恢复中性；

(7)利用苏木精染液染色约10min，再流水冲洗1min；

(8)利用1％的盐酸乙醇漂洗3s，再用蒸馏水漂洗10s，使苏木素染色背景更加明亮；

(9)利用0.5％的伊红水溶液染色约1min，蒸馏水漂洗10s；

(10)依次经过80％、95％、100％的乙醇各5min，将玻片背景上残留伊红洗净；

(11)将切片置于二甲苯中浸泡1-2min，使组织透明；

(12)中性树胶封片。

本发明中将金属离子络合剂溶液用于HE染色中以减少或消除组织间裂隙，其原理在于：细胞表面蛋白中含有较多的2价阳离子，如Ca²⁺、Mg²⁺等，在特定的条件下，金属离子络合剂通过对细胞表面阳离子的稳定络合，增加细胞间粘附性，可以避免HE染色制片过程中组织之间出现裂缝。特别的，在工业上EDTA可用作色彩感光材料冲洗加工的漂白定影液，是一种优质助色剂，本发明中金属离子络合剂采用EDTA或EDTA盐，效果更好，HE染色更加均匀、明亮。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明在制作HE染色切片时，水化与HE染色步骤之间增加金属离子络合剂溶液处理，金属离子络合剂能有效减少或消除组织裂缝，使其组织形态更加清晰，并可有效减少细胞固缩、重叠，大大增加了对组织、细胞判读的准确性、可靠性。

2、本发明制作HE染色切片的方法适用于各种组织类型，尤其是对经过术中快速冰冻切片检查的乳腺穿刺组织，效果非常明显，可以有效消除非特殊类型浸润性癌中，癌与癌周间残留水分因冰冻后体积膨胀而产生的间隙，大大减少了石蜡HE染色切片中“人造”浸润性微乳头状癌的假象。

3、本发明方法操作简单、结果可靠，能更好地为各级医院临床病理科服务。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中HE染色切片的全景扫描图(HE，×10)。

图2为图1中C的放大图(HE，×100)。

图3为图1中D的放大图(HE，×100)。

图4为对比例1中HE染色切片的全景扫描图(HE，×10)。

图5为图4中A的放大图(HE，×100)。

图6为图4中B的放大图(HE，×100)。

图7为实施例2中HE染色切片的全景扫描图(HE，×40)。

图8为对比例2中HE染色切片的全景扫描图(HE，×40)。

图9为实施例3中HE染色切片的全景扫描图(HE，×200)。

图10为对比例3中HE染色切片的全景扫描图(HE，×200)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种HE染色切片的制作方法，包括如下步骤：

(1)使用全新切片刀切取组织薄片(肠镜下夹取的病变组织)，避免产生组织刀痕，并用防脱载玻片裱片获得白片；

(4)将白片放入蒸馏水中1-2min，水化组织，并使组织pH值恢复中性；

(5)将白片置于经蒸馏水稀释50倍EDTA抗原修复液中，60℃下水浴加热6min；上述EDTA抗原修复液为外购产品，型号为ZLI-9069，规格100mL，pH值为9.0，生产商为无锡傲锐东源生物科技有限公司；

(6)将处理后的白片置于流水中冲洗1min，再放入蒸馏水中1min，使组织再次恢复中性；

(7)利用苏木精染液染色约10min，再流水冲洗1min；

(9)利用0.5％的伊红水溶液染色约1min，蒸馏水漂洗10s；

(11)将切片置于二甲苯中浸泡1min，使组织透明；

(12)中性树胶封片。

上述步骤(5)中的EDTA抗原修复液也可采用0.001-0.01mol/L的EDTA溶液(pH值为8.0-9.0)代替，也可以达到相同的效果。但为了达到更好的效果，上述EDTA溶液中还需加入0.001-0.01mol/L的Tris。

对比例1：

本对比例1相比于实施例1不同之处在于没有经过步骤(5)-(6)，其余均与实施例1相同。

实施例1中得到的切片放大图如图1-3所示，对比例1中得到的切片放大图如图4-6所示。

图4-6中，A、B区域腺癌较为集中，腺体间可见多条大小不等的裂缝，癌细胞拥挤、重叠，这使得腺体组织学形态不完整、不连续，这将影响病理医师对细胞及腺体异型性的准确判读。

相比于图4-6，图1-3中，切片中组织无裂缝产生，腺体组织学形态得以完整展示。癌巢及间质内各种细胞形态清晰可辨，正常腺体与腺癌的形态、轮廓完整，病变连续性、肿瘤上皮移行性得以清晰展现。

实施例2：

本实施例中的HE染色切片的制作方法与实施例1相同。

本实施例中所得白片来自经术中快速冰冻切片检查后的乳腺穿刺组织(此组织经免疫组织化学证实为乳腺非特殊类型浸润性癌)。

对比例2：

本对比例2相比于实施例2不同之处在于没有经过步骤(5)-(6)，其余均与实施例2相同。

对于发现乳房肿块的患者，现临床上最可靠的诊断方法是超声引导下穿刺活检，我们在临床病理诊断工作中发现，部分乳腺穿刺组织经过术中快速冰冻切片检查后再制成石蜡HE染色切片，癌与癌周组织间会产生间隙，这在形态学上容易产生浸润性微乳头状癌的假象，但经免疫组织化学证实，其实质为非特殊类型浸润性癌。主要原因在于癌与癌周组织间有水分残留，在制作冰冻切片时，残留水分冻结成冰，体积膨胀，将癌与癌周组织撑开，形成间隙，通过临床实践发现，这类间隙不会因后续常规固定、脱水、包埋、制片等步骤而消失。对于上述问题，目前临床病理技术上尚无较好的解决方案。

实施例2中采用与实施例1相同的方法处理后得到的切片如图7所示，由图7可知，癌与癌周组织间隙消失，形态学特点为典型的乳腺非特殊类型浸润性癌，管腔形态及细胞异型性清楚明了，色彩明亮。本实施例中的方法不仅能修补组织内裂缝，也能有效消除乳腺非特殊类型浸润性癌因冰冻处理而产生的癌与癌周组织间隙。经本实施例中的方法处理后能有效减少“微乳头”的假象，一定程度上避免了免疫组化试剂不必要的浪费及过度检查。

对比例2中得到的切片如图8所示，由图8可知，癌周组织间隙(类似“微乳头”结构)清晰可见。

实施例3：

本实施例中的HE染色切片的制作方法与实施例1相同。

本实施例中所得白片来自乳腺组织(此组织经免疫组织化学证实为乳腺浸润性微乳头状癌)。

对比例3：

本对比例3相比于实施例3不同之处在于没有经过步骤(5)-(6)，其余均与实施例3相同。

乳腺浸润性微乳头状癌主要镜下特点在于：微乳头状肿瘤细胞团位于纤维间质组成的腔隙内，这与经冰冻处理后产生癌与癌周间隙的非特殊类型浸润性癌的特点非常相似。

实施例3与对比例3中得到的切片放大图分别如图9、10所示。

由图9可知，在乳腺浸润性微乳头状癌中，纤维间质组成的腔隙没有被消除，其组织学特征得以完整保留，微乳头状肿瘤细胞团内裂缝也被完整修补，且肿瘤细胞无皱缩、重叠，肿瘤细胞团形态学特点更加明显，微乳头状结构清晰可见且色彩明亮。由图10可知，癌巢内部可见明显裂缝，癌细胞皱缩、重叠，染色不佳。

Claims

1.一种HE染色切片的制作方法，包括以下步骤：将白片烤片、脱蜡、水化、HE染色和封片，其特征在于，所述水化与HE染色之间还包括以下步骤：将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理；

所述金属离子络合剂中络合剂的浓度为0.0001-0.1mol/L；将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理时，所述处理温度为50-70℃，处理时间为5-8min。

2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液中金属离子络合剂包括EDTA、EDTA盐、柠檬酸或柠檬酸盐中的至少一种，所述金属离子络合剂溶液的pH值为8.0-9.0。

3.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液中金属离子络合剂包括EDTA或EDTA盐。

4.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液为经过蒸馏水稀释的EDTA抗原修复液，所述金属离子络合剂溶液的pH值为8.0-9.0。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制作方法，其特征在于，将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理后，再将白片上所裱组织洗涤至中性。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的制作方法，其特征在于，所述脱蜡处理为将白片置于松节油中处理5-10min，再利用乙醇洗去白片上残留的松节油。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的制作方法，其特征在于，所述HE染色包括以下步骤：苏木精染液染色、流水冲洗、1％的盐酸乙醇漂洗、蒸馏水漂洗、0.5％的伊红水溶液染色、蒸馏水漂洗、乙醇漂洗、二甲苯透明。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的制作方法，其特征在于，所述封片为采用中性树胶封片。