CN103149358B - 肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫组织化学技术领域，涉及一种肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法。所述检测方法中一抗为多种混合型一抗。为了克服现有肺癌组织学不易分型，免疫组织化学技术分别检测耗时费力的不足，利用该方法使染色过程变得简便快捷，快速、方便的在同一张切片上可以得到更为丰富且对比性强的信息。本发明首次将混合型一抗和多种属检测放大系统应用于肺癌组织学分型的鉴别，不但保持了混合型抗体中各个抗体同单染时同样的敏感性和特异性外，还具有染色步骤少，实验时间短、稳定性高、实验结果直观对比，所带来的信息量远比传统单染高等优点，尤其对于标本量少的活检病理诊断具有显著优势。

Description

肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法
技术领域
本发明属于免疫组织化学技术领域，具体地，本发明涉及一种肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法。
背景技术
肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，也是最常见的引起死亡的一种癌症。其可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者常见的组织学类型是鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌，偶见一些发生率较低的其他类型或混合细胞型。肺小细胞癌与非小细胞癌的区分一直被认为是病理诊断中的最重要问题，区分二者具有重要的治疗意义，病理医生根据细胞形态和免疫组织化学方法，对于二者的鉴别诊断并不困难。而非小细胞肺癌中组织学类型的区分重视仍不足。随着分子生物学技术的发展和靶向药物的研发应用，越来越多的研究显示有些新出现的靶向治疗或联合治疗方案与组织学类型密切相关，如针对VEGF的新靶向药物贝伐单抗对肺鳞状细胞癌和腺癌的患者治疗效果上有很大的差异，这就要求病理医师必须尽可能地将非小细胞肺癌的具体类型做出明确诊断。
特别是在肺活检标本中因活检取材少、组织挤压、细胞坏死、组织固定不及时和细胞形态重叠而导致HE形态上难以区分，使得诊断更加困难。因此，借助免疫标志物来区分肺癌的组织学分型成为病理医师的首选。
传统的免疫组化检测通常一张切片只标记一种抗体，所带来的信息量较为有限，因此要求病理医生在显微镜下对不同的免疫组化切片逐一进行观察，才能做出最终的结果判定，一定程度上增加了病理医生的工作量，耗时费力。此外由于一些病变组织可能因为切面因素，影响染色结果的观察；同时活检标本量小，肿瘤细胞也可能因为切面而消失，给结果判定带来困难。因此，免疫组化多重染色检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有肺癌组织学不易分型，免疫组织化学技术分别检测耗时费力的不足，提供一种肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法。利用该检测方法，使染色过程变得简便快捷，快速、方便的在同一张切片上可以得到更为丰富且对比性强的信息。
本发明的一种肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法，所述检测方法的一抗为多种混合型抗体。
所述混合型一抗为Desmoglein3、p63、p40、TRIM29、CK5/6、TTF-1和Napsin A中的两种以上混合液。
采用的检测放大系统为多种属的HRP和AP酶标。
采用的显色剂为DAB、AP-Red、BCIP/NBT、AEC中的两种以上混合。
所述混合型一抗在同一切片同一时间同时反应，切片厚度为3-5μm。
所述检测方法采用与混合型一抗对应的HRP和AP酶标的混合二抗。
本发明的多重染色检测方法，包括以下步骤：
（1）组织切片放入67℃恒温箱中干烤2h。
（2）常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。
（3）在pH9.0的EDTA抗原修复液中直接煮沸修复，自然冷却至室温，自来水冲洗，PBS 冲洗3×3分钟。
（4）在3%过氧化氢中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗 3×3分钟。
（5）用正常动物血清封闭10分钟，甩去多余血清，不洗，滴加混合一抗，室温孵育1小时，PBS 冲洗3×3分钟。
（6）滴加混合二抗，室温孵育15分钟，PBS 冲洗3×3分钟。
（7）分步显色，显微镜镜下监测显色过程，适时终止反应。
（8）苏木素复染，水性封固剂封固，等水性封固剂完全干燥后，用中性树胶加盖玻片封固，利于显微拍照。
本发明的显著优点：肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法，首次将混合型一抗和多种属检测放大系统应用于肺癌组织学分型的鉴别，不但保持了混合型抗体中各个抗体同单染时同样的敏感性和特异性外，还具有染色步骤少，实验时间短、稳定性高、实验结果直观对比，所带来的信息量远比传统单染高等优点，尤其对于标本量少的活检病理诊断具有显著优势。
附图说明
图1为肺腺癌病例，免疫组化结果显示肿瘤细胞胞核和胞质分别呈TTF-1、NapsinA阳性表达（棕黄色），作为内对照肺支气管假复层纤毛柱状上皮下方基细胞胞质呈 Desmoglein3阳性表达（红色）（×200）；
图2为肺鳞癌病例，免疫组化结果显示肿瘤细胞胞质呈CK5/6阳性表达（红色），作为内对照残留的肺泡上皮细胞胞核和胞质分别呈TTF-1和NapsinA阳性表达（棕黄色）（×200）；
图3为肺小细胞癌病例，免疫组化结果显示肿瘤细胞胞核呈TTF-1阳性表达（红色）（×200）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例是为了进一步说明本发明，但不应视为限制本发明。
实施例1：
研究对象为甲醛固定-石蜡包埋的肺腺癌组织（福建省省立医院病理科）。免疫组织化学实验步骤如下：
（1）组织切片放入67℃恒温箱中干烤2h。
（2）常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。
（3）在pH9.0的EDTA抗原修复液中直接煮沸修复，自然冷却至室温，自来水冲洗，PBS 冲洗3×3分钟。
（4）在3%过氧化氢中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗 3×3分钟。
（5）用正常动物血清封闭10分钟，甩去多余血清，不洗，滴加Napsin A、TTF-1、Desmoglein3混合一抗，混合一抗中各抗体滴度分别为Napsin A 1:2000、TTF-1 1:200、Desmoglein3 1:400，室温孵育1小时，PBS 冲洗3×3分钟。 
（6）滴加与一抗对应的HRP、AP酶标的混合二抗，室温孵育15分钟，PBS 冲洗3×3分钟。
（7）滴加AP Red显色液，室温下孵育15-30min，显微镜镜下监测显色过程，适时终止反应；滴加DAB显色液，室温下孵育5-10min，显微镜镜下监测显色过程，适时终止反应。
（8）苏木素复染，水性封固剂封固，等水性封固剂完全干燥后，用中性树胶加盖玻片封固，利于显微拍照。
如图1所示，肿瘤细胞胞核、胞质分别呈TTF-1、NapsinA阳性表达（棕黄色），作为内对照肺支气管假复层纤毛柱状上皮下方基细胞胞质呈Desmoglein3阳性表达（红色）。
图1结果说明此检测方法能够使肺腺癌的肿瘤细胞胞核和胞质同时呈棕黄色，进而通过肿瘤细胞胞核和胞质的颜色鉴别此病例为肺腺癌，达到组织学分型的目的。采用此检测方法，肺腺癌肿瘤细胞呈胞核、胞质棕黄色，肺鳞癌肿瘤细胞呈胞质、胞膜红色，神经内分泌癌肿瘤细胞呈胞核棕黄色。
实施例2：
研究对象为甲醛固定-石蜡包埋的肺鳞癌组织（福建省省立医院病理科）。免疫组织化学实验步骤如下：
（1）组织切片放入67℃恒温箱中干烤2h。
（2）常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。
（3）在pH9.0的EDTA抗原修复液中直接煮沸修复，自然冷却至室温，自来水冲洗，PBS 冲洗3×3分钟。
（4）在3%过氧化氢中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗 3×3分钟。
（5）用正常动物血清封闭10分钟，甩去多余血清，不洗，滴加Napsin A、TTF-1、CK5/6混合一抗，混合一抗中各抗体滴度分别为Napsin A 1::2000、TTF-1 1:200、CK5/6 1：800，室温孵育1小时，PBS 冲洗3×3分钟。
（6）滴加与一抗对应的HRP、AP酶标的混合二抗，室温孵育15分钟，PBS 冲洗3×3分钟。
（7）滴加AP Red显色液，室温下孵育15-30min，显微镜镜下监测显色过程，适时终止反应；滴加DAB显色液，室温下孵育5-10min，显微镜镜下监测显色过程，适时终止反应。
（8）苏木素复染，水性封固剂封固，等水性封固剂完全干燥后，用中性树胶加盖玻片封固，利于显微拍照。
如图2所示，肿瘤细胞胞质呈CK5/6阳性表达（红色），作为内对照残留的肺泡上皮胞核、胞质分别呈TTF-1和NapsinA阳性表达（棕黄色）。
图2结果说明此检测方法能够使肺鳞癌的肿瘤细胞胞质呈红色，进而通过肿瘤细胞胞质的颜色鉴别此病例为肺鳞癌，达到组织学分型的目的。采用此检测方法，肺腺癌肿瘤细胞呈胞核、胞质棕黄色，肺鳞癌肿瘤细胞呈胞质红色，神经内分泌癌肿瘤细胞呈胞核棕黄色。
实施例3：
研究对象为甲醛固定-石蜡包埋的肺小细胞癌组织（福建省省立医院病理科）。免疫组织化学实验步骤如下：
（1）组织切片放入67℃恒温箱中干烤2h。
（2）常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。
（3）在pH9.0的EDTA抗原修复液中直接煮沸修复，自然冷却至室温，自来水冲洗，PBS 冲洗3×3分钟。
（4）在3%过氧化氢中室温孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗 3×3分钟。
（5）用正常动物血清封闭10分钟，甩去多余血清，不洗，滴加Napsin A、TTF-1、p40、TRIM29混合一抗，混合一抗中各抗体滴度分别为Napsin A 1:2000、TTF-1 1:200、p40 1:1500、TRIM29 1:500，室温孵育1小时，PBS 冲洗3×3分钟。
（6）滴加与一抗对应的HRP、AP酶标的混合二抗，室温孵育15分钟，PBS 冲洗3×3分钟。
（7）滴加 BCIP/NBT显色液，室温下孵育10-30min，显微镜镜下监测显色过程，适时终止反应；滴加AEC显色液，室温下孵育10-30min，显微镜镜下监测显色过程，适时终止反应。
（8）苏木素复染，水性封固剂封固，等水性封固剂完全干燥后，用中性树胶加盖玻片封固，利于显微拍照。
如图3所示，肿瘤细胞细胞核呈TTF-1阳性表达（红色）。
图3结果说明此检测方法能够使肺小细胞癌的肿瘤细胞胞核呈红色，进而通过肿瘤细胞胞核颜色鉴别此病例为肺小细胞癌，达到组织学分型的目的。采用此检测方法，肺腺癌肿瘤细胞呈胞核、胞质红色，肺鳞癌肿瘤细胞呈胞质、胞核蓝黑色，神经内分泌癌肿瘤细胞呈胞核红色。
经过上述三种实施方式的研究，通过视觉上颜色对比，免疫组化结果特异性、敏感性的比较，决定将实施例2中的方法作为最佳的肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法。
本专利中所述的各种试剂，除特别指出外，均可从商业途径上获得。

Claims (2)

1.一种多种混合型一抗在制备肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法的试剂中的应用，其特征在于：所述多种混合型一抗为Napsin A、TTF-1、CK5/6混合液；所述检测方法采用的显色剂为DAB、AP-Red混合；所述检测方法采用与混合型一抗对应的HRP 或AP酶标的混合二抗。
2.根据权利要求1所述的多种混合型一抗在制备肺癌组织学分型免疫组化多重染色检测方法的试剂中的应用，其特征在于：所述多种混合型一抗在同一切片同一时间同时反应，切片厚度为3-5μm。 
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