CN102944681A - 非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物样品检测领域，公开了非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用。SP70作为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物在制备非小细胞肺癌胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。SP70的单克隆抗体在制备非小细胞肺癌所致胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。一种非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂盒，包含荧光标记的SP70的单克隆抗体、5%BSA、1%PBS。本发明通过大量实验研究发现，SP70抗原可作为由非小细胞肺癌引起的恶性胸水的一个敏感、特异的检测指标，同时检测胸水中和胸水脱落细胞上的SP70抗原，可大大提高癌性胸水诊断的敏感性和特异性。

Description

非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用

技术领域

本发明属于生物样品检测领域，涉及非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用。

背景技术

胸水，又名胸腔积液，是临床上常见的病症之一，可因多个疾病引发。在我国，结核是第一位的病因，恶性肿瘤居病因的第二位。不同疾病引发的胸水，其应对措施和患者预后迥然不同。因此良恶性胸水的鉴别诊断具有至关重要的作用。

恶性胸水是晚期肿瘤病人常见而又令人苦恼的一种并发症，46%~64%的胸腔积液患者为恶性肿瘤所致，近来有增加的趋势。几乎所有的恶性肿瘤（除原发性脑肿瘤）均可引起胸腔积液，在临床上引起胸水的恶性肿瘤中肺癌是占第一位的（24%~42%），其次分别为原发灶不明的胸膜转移性腺癌（34%）、乳腺癌（23%~25%），恶性淋巴瘤（12%~24%）。肺癌病人在其病程中，约有半数患者发展成胸水。有数据显示约30%的肺癌患者最初的临床表现是胸水。恶性胸水患者总的预后不佳。

近年来国内外学者都在试图寻找更为有效的检测指标以提高恶性胸水的检出率，肿瘤标志物就是其中研究的热点。肿瘤标志物（tumour marker，TM）主要是指细胞在癌变的发生、发展、浸润及转移过程中所分泌的一些活性物质，这些物质在正常人体内缺乏或含量极低。它们在释放入血的同时，也大量存在于肿瘤组织周围和因肿瘤产生的胸水中，且其浓度可能远远高于血清[7]。故检测胸水中的肿瘤标志物越来越受到临床的重视。肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoma embryonic antigen，CEA）是一种糖蛋白，其分子量较大，存在于胚胎胃肠粘膜上皮与一些恶性病变组织的细胞表面，可见于肺癌、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤患者，其特异性不理想。当胸膜腔受到恶性肿瘤细胞侵犯时，由于快速的细胞转换，多糖蛋白质复合物，包括CEA脱落至胸腔，CEA由于分子量较大，一旦在闭合的胸腔产生，便不易进入血液循环，故不易形成被肾脏清除的抗原抗体复合物，因此，恶性胸水中CEA水平较血清出现早且更明显。细胞角质蛋白19片段（cytokeratin 19fragment，CYFRA 21-1）是利用鼠的单克隆抗体KS19和BM19-21在人体液中检测细胞角蛋白19的一个可溶性片段。主要分布于肺、食道、乳腺上皮，是非小细胞肺癌尤其是肺鳞癌的首选标志物。神经元特异性烯醇化酶（neuron specificenolase，NSE）主要存在于神经元及外周神经内分泌组织中，与小细胞肺癌（small cell lungcancer，SCLC）有关，是公认的小细胞肺癌高特异性、高灵敏性的肿瘤标志物[9]。国内外通过检测CEA、CYFRA 21-1和NSE来鉴别胸水性质的报道较多见，但其敏感性和特异性均不理想。因此，寻找诊断肺癌性胸水较为敏感和特异的指标，成为临床迫切需要解决的问题。

临床上以细胞学检查和组织活检作为鉴别良恶性胸水的标准，前者虽然特异性高，但不够敏感，其阳性检出率仅为40%-50%，胸腔镜检查虽可大大提高诊断的敏感性（达90%左右），但因损伤较大、费用高，又有一定的风险，临床应用受限。由于以上多方面原因，迄今为止，临床上仍未能有一个敏感性和特异性均较为理想的胸水肿瘤标志物。

众所周知，在胸水中找到肿瘤细胞是判断恶性胸水的金标准。然而，只有当肺癌病灶浸破脏层胸膜，癌细胞脱入胸腔内，才能形成胸腔脱落癌细胞。首先，从胸膜上脱落下来的反应性间皮细胞也有腺癌细胞的一些形态特征，加之某些异形性不明显的癌细胞与反应性间皮细胞几乎无法区别。其次，由于癌细胞在积液中无组织及器官构架的束缚而自由漂浮和增生甚至经几代繁殖，失去了原来在组织中的形态特征，故单纯依靠形态学进行诊断，敏感性较低以至造成诊断结果中存在着相当数量的假阴性。细胞形态学诊断的敏感性仅为50%左右，特异性为80%。因此，建立一种科学、有效的细胞学诊断方法是提高肺癌性胸水诊断阳性率的有效途径，也是提高肺癌患者生存率与治愈率的关键。

目前，利用抗肿瘤单克隆抗体研究和确定相关的抗原分子在肿瘤结构和功能活动中的有关特性，对于研究这些分子在恶性肿瘤细胞生物学行为中的作用有十分重要的意义，并在近年取得长足进展。同时利用抗肿瘤单克隆抗体检测各种体液中的肿瘤抗原用于恶性肿瘤的早期诊断也显示出诱人的前景，受到广泛关注。本实验室前期以人肺腺癌细胞株SPC-A1为抗原，免疫BALB/c小鼠，常规细胞融合，间接细胞ELISA法筛选阳性细胞克隆，得到一株高效价并稳定分泌IgG1抗人非小细胞肺癌单克隆抗体的细胞株NJ001；Western blot显示单抗NJ001特异性结合的抗原相对分子质量（Mr）为70000左右，因此该蛋白被命名为SP70；免疫荧光法等证实单抗NJ001能特异地识别肺癌细胞系，其识别抗原在非小细胞肺癌细胞的胞浆中和胞膜上均有表达，胞浆中表达量更丰富；免疫组化结果表明单抗NJ001与非小细胞肺癌组织有强阳性反应，而与小细胞肺癌、其他组织类型的肿瘤及正常肺组织呈弱阳性或阴性反应，因此证明了SP70在非小细胞肺癌诊断中的特异性。通过双抗体夹心ELISA方法，对临床血清样本中的SP70抗原进行检测，证明该抗原在非小细胞肺癌的诊断中有重要的临床价值。Fuhrman C（Fuhrman C,Duche JC,Chouaid C,Abd Alsamad I,Atassi K,Monnet I,Tillement JP,Housset B.Useof tumor markers for differential diagnosis of mesothelioma and secondary pleuralmalignancies.Clin Biochem,2000,33(5):405-410.）对肺癌患者血清和胸水样本中的（某些）肿瘤标志物（CEA，CYFRA 21-1，组织多肽抗原，透明质酸）同时进行检测和比较分析，结果显示胸水中的含量明显高于血清中的含量，因此，可以认为检测胸水中的肿瘤标志物是一种较好的鉴别良恶性胸水的方法。但是血清肿瘤标志物不一定能作为胸水肿瘤标志物，有文献报道（宋志军，吴广平．CA724和CA199在肺癌患者临床诊断意义．中国医药指南，2011，9（19）：18-19），CA72-4在肺癌患者血清中含量明显升高，然而，CA72-4在肺癌患者胸水中的诊断价值远远小于血清中的诊断价值。SP70作为一种组织特异性强的新肿瘤标志物，它在非小细胞肺癌患者所致胸水中是否表达尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供SP70作为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用。

本发明的另一目的是提供SP70的单克隆抗体的应用。

本发明的又一目的是提供一种非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂盒。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

SP70作为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物在制备非小细胞肺癌胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。

SP70的单克隆抗体在制备非小细胞肺癌所致胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。

其中，所述的SP70的单克隆抗体优选保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体NJ001-1。

所述的单克隆抗体NJ001-1在制备检测非小细胞肺癌所致胸水的双抗体夹心ELISA检测试剂中的应用。

一种非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂盒，包含荧光标记的SP70的单克隆抗体、5%BSA、1%PBS。

其中，所述的SP70的单克隆抗体优选保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体NJ001-1。

所述的荧光标记的SP70的单克隆抗体优选Mix–n-Stain^TMCF^TM488A抗体标记试剂盒标记的单克隆抗体NJ001-1。

一种检测非小细胞肺癌胸水脱落细胞的试剂盒，包含非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂，以及常规胸水脱落细胞HE染色检测试剂；其中所述的非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂包含荧光标记的SP70的单克隆抗体，优选包括Mix–n-Stain^TMCF^TM488A抗体标记试剂盒标记的单克隆抗体NJ001-1。

一种非小细胞肺癌诊断方法，利用本发明所述的检测非小细胞肺癌胸水脱落细胞的试剂盒分别通过直接免疫荧光法以及胸水脱落细胞HE染色检测待检胸水脱落细胞，若二者检测均为阳性，则说明待检胸水脱落细胞为非小细胞肺癌胸水脱落细胞。

本发明的有益效果：

本发明通过大量实验研究发现，SP70抗原可作为由非小细胞肺癌引起的恶性胸水的一个敏感、特异的检测指标，同时检测胸水中和胸水脱落细胞上的SP70抗原，可大大提高癌性胸水诊断的敏感性和特异性。

采用本发明双抗体夹心ELISA检测试剂对胸水中SP70进行检测，并用电化学发光技术对胸水中肺癌相关肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1和NSE进行同步检测和比较分析，SP70的阳性率显著高于CEA、CYFRA21-1和NSE的阳性率。SP70与CEA、CYFRA21-1和NSE相比较，具有更高的特异性。SP70在肺腺癌组中阳性率明显高于其他病理类型所致胸水。David等研究认为CEA在鉴别良恶性胸水上有较高的敏感性和特异性。但本研究数据显示，SP70作为一种新型的胸水肿瘤标志物其敏感性和特异性均明显优于CEA。SP70作为一个潜在的肺癌胸水肿瘤标志物，在癌性胸水中的阳性符合率（72.2％)显著高于传统的HE染色检测法的阳性符合率（47.2％)。本发明数据显示，在36例脱落细胞学诊断为阴性的患者中，其胸水SP70的ELISA检测结果均为阳性。造成这一现象的原因为操作者的取材局限性、制片技术以及病变是否典型等问题，从而出现延误诊断或漏诊的情况。与脱落细胞学检测相比，利用本发明试剂盒，对胸水SP70进行ELISA检测克服了上述缺点，可成为细胞病理学诊断的一种有价值的补充，使非小细胞肺癌所致恶性胸水的诊断敏感性大大提高。

本发明通过荧光染料试剂盒对单克隆抗体NJ001进行标记，并利用该荧光标记单抗建立了直接免疫荧光检测方法对肺癌性胸水脱落细胞上的SP70抗原进行检测，研究结果显示，直接荧光法的阳性符合率为45.2%（42/93），HE染色法的阳性符合率为48.4%（45/93），两者阳性符合率无统计学差异（χ2＝0.19，P>0.05）。因此，该法可成为传统HE染色脱落细胞检测技术的有力补充。国内外专家一直致力于寻找一些新的细胞诊断学方法，以弥补传统脱落细胞学检测中细胞形态不易辨别的缺点。本发明所建立的直接免疫荧光法作为一种新型的检测技术，和HE染色法相比较，在肺癌所致的胸水脱落细胞检测上，阳性率无显著差异。且克服了细胞形态不易辨别这一缺点，既使没有经验的病理医生也很容易掌握该检测技术。两种方法同时检测可使阳性率提高至54.8％，降低了漏诊率。同时，在辨别癌细胞和反应性间皮细胞方面也具有一定的优势。综上所述，利用本发明的试剂盒，将直接免疫荧光法检测肺癌胸水脱落细胞上的SP70抗原与传统的HE染色法相结合，可提高胸水脱落细胞学检查的敏感性，对诊断肺癌性胸水有重要的临床价值，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1胸水中SP70、CEA、CYFRA21-1和NSE的检测阳性率

图2不同病理类型胸水样本SP70检测结果

图3胸水中SP70的ELISA检测与胸水脱落细胞HE染色检测结果

图4肺癌患者胸水中SP70的ROC曲线分析

图5胸水脱落细胞SP70直接荧光检测和HE染色法检测结果

图6脱落细胞直接免疫荧光法检测结果（400×）

生物材料样品的保藏信息

杂交瘤细胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201172。

具体实施方式

实施例1

1.材料与试剂

1.1材料

收集南京医科大学第一附属医院2011年7月至2012年2月收治的经病史、临床表现、CT或病理学确诊的肺癌患者胸水108例和非癌性胸水122例，癌性胸水患者中，男78例，女30例；年龄32~84岁、中位年龄65.0岁。非癌性胸水患者中，男82例，女40例；年龄58~90岁、中位年龄70.0岁。胸水患者疾病构成见表1，其中81例为有分期资料的肺癌患者，早期组（Ⅰ/Ⅱ期）为9例（肺腺癌6例，肺鳞癌3例），晚期组（Ⅲ/Ⅳ期）为72例（肺腺癌60例，肺鳞癌9例，小细胞肺癌3例）。

表1胸水患者疾病构成(n＝230)

1.2样本处理

胸膜穿刺抽取的胸水样本装入10ml的刻度离心管中，3000r/min离心15min，取上清液等分为若干份保存于﹣70℃冰箱备用，以上操作均在2h内完成。

1.3主要试剂

试剂名称公司名称

(1)RPMI 1640  美国Gibco公司

(2)胎牛血清（FBS）  美国Gibco公司

(3)胰蛋白酶消化液  美国Gibco公司

(4)磷酸盐缓冲液（PBS）  北京欧蒙医学诊断技术有限公司

(5)牛血清白蛋白（BSA）  美国Sigma公司

(6)Western及IP  细胞裂解液上海碧云天生物技术有限公司

(7)可溶型单组分TMB  底物溶液上海科华生物工程股份有限公司

(8)终止液  上海科华生物工程股份有限公司

(9)HRP标记羊抗鼠IgG  北京中杉金桥生物技术有限公司

(10)洗涤液  上海科华生物工程股份有限公司

（11）人肺癌细胞系SPC-A1  中国科学院细胞库

1.4主要溶液配制

(1)pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液（1000ml）：取1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3，加ddH2O至1000ml，用10M NaOH调节pH至9.6，充分混匀后4℃保存。

(2)3%BSA（100ml）：3g BSA加100ml 1％PBS，充分混匀，4℃保存。

(3)ELISA洗涤缓冲液（1000ml）：40ml浓缩洗涤液加ddH2O至1000ml，充分混匀后室温保存。

(4)1％PBS：欧蒙产品，10.2g每包，溶于1L蒸馏水，pH 7.2，室温保存。

2方法

2.1临床样本胸水SP70的检测

2.1.1阳性对照（SPC-A1裂解液）的制备

人肺癌细胞株SPC-A1细胞生长于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。收集并计数SPC-A1细胞，以1×106个/ml的浓度加入6孔板中，每孔1ml，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4℃预冷1%PBS洗两遍，每孔加入Western及IP细胞裂解液150μl，冰浴20min后，刮取收获细胞，收集细胞裂解液，4℃，13000×g离心10min，留取上清，分装后，置-70℃保存。

2.1.2抗SPC-A1多克隆抗体的制备及包被

首次免疫用1×10⁸个SPC-A1细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3×10⁸个细胞。每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法(以SPC-A1细胞铺板，浓度为1×10⁵个/孔，将免疫前血清和该次采集的血清从1:5000开始分别进行倍比稀释后加样，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG作为二抗，以OD₄₅₀大于2.1倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为血清的效价)检测血清抗体效价。待抗体滴度达大于或等于1:300000后进行腹主动脉放血，将兔血37℃放置1h，再转入4℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4℃，3000r/min离心30min，收集上清，利用ProteinA亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1:160000，浓度为14.77μg/mL。

用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后的抗SPC-A1多克隆抗体稀释至0.63μg/ml，100μl每孔包被96孔酶标板，置4℃过夜；加ELISA洗涤缓冲液200μl/孔，置于水平振荡器上振荡2min，弃尽洗涤液，拍干，重复洗板3次；每孔加入3%BSA 300μl，4℃封闭过夜，洗板3次，晾干后贴膜，置-20℃保存。

2.1.3胸水样本cut-off值的确定

通过本实验室前期建立的双抗体夹心ELISA对80例肺部良性疾病患者的胸水样本进行检测（彭蘡，潘世扬，王芳，等．非小细胞肺癌患者血清中SP70的检测及其临床意义．中华检验医学杂志，2012，35：554-558．），以胎牛血清作为阴性对照，P/N值的均值加三个标准差

作为判断阴性和阳性的界值（cut-off值）。

2.1.4胸水中SP70抗原的检测

取出待测胸水样本，已包被抗SPC-A1多克隆抗体的ELISA板及相关试剂平衡至室温。每孔加入50μl待检胸水，37℃孵育2h，弃去反应孔中液体，加ELISA洗涤缓冲液200μl/孔，置于水平振荡器上振荡2min，弃尽洗涤液，拍干，重复洗板5次；用1%PBS按1：4000稀释单抗NJ001，100μl每孔加入酶标板中，37℃孵育1h，洗板5次（洗板方法同上）。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗（1：3000稀释），每孔100μl，37℃孵育30min，洗板5次（洗板方法同上）。加入新鲜配制的TMB底物显色液（试剂A和试剂B按1：1的体积比混合），每孔100μl（空白孔除外），室温避光显色10min，以2M H2S04终止反应，用酶标仪读取OD450值。阳性、阴性和空白对照分别为SPC-A1细胞裂解液，胎牛血清和1％PBS，均设三复孔；每份样本，在每次检测时设两或三复孔，至少重复检测两次，具体次数视胸水量而定。当P/N值＜2.50时判断为SP70阴性，P/N值≥2.50时判断为阳性。

2.2电化学发光法（Electrochemiluminescence Assay，ECLIA）检测肺癌常用肿瘤标志物

通过罗氏E170电化学发光自动免疫分析仪及其配套试剂，对胸水样本进行肺癌常用肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1和NSE的同步检测，并与ELISA法检测胸水SP70的结果进行统计分析。根据文献[30]各项肿瘤标志物在胸水中的正常参考值分别为：CEA＜4.3ng/ml、CYFRA21-1＜23.1ng/ml和NSE＜16.3ng/ml，超过正常值即判断为阳性。

2.3胸水脱落细胞HE染色检测

把待测涂片置苏木精染液中浸染5min，蒸馏水冲去苏木精染液，置1％盐酸乙醇中3秒，蒸馏水冲去多余盐酸乙醇，置95％乙醇中3秒，置0.5％伊红染液中浸染3秒、依次浸入95%乙醇（Ⅰ）、95％乙醇（Ⅱ）、95％乙醇（Ⅲ）中各3秒，最后置95％乙醇中固定5分钟，中性树胶封片后，置光学显微镜下观察结果。

2.4统计学分析

计算各项指标的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值，敏感性=癌性胸水患者中阳性例数/癌性胸水患者总数；特异性=非癌性胸水患者中阴性例数/非癌性胸水患者总数；准确性=（癌性胸水患者中阳性例数+非癌性胸水患者中阴性例数）/患者总数；阳性预测值=癌性胸水患者中的阳性例数/所有患者中阳性例数；阴性预测值=非癌性胸水患者中阴性例数/所有患者中阴性例数。统计分析应用SPSS16.0，各组间阳性率比较采用χ2检验或Fisher’s确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。以108例癌性胸水和122例非癌性胸水的P/N值作受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），计算曲线下面积。曲线下面积（AUC）在>0.5的情况下，越接近于1.0，诊断效果越好。

3结果

3.1双抗体夹心ELISA法检测临床样本胸水SP70的结果

3.1.1胸水样本cut-off值的确定

通过已建立的双抗体夹心ELISA方法对80例肺部良性疾病患者的胸水样本进行检测，P/N的均值为1.6，标准差为0.3，计算得出判断阴性和阳性的界值为2.5

3.1.2胸水中SP70和3种肿瘤标志物阳性率比较

通过已建立的双抗体夹心ELISA法，对108例癌性胸水和122例非癌性胸水中的SP70蛋白进行检测和分析。检测结果显示（表2，图1），癌性胸水组均明显高于非癌性胸水组，在癌性胸水组中，SP70的阳性率（72.2％)高于CEA、CYFRA21-1和NSE的阳性率（58.3％、52.8％、30.6％)。SP70与CEA、CYFRA21-1和NSE的阳性率之间均具有统计学差异（72.2%vs 58.3％，χ²=4.60，P＜0.05；72.2%vs52.8％，χ²=8.71，P＜0.05和72.2%vs 30.6％，χ²=37.53，P＜0.001）。

表2胸水中SP70和三种肿瘤标志物阳性率比较%

注：△，与SP70阳性率比较P<0.05。

3.1.3SP70和3种肿瘤标志物对癌性胸水诊断的评价

SP70、CEA、CYFRA21-1和NSE的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值，结果见表3。SP70的准确性显著高于CEA、CYFRA21-1和NSE的准确性（81.7%vs 73.5％，χ²=4.52，P＜0.05；81.7%vs 65.7％，χ²=15.35，P＜0.05；81.7%vs 57.0％，χ²=33.23，P＜0.001），SP70的阳性预测值明显高于CEA、CYFRA21-1和NSE的阳性预测值（86.7%vs79.7％，χ²=1.46，P＞0.05；86.7%vs67.1％，χ²=9.53，P＜0.05；86.7%vs 57.9％，χ²=15.62，P＜0.001）。

表3SP70和3种肿瘤标志物对恶性胸水诊断的评价（％)

注：△，与SP70准确性比较P＜0.05；○，与SP70阳性预测值比较P＜0.05。

3.1.4癌性胸水中不同病理类型样本检测结果

肺腺癌、肺鳞癌、病理分型未明确的肺癌和小细胞肺癌所致胸水SP70检测阳性率分别为77.5%（69/89），50.0%（6/12），75.0%（3/4）和0%（0/3），非小细胞肺癌组的总阳性率显著高于小细胞肺癌组的阳性率（74.3％vs 0.0％，P=0.02＜0.05），结果见表4，图2。

表4癌性胸水组中SP70检测的阳性率

注：＊，与非小细胞肺癌组比较P＝0.02＜0.05

3.2癌性胸水患者中，胸水SP70抗原的ELISA检测结果与脱落细胞学HE染色检测结果的比较

SP70的阳性符合率高达72.2%（78/108），HE染色法的阳性符合率仅为47.2%（51/108），SP70的阳性符合率显著高于HE染色法的阳性符合率（χ²=14.03，P＜0.001），结果见表5，图3。

表5胸水中SP70的ELISA检测与胸水脱落细胞HE染色检测比较（例）

注：采用配对χ2检验，P<0.001

3.3ROC曲线评价胸水SP70的诊断价值

以108例癌性胸水和122例非癌性胸水的检测结果P/N值作ROC曲线（图4），对应曲线下面积AUC=0.878（标准误0.022；95％可信区间0.834~0.922），可见通过双抗体夹心ELISA检测SP70抗原用于非小细胞肺癌的诊断具有很好诊断效果。

实施例2

1细胞株和临床样本

1.1细胞株来源

人肺腺癌细胞株SPC-A1和人胚肺细胞株HFL-1购自中国科学院细胞库。

1.2临床样本的收集和处理

1.2.1样本的收集

收集南京医科大学第一附属医院2011年7月至2012年2月收治的经病史、临床表现、CT或病理学确诊的肺癌患者胸水脱落细胞涂片93例和肺部良性疾病患者胸水脱落细胞涂片122例，癌性胸水患者中，男66例，女27例；年龄43~84岁、中位年龄65.0岁。非癌性胸水患者中，男82例，女40例；年龄58~90岁、中位年龄70.0岁。

1.2.2样本的处理

胸膜穿刺抽取的胸水样本装入10ml的刻度离心管中，3000r/min离心15min，弃上清液，取沉渣1~2滴涂片，待涂片自然干燥后，95%乙醇固定15min，置﹣20℃冰箱保存，以上操作均在2h内完成。

1.3主要试剂

试剂名称公司名称

(1)RPMI 1640  美国Gibco公司

(2)胎牛血清（FBS）  美国Gibco公司

(3)磷酸盐缓冲液（PBS）  北京欧蒙医学诊断技术有限公司

(4)Mix–n-Stain^TMCF^TM488A抗体标记试剂盒  美国Biotium公司

(5)无水乙醇  国药集团化学试剂有限公司

(6)牛血清白蛋白（BSA）  美国Sigma公司

(7)缓冲甘油  北京欧蒙医学诊断技术有限公司

(8)苏木素伊红(HE)染色试剂盒  北京(中西泰安)技术服务有限公司

1.4主要溶液配制

(1)1％PBS：欧蒙产品，10.2g每包，溶于1L蒸馏水，pH 7.2，室温保存。

(2)95％乙醇（100ml）：95ml无水乙醇中加入5ml纯水，混匀后室温保存。

(3)5%BSA（100ml）：5g BSA加100ml 1％PBS，充分混匀，4℃保存。

2方法

2.1细胞培养

人肺癌细胞株SPC-A1细胞生长于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。把SPC-A1细胞悬液加入6孔细胞培养板中，每培养孔中已放置无菌盖玻片，24h后观察细胞在盖玻片上贴壁情况，若细胞贴壁情况良好，取出盖玻片，1％PBS洗3次，1min/次，加入95％乙醇固定15min，弃尽95％乙醇，1％PBS洗3次，1min/次，晾干后置-20℃保存。

人胚肺细胞株HFL-1细胞生长于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。把HFL-1细胞悬液加入6孔细胞培养板中，每培养孔中已放置无菌盖玻片，24h后观察细胞在盖玻片上贴壁情况，若细胞贴壁情况良好，取出盖玻片，1％PBS洗3次，1min/次，加入95％乙醇固定15min，弃尽95％乙醇，1％PBS洗3次，1min/次，晾干后置-20℃保存。

2.2荧光抗体的标记

（1）把Mix–n-StainTMCFTM488A抗体标记试剂盒从4℃冰箱中取出，平衡至室温。

（2）用滤膜把pH 7.2，1％PBS过滤。

（3）把10mg NJ001单抗加入2ml过滤后的1％PBS，完全溶解后待用。

（4）吸取20μl NJ001单抗加入带有滤膜的EP管（Mix–n-StainTMCFTM488A抗体标记试剂盒提供）中，14000×g离心3min，弃去EP管底部液体。

（5）吸取20μl 1％PBS加入滤膜上，14000×g离心3min，弃去EP管底部液体。

（6）在滤膜上加入100μl 1％PBS，重悬抗体。

（7）吸取90μl抗体与10μl反应液（Mix–n-StainTMCFTM488A抗体标记试剂盒提供）充分混匀。

（8）将上述100μl混合液体转移至荧光染料管中，充分混匀，置室温，避光反应30min。

（9）将反应后的全部液体转移至300μl储存液（Mix-n-StainTMCFTM488A抗体标记试剂盒提供）中，置-20℃保存。

2.3直接免疫荧光检测技术的建立及优化

2.3.1最佳抗体工作浓度的选择

将已固定有SPC-A1的盖玻片从-20℃冰箱中取出，平衡至室温，加入5％BSA，1000μl/片，37℃，封闭1h，弃去BSA，1％PBS洗3次，1min/次，以1％PBS配置不同稀释比例（1：100、1：200、1：300、1：400、1：500、1：600）的荧光抗体，100μl/片，置37℃孵育1h，弃去荧光抗体，1％PBS洗3次，1min/次。以荧光显微镜下，荧光强度最强，非特异性染色最小者为本方法的最佳抗体工作浓度。同时以HFL-1作为阴性对照（所有实验步骤均与SPC-A1相同）。

2.3.2最佳反应时间的选择

将已固定有SPC-A1的盖玻片加入荧光抗体后置37℃分别孵育30min、1h（其余实验条件保持一致），以荧光显微镜下，荧光强度最强，非特异性染色最小者为本方法的最佳反应时间。

2.3.3是否需要BSA进行封闭的选择

取两块已固定有SPC-A1的盖玻片，一块加入5％BSA，1000μl/片，37℃，封闭1h，另一块直接加入荧光抗体置37℃孵育（其余实验条件保持一致），观察荧光显微镜下，两块细胞培养板中SPC-A1的荧光强度以及非特异性染色情况。

2.4临床样本的检测

以新建立的直接免疫荧光检测方法（把待测涂片平衡至室温，每片滴加荧光单抗（1：200）100μl，37℃孵育30min，1％PBS洗3次，滴加一滴甘油封片，置倒置荧光显微镜下观察结果）对93例癌性胸水和122例非癌性胸水脱落细胞上的SP70抗原进行检测，并与传统的HE染色法进行比较。

2.5胸水脱落细胞HE染色检测

把待测涂片置苏木精染液中浸染5min，蒸馏水冲去苏木精染液，置1％盐酸乙醇中3秒，蒸馏水冲去多余盐酸乙醇，置95％乙醇中3秒，置0.5％伊红染液中浸染3秒、依次浸入95％乙醇（Ⅰ）、95%乙醇（Ⅱ）、95％乙醇（Ⅲ）中各3秒，最后置95％乙醇中固定5分钟，中性树胶封片后，置光学显微镜下观察结果。

3结果

3.1细胞SP70抗原直接免疫荧光检测技术的建立

3.1.1荧光抗体最佳工作浓度的确定

建立直接免疫荧光检测技术后，对最佳荧光抗体工作浓度做进一步优化，配置一系列浓度的荧光抗体（1：100、1：200、1：300、1：400、1：500、1：600）对SPC-A1细胞进行检测的结果显示，当荧光抗体的浓度为1：200时，荧光强度最强，可达到最佳工作状态。

3.1.2直接免疫荧光检测技术最佳反应时间的确定

建立直接免疫荧光检测技术后，对最佳反应时间做进一步优化，SPC-A1细胞在加入荧光抗体后，置37℃分别孵育30min、1h，结果显示二者的荧光强度一致，故选择30min为最佳反应时间，以突出直接免疫荧光检测技术快速这一优点。

3.1.3是否需要BSA进行封闭的选择

建立直接免疫荧光检测技术后，对实验流程做进一步优化，在直接免疫荧光检测技术中，BSA可以封闭非特异性的结合位点，实验结果显示，未加入BSA进行封闭的实验组和加入BSA进行封闭的实验组，非特异性结合情况是一致的，均未出现非特异性的荧光染色，故出于简化实验流程的目的，可以不加入BSA进行封闭。

3.2临床样本胸水脱落细胞SP70抗原的检测

3.2.1胸水中脱落细胞直接荧光检测结果和HE染色检测结果比较

在癌性胸水中，直接免疫荧光法的阳性符合率为45.2%（42/93），HE染色法的阳性符合率为48.4%（45/93），两者阳性符合率无统计学差异（χ²=0.19，P＞0.05）。但两种方法联合检测，可使脱落细胞学检测结果的阳性符合率提高至54.8％（51/93），（表6，图5）。在非癌性胸水中，胸水脱落细胞上SP70检测结果均为阴性。直接免疫荧光法检测胸水脱落细胞结果显示：SP70在癌性胸水中脱落癌细胞的胞浆和包膜上均有表达，而在非癌性胸水的脱落细胞上未见明显的阳性信号（图6）。

表6癌性胸水脱落细胞SP70直接荧光检测和HE染色法检测比较（例）

注：采用配对χ²检验，P=0.659＞0.05。

本实施例所建立的直接免疫荧光法作为一种新型的检测技术，和HE染色法相比较，在肺癌所致的胸水脱落细胞检测上，阳性率无显著差异。且克服了细胞形态不易辨别这一缺点，既使没有经验的病理医生也很容易掌握该检测技术。两种方法同时检测可使阳性率提高至54.8％，降低了漏诊率。同时，在辨别癌细胞和反应性间皮细胞方面也具有一定的优势。综上所述，直接免疫荧光法检测肺癌胸水脱落细胞上的SP70抗原与传统的HE染色法相结合，可提高胸水脱落细胞学检查的敏感性，对诊断肺癌性胸水有重要的临床价值，具有广阔的应用前景。

Claims (9)

1.SP70作为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物在制备非小细胞肺癌胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。

2.SP70的单克隆抗体在制备非小细胞肺癌所致胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的SP70的单克隆抗体为保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体NJ001-1。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的单克隆抗体NJ001-1在制备检测非小细胞肺癌所致胸水的双抗体夹心ELISA检测试剂中的应用。

5.一种非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于包含荧光标记的SP70的单克隆抗体、5%BSA、1%PBS。

6.根据权利要求5所述的直接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于所述的SP70的单克隆抗体为保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体NJ001-1。

7.根据权利要求5所述的直接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于所述的荧光标记的SP70的单克隆抗体为Mix–n-Stain^TMCF^TM488A抗体标记试剂盒标记的单克隆抗体NJ001-1。

8.一种检测非小细胞肺癌胸水脱落细胞的试剂盒，其特征在于包含非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂，以及常规胸水脱落细胞HE染色检测试剂；其中所述的非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂包含荧光标记的SP70的单克隆抗体，优选包括Mix–n-Stain^TMCF^TM488A抗体标记试剂盒标记的单克隆抗体NJ001-1。

9.一种非小细胞肺癌诊断方法，其特征在于利用权利要求8所述的检测非小细胞肺癌胸水脱落细胞的试剂盒分别通过直接免疫荧光法以及胸水脱落细胞HE染色检测待检胸水脱落细胞，若二者检测均为阳性，则说明待检胸水脱落细胞为非小细胞肺癌胸水脱落细胞。

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