CN102650635A

CN102650635A - 肠道病毒71型胶体金检测试纸条及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102650635A
Application number: CN2012101516668A
Authority: CN
Inventors: 毛金武; 柳克华; 周咏武
Original assignee: HUNAN KANGRUN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HUNAN KANGRUN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2012-08-29

Abstract

本发明公开了一种肠道病毒71型胶体金检测试纸条，该试纸条包括：包被肠道病毒71型VP1特异性抗原SP55的单克隆抗体和质控抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维素膜；以及含有胶体金标记肠道病毒71型VP1特异性抗原SP70的单克隆抗体的玻璃纤维膜，本发明原理是应用膜层析双抗体夹心法检测样本中肠道病毒71型。本发明还公开了该胶体金检测试纸条的制备方法和应用。本发明的胶体金检测试纸条操作简单、快捷且无需应用专业仪器设备，适于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断。

Description

肠道病毒71型胶体金检测试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于病原生物学检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒71型抗原检测试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病是全球性传染病，近年来已经成为严重威胁儿童健康的传染病之一。其以发热和手、足、咽等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡，重症患儿病死率在10%-25%。

手足口病主要由肠道病毒属的柯萨奇病毒(Cox，A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5、13型)、埃可病毒(Echo)和肠道病毒71型(EV71)引起，其中以EV71及CoxA16型最常见。而EV71感染引起重症病例的比例较大。

肠道病毒呈球形，呈二十面体立体外观，无包膜，直径27～30nm。衣壳由60个相同壳粒组成，它们排列为12个五聚体。每个壳粒由来自一个原始壳粒蛋白VP0的4种多肽(VP1、VP2、VP3、VP4)组成。VP1、VP2、VP3暴露于外面，带有中和抗体的特异性抗原位点，VP4位于衣壳内部。肠道病毒基因组为单股正链RNA，长7.2～8.5kb。基因组两端为保守的非编码区，中间为连续的开放读码框架，编码一个2100～2400氨基酸的多聚蛋白。功能蛋白至少包括RNA聚合酶和两种其他的蛋白酶。此外，5^‘端共价结合一个约23氨基酸的基本蛋白VPg，与病毒RNA的合成和装配有关；3^‘端带有约50 nt的polyA尾，与病毒的感染性有关。VP1蛋白是病毒中和决定因子，直接决定病毒的抗原性，具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性及较大的变异性，为EV71基因分型的最重要对象，VP1蛋白是最适合建立ELISA方法的抗原。

由于针对EV71引起疾病的疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中，因此，对手足口病病毒尤其是EV71引起的重症患病儿童的早期诊断，可以更经济准确的控制该病流行及重症并发症的出现，从而保证儿童的健康。

中国医学科学院医学生物学研究所公开了“EV71型病毒抗原的检测方法”专利（申请号200910094972.0），该专利是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原。北京科兴生物制品有限公司公开了“EV71病毒中和表位抗原检测试剂盒或试剂及其制备方法”专利（申请号200910131382.0），该专利提供了一种采用具有光谱性活性的HD6单克隆抗体对EV71 病毒抗原进行定量检测的方法。以上均是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原，适用于临床诊断，由于检测时间较长且需要借助专业仪器设备，不适合作早期大规模筛查用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测肠道病毒71型的快速检测试纸条，用于检测肠道病毒71型的辅助诊断。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案如下：肠道病毒71型胶体金检测试纸条，其包含有：1）包被肠道病毒71型VP1特异性抗原SP55的单克隆抗体和质控抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维素膜；2）含有胶体金标记肠道病毒71型VP1特异性抗原SP70的单克隆抗体的玻璃纤维膜。

本发明的另一目的在于提供上述肠道病毒71型胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤。

1、两种EV71单克隆抗体的制备：用人工合成SP55和SP70两段VP1的多肽，分别免疫BALB/c小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备两株杂交瘤细胞，分别进行细胞培养后收集培养液，层析纯化后浓缩并冻干，-20℃保存备用，一株用于胶体金标记蛋白的制备，另一株用于包被硝酸纤维膜。

2、抗体-胶体金结合垫的制备：采用常规柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金颗粒，确定单克隆抗体胶体标记的最佳结合pH 为8.5，胶体金和抗体的配比为：4.5ug/ml胶体金，待标记蛋白最佳缓冲液选择0.005M 、pH8.2～8.5 的硼酸盐缓冲液，标记胶体金经稳定剂处理后，按每平方厘米100-150ul的量取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，放入37℃恒温干燥箱，6h后烘干取出后于室温干燥保存。

3、半成品膜条的制备：将VP1的另一株单克隆抗体用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成200μg/ml，将抗鼠IgG用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成1.2mg/ml，将两者喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，两线之间间隔为0.6-1.0cm，干燥后于室温干燥保存。

4、检测试纸条组装：将上述制备好的抗体-胶体金结合垫、半成品膜条、样品垫、吸水垫和反应支持物PVC板组装成检测试纸条。

本发明的目的还在于提供上述快速检测试纸条在检测肠道病毒71型中的应用。

本发明的原理是：采用一株EV71单克隆抗体标记40nm的胶体金制成金标垫，另外一株包被于硝酸纤维膜一端用作检测线，用抗鼠IgG包被于NC膜另一端作为质控线，辅以样品稀释液处理待测样品，采用双抗体夹心法的原理检测样品中的EV71抗原。

本发明有益效果是：本发明的胶体金检测试纸条操作简单、快捷且无需应用专业仪器设备，适于肠道病毒71型的早期筛查和临床辅助诊断。

具体实施方式

实施例1：EV71单克隆抗体的制备。

本产品的关键原料为EV71单克隆抗体和抗鼠IgG，二者的研发及制备地点均为中科院武汉病毒研究所。

EV71单克隆抗体制备：根据供应商提供的资料EV71单克隆抗体其制备方法如下：

用人工合成SP55和SP70(分别包含VP1的第163-177，208-222位氨基酸)两段VP1的多肽，分别免疫BALB/c小鼠，常规杂交瘤细胞技术进行细胞融合，用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞并测定效价，筛选出具有抗EV71抗体高分泌性、高亲合力的杂交瘤细胞作为原始细胞株准备投入生产，-173℃液氮条件下存放。

将按上述方法筛选得到的细胞种子从-173℃液氮罐中取出，尽快融化，在37℃培养获得一级种子液，同样条件培养得二级种子液，然后将种子液移至细胞培养缸中，于37℃的二氧化培养箱中培养，收集培养液。

上述培养液通过离心后获取上清液，再经膜分离系统过滤，收集到的上清液即为含EV71单抗的粗提物。将粗提物分别经过亲和层析，收集抗体，再经浓缩管浓缩至规定浓度。配制的2种包含不同EV71核心位置的抗体溶液，分别灌装、冻干成冻干管，-20℃保存备用。生产时其中一种用于胶体金标记蛋白的制备，另一种用于包被于硝酸纤维膜上。

实施例2：肠道病毒71型胶体金检测试纸条的制备。

1、胶体金的制备：采用常规柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金，具体步骤如下：1）打开数显搅拌恒温电热套，温度设220℃；2）取纯化水990ml倒入圆底烧瓶中，加入1%的氯化金10ml，放入数显搅拌恒温电热套里面进行加热搅拌；3）待圆底烧瓶中的溶液至沸30s后，加入1%柠檬酸三钠20ml，观察溶液变成酒红色后，继续煮沸10min后停止加热；4）自然冷却到室温后，加纯化水水定容至1000ml；5）避光2-8℃保存备用。

2、抗体-胶体金结合垫的制备： 1）量取上述金液250ml加2.5ml、0.1M的K₂CO₃，调pH至8.0-8.5，搅拌5min；2）取标金用EV71单克隆抗体1mg，用25ml、0.005M的硼酸盐缓冲液（pH8.5）稀释后，倒入上述金液中，搅拌30min；3）加入2.5ml、1％PEG20000，搅拌30 min；4）装入离心管中，10000rpm离心1h；5）弃上清液，每瓶各加125ml、0.005M的硼酸盐缓冲液（pH8.5），混匀后平衡，10000rpm离心1h；6）弃上清液，所得沉淀用含1%BSA+0.5%吐温20的0.005M的硼酸盐缓冲液（pH8.5）稀释至一定浓度；7）按每平方厘米100-150ul的量取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，放入37℃恒温干燥箱，6h后烘干取出后于室温干燥保存。

3、半成品膜条的制备：将VP1的另一株单克隆抗体用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成200μg/ml，将抗鼠IgG用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成1.2mg/ml，将两者喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，两线之间间隔为0.6cm，膜条长8cm，宽3毫米，干燥后于室温干燥保存。

4、检测试纸条组装：将上述制备好的胶体金结合垫、检测线、质控线、样品垫、吸水垫和反应支持物组装成检测试纸条。

实施例3：检测方法及结果。

1、检测方法：用棉签取样后，放入盛有500微升样品处理液的试管中，将拭子头部在管中搅动5下，使样本尽量多的保存在采样液中，并于管壁上挤压拭子头，尽量将拭子吸住的采样液挤回管中，再弃去拭子；将试纸插入试管，液面不超过MAX线，5-15分钟内观测结果。

2、检测结果：本发明的检测试纸条在湖南省儿童医院、湖南省第二人民医院和湖南省疾病预防控制中心进行临床考核，包括手足口病门诊患者、手足口病入院患者、肝病中心住院儿童、感染科各种疾病住院儿童，共考核了1002名受试者。临床实验验证的结果表明肠道病毒71型（EV71）抗原检测试剂（胶体金法），准确度高，特异性好，其中粪便拭子准确度为92.8%，特异度为95.3%，灵敏度为86.9%，阳性样本与PCR的符合率为86.9%，阴性样本与PCR的符合率为96.9%；咽拭子准确度为94.3%，特异度为98.6%，灵敏度为84.2%，阳性样本与PCR的符合率为84.2%，阴性样本与PCR的符合率为99.4%；肛拭子准确度为94.7%，特异度为97.0%，灵敏度为89.2%，阳性样本与PCR的符合率为89.2%，阴性样本与PCR的符合率为98.3%。

从临床适用性来看，该试剂可适用于EV71型粪便拭子、咽拭子、肛拭子的检测，且操作简便、可即时得知结果，非常方便各医疗机构快速辅助鉴别诊断及监测手足口病重症型。

上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种肠道病毒71型胶体金检测试纸条，其特征在于，包含有：

1）包被肠道病毒71型VP1特异性抗原SP55的单克隆抗体和质控抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维素膜；

2）含有胶体金标记肠道病毒71型VP1特异性抗原SP70的单克隆抗体的玻璃纤维膜。

2.一种制备权利要求1所述肠道病毒71型胶体金检测试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）两种EV71单克隆抗体的制备：用人工合成SP55和SP70两段VP1的多肽，分别免疫BALB/c小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备两株杂交瘤细胞，分别进行细胞培养后收集培养液，层析纯化后浓缩并冻干，-20℃保存备用，一株用于胶体金标记蛋白的制备，另一株用于包被硝酸纤维膜；

2）抗体-胶体金结合垫的制备：采用常规柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金颗粒，确定单克隆抗体胶体标记的最佳结合pH 为8.5，胶体金和抗体的配比为：4.5ug/ml胶体金，待标记蛋白最佳缓冲液选择0.005M 、pH8.2～8.5 的硼酸盐缓冲液，标记胶体金经稳定剂处理后，按每平方厘米100-150ul的量取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，放入37℃恒温干燥箱，6h后烘干取出后于室温干燥保存；

3）半成品膜条的制备：将VP1的另一株单克隆抗体用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成200μg/ml，将抗鼠IgG用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成1.2mg/ml，将两者喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，两线之间间隔为0.6-1.0cm，干燥后于室温干燥保存；

4）检测试纸条组装：将上述制备好的抗体-胶体金结合垫、半成品膜条、样品垫、吸水垫和反应支持物PVC板组装成检测试纸条。

3.根据权利要求1所述肠道病毒71型胶体金检测试纸条在检测肠道病毒71型中的应用。