CN102089657A

CN102089657A - 检测

Info

Publication number: CN102089657A
Application number: CN2009801242109A
Authority: CN
Inventors: D·B·盖勒维
Original assignee: Cytosystems Ltd
Current assignee: Cytosystems Ltd
Priority date: 2008-06-24
Filing date: 2009-06-18
Publication date: 2011-06-08
Also published as: JP2011527003A; CA2766480A1; US10145850B2; WO2009156711A1; EP2664921B1; JP5727931B2; US20110184073A1; EP2291653A1; GB0811567D0; EP2664921A1

Abstract

本发明涉及一种检测或测定来自受试者的体液样本中前列腺癌细胞的存在的方法，该方法包括：(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；(ii)使所述细胞样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件接触；和/或(iii)使所述细胞样本与能够结合微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的特异性结合元件接触；和(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

Description

检测

技术领域

本发明涉及一种在体液(如尿液)中检测前列腺癌细胞的方法。

发明背景

前人的研究发现微小染色体维持蛋白(MCM)是上皮组织的细胞周期过程中的关键调节因子(见WO99/21014和Gonzalez等，NatureReviews/Cancer，第5卷：第135-141页，2005年二月)。多种保守机制限制DNA在每个细胞周期中只复制一次。MCM及其调节因子在增殖中的关键作用使得它们成为癌症检测和预后中常规临床应用的潜在的重要生物标记物。

MCM被鉴定为“细胞周期状态”的有用的生物标记物，即，细胞是否能够增殖而不是静止或衰老的。所有6种MCM(MCM 2-7)的表达见于细胞周期的所有时相，而在退出细胞周期进入静止期、分化或衰老之后表达量下调。这在正常分层上皮(包括很多组织，包括宫颈、膀胱、结肠以及其它上皮组织的口咽部)的免疫组化检测中是很明显的。在以上列举的每一个示例中，MCM限制在基底增殖性隔间而不存在于终末分化的表层角质形成细胞。相反，在侵袭前上皮病变中，增殖性隔间随着组织学分级增加而逐渐扩大，与此同时，上皮表面出现MCM阳性细胞(在高度鳞状上皮病变例如宫颈中为90％以上，在同一组织的低度鳞状上皮内病变中为约40％)。

MCM能从静止细胞中区分出周期细胞的能力促进了癌症筛检方法的潜在的临床应用，所述癌症筛检方法依赖于检测从表面上皮细胞脱落的恶性或恶化前细胞，如使用细胞检测技术进行宫颈癌筛检或从病人受膀胱移行细胞癌影响的尿液中进行膀胱癌筛检。

本发明涉及用于检测前列腺癌的筛选。尽管MCM可以作为检测体液如尿液中的恶化细胞的靶标，但它们不是组织特异性的。因此，需要在尿液中特异性检测前列腺癌细胞的方法。本发明基于前列腺上皮细胞可在尿液中检测到，这反过来可用于恶性肿瘤分析。

因此根据本发明的第一个方面，提供了一种检测或测定来自受试者的体液样本中前列腺癌细胞的存在的方法，该方法包括：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(ii)使所述细胞样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件接触；和/或

(iii)使所述细胞样本与能够结合微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的特异性结合元件接触；以及

(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

一般来说，所述体液不是血液或脑脊液。所述体液可以为尿液或精液。或者所述体液可以为粪便。优选地，所述体液为尿液。优选地，所述受试者为人类。

细胞可以经技术人员所知的任一方法从所述体液样本中分离出来。所述细胞一般通过所述体液样本离心或过滤分离得到。优选由体液样本过滤而分离得到细胞。在本发明的优选方法中，对所述样本进行抗原修复(retrieval)。抗原修复在本领域是标准的(见提供示例性方法的Hiraiwa等关于Shin等(1991)Lab.Invest.64，693-702)。抗原修复条件可以包括使所述细胞样本接触pH为7.8的EDTA缓冲液中，95℃水浴或微波45分钟。

在本发明的一种方法中，所述前列腺抗原可以为前列腺组织的特异抗原。前列腺抗原可以存在于正常(即非癌的)和前列腺肿瘤细胞中。所述前列腺抗原的例子包括但不限于：前列腺酸性磷酸酶(PSAP)、前列腺特异抗原(PSA)、前列腺特异G蛋白偶联受体(PSGR)和α-甲酰辅酶A消旋酶(AMACR)。优选地，该前列腺抗原为PSAP或PSGR。在本发明的一种实施方式中，所述前列腺抗原为PSA。

在本发明的一种方法中，所述MCM选自MCM 2、3、4、5、6和7。所述MCM可以为2个或更多不同MCM的组合，例如，选自MCM 2、3、4、5、6和7的2个不同的MCM。例如，所述MCM可以包括MCM2和选自MCM 3、4、5、6和7的一个其它的MCM。在另一个例子中，所述MCM可以包括MCM5和选自MCM 2、3、4、6和7中的一个其它的MCM。在本发明的一种优选方法中，所述MCM选自MCM 2、3、5和7。在本发明的另一种优选方法中，所述MCM选自MCM 2、5和7。

在本发明的一种方法中，所述MCM可以包括MCM 2和MCM 5。在本发明的另一种方法中，所述MCM可以包括MCM 2和MCM 7。在本发明的又一种方法中，所述MCM可以包括MCM 5和MCM 7。

此处所述的“特异性结合元件”为彼此具有结合特异性的分子对中的元件。特异性结合对的元件可以为自然来源或者完全或部分合成产生。所述分子对的一个元件在其表面有一个可以为突出或凹洞的区域，这个区域与分子对的另一元件的特别的空间和极性组织特异性结合并因此互补。因此，所述分子对的元件具有彼此特异性结合的特性。

特异性结合对的类型的例子为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物、DNA-DNA(如寡核苷酸)。本发明主要关注抗原-抗体类型的反应，尽管它也关注与此处定义的抗原结合的小分子。

本文使用的术语“抗体”为免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含特异性结合抗原的抗原结合位点的分子，不论是天然的或者部分或全部合成产生的。术语也包括具有为抗体结合结构域的结合结构域的任意多肽或蛋白，或者具有与抗体结合结构域同源的结合结构域的任意多肽或蛋白。这些可以来源于天然来源，或者它们可以由部分或全部合成产生。抗体的例子为免疫球蛋白同型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其同型亚类；包含抗原结合结构域的片段，如Fab、scFv、Fv、dAb、Fb；以及双抗体。抗体可以为多克隆的或单克隆的。

由于抗体可以以多种方式进行修饰，所以术语“抗体”应解释为覆盖具有结合结构域的任一特异性结合元件或物质，所述结合结构域具有所需特异性。因此，这个术语包括抗体片段、衍生物、抗体的功能等同物和类似物、人源化抗体，其包括包含免疫球蛋白结合结构域的任一多肽，不论是天然的或者全部或部分合成的。

对于目标靶标特异的抗体，例如MCM或PSA、PSAP、PSGR或AMACR，可以采用本领域的标准技术获得。制备抗体的方法包括用蛋白或蛋白的片段或表达所述蛋白或片段的细胞或病毒免疫哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔子)。抗体可以使用本领域已知的众多技术中的任一种从被免疫的动物处获得，并进行筛选，例如使用抗体与目标抗原的结合。

“抗原结合结构域”是抗体的某一部分，这一部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。如果抗原很大，抗体可以只与抗原的一个特别的部分结合，这部分称为表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供。抗原结合结构域可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区。

“特异”一般用于指特异性结合对的一员不表现与其特异性结合伙伴之外的分子的任何显著结合的情形，例如，与任一其它分子的交叉反应性少于约30％，优选20％、10％或1％。

按照本发明，本发明的所述特异性结合元件优先为“分离”的形式。元件一般游离于或基本上游离于它们天然联系的物质，例如当它们见于其自然环境或它们所制备的环境(如细胞培养)中(当该制备由体外或体内重组DNA技术进行时)时和它们在一起的其它多肽。

因此本发明所述特异性结合元件优选抗体或其片段。因此，例如，在(ii)中，所述特异性结合伙伴元件可以为具有对前列腺组织特异的抗原结合结构域的抗体或其片段。例如，在(iii)中，所述特异性结合元件可以为具有对MCM特异的抗原结合结构域的抗体或其片段。

所述抗体可以为多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体或前述任一抗体的片段。优选的特异性结合元件为单克隆抗体。例如，在(ii)中，特异性结合元件可以为具有对前列腺组织特异的抗原结合结构域的单克隆抗体。对PSA(Dako)、PSAP(Sigma)、PSGR(Abcam)和AMACR(Dako)特异的单克隆抗体为本领域所已知，其详细信息包含在附件1中。例如，在(iii)中，特异性结合元件可以为具有对MCM特异的抗原结合结构域的单克隆抗体。对MCM特异的单克隆抗体为本领域所已知，例如，在本研究中所使用的抗-MCM2的抗体由Cancer Cell Unit，Hutchison/MRCResearch Centre，Hills Road，Cambridge CB20XZ友情提供。

使用杂交瘤细胞生产单克隆抗体为本领域所公知。用于产生单克隆抗体的方法由Kohler和Miltein在Narure 256，495-497(1975)以及Donillard和Hoffman，“Basic Facts about Hybridomas”in Compendium of ImmunologyV.II ed.by Schwartz，1981上公开，这些都被引入本文作为参考。

在本发明的一种方法中，本发明所述特异性结合元件可以为可检测标签例如，放射性标记如1或99Tc所标记，放射性标记可以以抗体成像领域所已知的常规化学方法附加到特异性结合元件上。标签也包括酶标记，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。标签也包括化学部分，如生物素，其可以通过与特异的同源可检测部分(如标记的抗生物素蛋白)结合检测。

特异性结合元件如抗体在正常和测试样本中的反应性可以通过任一合适的方法测定。其它标签包括具有可光谱分离的吸收或发射特性的荧光素、磷光剂或激光染料。合适的荧光素包括荧光黄、罗丹宁、藻红素和德克萨斯红。合适的显色染料包括二氨基联苯胺。其它的标签包括大分子胶体粒子或颗粒物，如有色的、磁性或顺磁的乳胶微球和可直接或间接产生可视觉观察、电子检测或以其它方式记录的可检测信号的生物或化学活性的试剂。上述分子可以为酶，所述酶催化可产生或改变颜色的或导致例如电性能的变化的反应。它们可以为可分子激发的，从而能量状态间的电子转移导致特有的光谱吸收或激发。它们可以包括与生物传感器相连使用的化学实体。在下文所描述的实施例中，使用了碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

在本发明的一个优选方面，所述方法包括以下步骤：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(ii)使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触；和

(iii)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

在本发明的另一方面上，所述方法包括以下步骤：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(ii)使所述细胞样本与一种或多种MCM的特异性结合元件接触；和

(iii)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

在本发明的另一个优选方面，所述方法包括以下步骤：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(ii)使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触；和

(iii)使所述细胞样本与微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的一种或多种特异性结合元件接触；和

(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触的步骤可以与使所述细胞样本与微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步骤分别、顺序或同时进行。在本发明的一种实施方式中，使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触的步骤与使所述细胞样本与微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步骤同时进行。

使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触的步骤与使所述细胞样本与微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步骤优选分别和顺序进行。因此在本发明的一个优选方面，提供了一种用于检测或测定来自受试者的体液样本中前列腺癌细胞的存在的方法，其包括：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(ii)使所述细胞样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件接触；接下来，

(iii)使所述细胞样本与能够结合微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的特异性结合元件接触；和

(iv)测定所述的特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

在本发明的另一个方面，提供了组合物，其包含前列腺抗原(例如PSA和/或PSAP)的特异性结合元件和微小染色体维持蛋白(MCM)多肽(如MCM2和/或MCM5和/或7)的一种或多种特异性结合元件。

在本发明的另一方面，提供了在根据本发明的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含根据本发明的组合物。可以含有一种或多种其它试剂，如本文所描述的标签分子。其它试剂可以包括以下组分的任意组合或全部：减少非特异染色的封闭试剂、在储存中维持特异性结合元件活性的储存缓冲液、要使用的染色缓冲液和/或洗脱液(如在抗体染色时)、正对照、负对照等等。正对照和负对照可以用于验证根据本发明使用的和试剂盒可以提供的试剂的活性和正确使用。对照的设计和使用是标准的并且在本领域普通技术人员的常规能力以内。所述试剂盒还可以含有实施本发明方法的说明书。

在本发明的另一方面，提供了用于治疗受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括：

(i)根据本发明的第一方面的方法，检测或测定来自所述受试者的体液样本如尿液中前列腺癌细胞的存在；

(ii)当所述样本中检测到前列腺癌细胞时，向所述受试者给予前列腺癌的治疗。

本发明另一方面提供了一种将前列腺组织分类为(i)正常或(ii)潜在或实际上为癌症前期或患癌的、发育异常的或患肿瘤的方法，该方法包括测定体液样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件和/或能够结合微小染色体维持蛋白(MCM)多肽的特异性结合元件的结合。结合的形式和程度可以与已知正常样本和/或已知异常样本的结合的形式和程度相比较。

在本说明书的整个描述和权利要求中，词语“包含”(comprise)和“含有”(contain)以及这些词的衍生词，如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，意为“包括但不限于”，目的不是为了排除其它的部分、添加物、成分、整数或步骤。

在本说明书的整个描述和权利要求中，单数包含复数，除非文本另有要求。尤其是，本说明书在使用不定冠词的地方理解为涵盖复数和单数，除非文本另有要求。

与本发明的一个具体方面、实施方式或实施例一起描述的特征(features)、整数(integers)、特点(characteristics)、化合物、化学部分或基团理解为适用于本文描述的任一其它方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。

以下，参考下列附图以实施例的方式来描述本发明：

图1：用MCM-2和PSA抗体标记的前列腺癌细胞(细胞系C4-2b)的照片；a)前列腺癌细胞显示出MCM-2的暗的核的染色和PSA的红色的胞质染色；和b)高分辨率的前列腺细胞显示出非常暗的MCM2的核染色，胞质中的红色指示PSA的存在；

图2：用MCM-2和PSA的抗体标记的膀胱癌细胞(细胞系EJ28)的照片；a)膀胱癌细胞显示出MCM的靶标核染色，没有检测到PSA；b)高放大倍数下，膀胱癌细胞显示出靶标核染色细胞，没有检测到PSA；

图3：高放大倍数的照片。a)用MCM-2和PSA的抗体标记的前列腺癌细胞(细胞系C4-2b)-显示出指示MCM阳性的深染色的核和指示PSA的染色为红色的周围胞质物质；b)用MCM-2和PSA的抗体标记的膀胱癌细胞(细胞系EJ-28)-显示出指示MCM的深染色的核，但没有任何胞质染色，指示不存在PSA。

实施例

材料

实施例1

对收集自患有前列腺癌的病人的尿液进行MCM检测

随后将收集自患有前列腺癌的病人的尿液转移至实验室，用常规的方法进行液基细胞学片子的制备。尤其是，将全部体积的尿液样本分装至Falcon管中用于离心及后续的标准步骤，制备了包含前列腺特异上皮细胞的细胞沉淀的制备物。用于常规评估的比较PAP染色的片子咨询了负责细胞病理学实验室的顾问，同时用于免疫细胞化学染色的片子存放于4℃以待成批染色及其后处理。在下文描述与细胞免疫病理学实验室染色相关的文档。尤其是，在95℃水浴45分钟的条件下使用抗原修复和pH为7.8的EDTA是细胞学片子预染色方案的一个重要部分。

材料与方法

针对前列腺MCM的双染色方案

本方案使用DAKO EnVisionTM G/2双染色系统(K5361)，目的是使用小鼠和兔子的一抗进行免疫组化检测在经福尔马林固定、石蜡包埋的组织中或固定的细胞涂片中的抗原。设计观察系统以在一个样品中同时检测两种不同的抗原。该系统可以在人工操作或使用Dako自动染色仪器时使用。

所述程序为顺序双染色，使用HRP/DAB+观察第一个抗原，使用AP/永久红观察第二个抗原。双内源酶封闭抑制某些组织中存在的内源的碱性磷酸酶、过氧化物酶和假过氧化物酶的活性。对内源的酶进行封闭之后的第一个步骤是将样品与最佳稀释的小鼠或兔子的一抗孵育，之后与聚合物/HRP试剂孵育。该试剂是HRP偶联的、也携带抗小鼠和兔子免疫球蛋白的抗体的葡聚糖聚合物。所述反应通过DAB+发色体观察。封闭步骤之后，使用双染封闭试剂，样品与第二个最佳稀释的小鼠或兔子的一抗孵育。下一步，加入兔子/小鼠(LINK)；携带抗小鼠和兔子的免疫球蛋白的抗体的葡聚糖聚合物，之后与聚合物/AP试剂孵育。通过永久红发色体观察第二个反应。所述试剂盒提供除一抗外的所有指定试剂。

自动染色机染色方案的第一种抗体(MCM-2)为1∶40的稀释倍数由Cancer Cell Unit，MRC，Cambridge提供。自动染色机染色方案的第二种抗体(MCM-2)为1∶40的稀释倍数由Cancer Cell Unit，MRC，Cambridge提供。

碱性磷酸酶底物

碱性磷酸酶(液体永久红)，这种试剂必须在其使用前不超过30分钟制成并放进自动染色机。

复染色之后，片子不应该用乙醇和二甲苯脱水-片子应该简单地在空气中干燥，然后使用含水封装介质(我们使用DAKO Faramount含水封装介质S3025)进行封片，或者如果使用永久封装，则再在空气中简单地干燥片子，然后使用Dako永久封装S3026或其它等效物。要注意的是液体红在白光下或在使用“德克萨斯红/罗丹宁”滤色片的荧光下都可以为红色-这在区分DAB和碱性磷酸酶染色上可能是有用的。

结果

38个来自已知患有前列腺癌的病人的样本收集自前列腺癌诊所的门诊。迄今为止，已经处理了38个样本中的22个。22个检测的片子中有22个确认了不同等级(1-4级)的前列腺癌的存在，并且显示出MCM阳性的细胞，即，不同等级的侵染性的恶性肿瘤的明显证据。

实施例2

材料与方法

在LBC尿液制备物中(膀胱细胞对照)进行前列腺细胞的单染的方案

前列腺PSA研究的细胞免疫病理学实验室染色方案

使用标准的Envision染色。

实施例3

材料与方法

对收集自患有前列腺癌的病人的尿液进行MCM和PSA双检测

MCM2由Cancer Cell unit，Hutchison/MRC Research centre，Hills Road，Cambridge CB2 0XZ提供。每次附着，抗PSA的抗体以1∶30,000的稀释倍数提供。

前列腺MCM-2/PSA研究的双染色方案

A组织学片子预染色方案

1.片子脱水，用二甲苯＞乙醇；酒精；水

2.于pH为6的柠檬酸盐缓冲液中微波10+10分钟进行抗原修复

3.水洗，然后置于自动染色机上

B细胞学片子的预染色方案

1.片子在50％乙醇中浸没5分钟

2.在蒸馏水中漂洗，然后置于TBS中

3.在pH为7.8的EDTA缓冲液中95℃水浴45分钟(或组织级微波)进行抗原修复

4.室温冷却20分钟

5.置于自动染色机前，先在水然后在缓冲液中漂洗

C1自动染色机染色方案第一种抗体(MCM-2，稀释倍数为1∶40)(envisionHRP)DAKO G/2双染色试剂盒(K5631)

1.双内源酶封闭5分钟

2.用TBS缓冲液洗2次

3.加入抗体和对照60分钟

4.用TBS缓冲液洗2次

5.加入Envision聚合物HRP30分钟

6.用TBS缓冲液洗2次

7.DAB底物5分钟

C2第一个反应的封闭

8.从自动染色机上取出片子，在水中洗3分钟

9.片子于pH为6的柠檬酸盐缓冲液中微波5分钟

10.自来水洗3分钟，然后放回自动染色机

C3自动染色机染色方案第二种抗体(PSA，以1∶30,000的稀释倍数)(envision碱性磷酸酶)DAKO G/2双染色试剂盒(K5631)

11.双染色封闭3分钟(辅助试剂)

12.用TBS缓冲液洗2次

13.加入第二组一抗和对照60分钟

14.用TBS缓冲液洗2次

15.G/2兔子/小鼠连接15分钟(次级试剂)

16.用TBS缓冲液洗2次

17.加入Envision聚合物碱性磷酸酶15分钟(三级试剂)

18.用TBS缓冲液洗2次

19.液体(永久的)红色碱性磷酸酶底物5分钟

染色后方案

D1.在水中漂洗

2.CuSo45分钟

3.在水中漂洗

4.复染色：苏木精10秒

5.用水漂洗

6.Scott’s自来水洗40秒

7.用水漂洗

8.片子在空气中干燥

9.无水封装或永久封装盖玻片

结果

从前列腺癌细胞系中获得合理的结果。褐色的核染色(MCM-2)和红色的胞质染色(PSA)-见图1至3。对照的膀胱细胞系染色为MCM-2阳性而PSA阴性。然而，临床样本为很弱的PSA阳性(检测了40例)。

实施例4

对收集自患有前列腺癌的病人的尿液进行MCM-2和PSA反向双染色检测

鉴于从实施例3中得到的结果，我们研究了微弱的PSA的染色是否是因为PSA抗原在用于恢复MCM-2抗原的热修复过程中被破坏。用抗PSA的抗体对临床样本(没有热修复的)的单过氧化物酶进行(褐色)染色。得到的结果(结果没有给出)表明临床样本用抗PSA的抗体显示出强烈的染色。这些结果确认了在LBC尿液样本中前列腺细胞的存在。随后，我们检测了双染色是否可以先进行PSA染色，然后热处理之后，用碱性磷酸酶进行抗MCM2染色。

材料与方法

对前列腺癌细胞进行PSA和MCM-2的双染色的方案(膀胱癌细胞作为对照)

A组织学片子预染色方案

1.片子脱水，用二甲苯＞乙醇；酒精；水

2.于pH为6的柠檬酸盐缓冲液中微波10+10分钟进行抗原修复

3.水洗，然后置于自动染色机上

B细胞学片子的预染色方案

1.片子在50％乙醇中浸没5分钟

2.在蒸馏水中漂洗，然后置于TBS中(注意没有热修复)

3.置于自动染色机前，先在水然后在缓冲液中漂洗

C1自动染色机染色方案DAKO G/2双染色试剂盒(K5631)

第一种抗体为抗前列腺特异抗原(PSA)DAKO兔子多克隆抗体(A0562)1∶25,000(envision HRP)

第二种抗体为抗MCM-2稀释倍数为1∶40(envision碱性磷酸酶)

1.双内源酶封闭5分钟

2.用TBS缓冲液洗2次

3.加入抗体和对照30分钟

4.用TBS缓冲液洗2次

5.加入Envision聚合物HRP30分钟

6.用TBS缓冲液洗2次

7.DAB底物5分钟

8.从自动染色机中取出片子，自来水中洗3分钟

9.片子置于pH为7.8的EDTA热修复缓冲液中微波20分钟(10+10分钟)

10.冷却5分钟后，自来水洗5分钟

11.将片子放回自动染色机

12.双染色封闭3分钟(辅助试剂)

13.用TBS缓冲液洗2次

14.加入第二组一抗和对照60分钟

15.用TBS缓冲液洗2次

16.G/2兔子/小鼠连接15分钟(次级试剂)

17.用TBS缓冲液洗2次

18.加入Envision聚合物碱性磷酸酶15分钟(三级试剂)

19.用TBS缓冲液洗2次

20.加入液体(永久的)红色碱性磷酸酶底物7分钟

注意：-按照双染试剂盒所指示，该试剂在需要前30分钟制备并放入自动染色机-我们以每毫升底物溶液1滴的量加入Levamisole(DakoX3021)。记得加levamisole。

17.用水漂洗

后处理/双染色方案

在白光显微镜下，MCM-2阳性的细胞会具有红色的核，如果它们也表达PSA，则会在胞质中出现强烈的褐色。

额外提示：

自动染色仪器的操作程序

第一次在Dako自动染色仪器上应用EnVision^TMG/2双染色系统之前，需要设置新的模板。模板：K5361：-*注意

我们使用缓冲液漂洗2次的步骤

碱性磷酸酶底物/

染色后方案

1.在水中漂洗

2.CuSo45分钟

3.在水中漂洗

4.复染色：苏木精10秒

5.用水漂洗

6.Scott’s自来水洗30秒

7.用水漂洗

8.片子在片子加热器中干燥

9.用Faramount含水封装介质DAKO封装盖玻片

双染色方案

碱性磷酸酶底物

碱性磷酸酶(液体永久红)，这种试剂必须在其需要前不超过30分钟制成并放进自动染色机(成批-底物试剂)。复染色之后，片子不应该用乙醇和二甲苯脱水-片子应该简单地在空气中干燥，然后使用含水封装介质(我们使用DAKO Faramount含水封装介质S3025)进行封片，或者如果使用永久封装，再在空气中简单地干燥或将片子置于片子(切片)干燥器，即，LAMB加热器设置为60℃，然后使用Dako永久封装S3026或其它等效物。如果使用的是自动“封片机”-片子可以放入二甲苯中而染色不会有明显损失。要注意的是液体红在白光下或在使用“德克萨斯红/罗丹宁”滤色片的荧光下都可以为红色-这在区分DAB和碱性磷酸酶染色上可能是有用的。

结果

通过反向双染色，即，抗PSA染色后再进行抗MCM-2，所得的结果(结果没有给出)显示出明显的改进。

本实验室的重复实验表明双染色的最佳结果需要PSA以1∶25,000的稀释倍数先染色，而后再进行MCM以1∶40的稀释倍数的染色。在后来的全部分析和很多不同前列腺细胞系的全部检测中采用这种方法。

实施例5

对收集自患有前列腺癌的病人的尿液进行前列腺标记物和MCM双检测

实验操作如下：

先进行抗前列腺抗原的抗体染色(PSAP、PSA和PSGR)，随后进行抗MCM的抗体染色(单独的MCM 2、3、5和7以及组合)。

Claims

1.一种检测或测定来自受试者的体液样本中存在前列腺癌细胞的方法，所述方法包括：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(iii)使所述细胞样本与能够结合微小染色体维持(MCM)多肽的特异性结合元件接触；和

(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述体液为尿液或精液。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述体液为尿液。

4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，通过过滤所述体液样本从体液样本中分离出所述细胞。

5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，使在(i)中分离的所述细胞样本进行抗原修复。

6.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述前列腺抗原为前列腺组织特异性抗原。

7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述前列腺抗原在正常的前列腺细胞中表达。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述前列腺抗原在前列腺肿瘤细胞中表达。

9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述前列腺抗原选自前列腺酸性磷酸酶(PSAP)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性G蛋白偶联受体(PSGR)和α-甲酰-辅酶A消旋酶(AMACR)。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述前列腺抗原为PSAP或PSA。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述前列腺抗原为PSA。

12.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述MCM选自MCM2、3、4、5、6和7。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述MCM为MCM2和/或MCM5。

14.如权利要求12所述的方法，其中，所述MCM包含两种或多种不同的MCM。

15.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述特异性结合元件为抗体或其片段。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体。

17.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，用可检测的标签标记所述特异性结合元件。

18.如权利要求1-11或15-17中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(ii)使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触；和

(iii)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

19.如权利要求1-5或12-17中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(iii)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

20.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(i)从所述样本中分离细胞以提供细胞样本；

(ii)使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触；和

(iii)使所述细胞样本与微小染色体维持(MCM)多肽的一种或多种特异性结合元件接触；和

(iv)测定所述特异性结合元件与所述细胞样本的结合。

21.如权利要求21所述的方法，其中，使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触的步骤可以与使所述细胞样本与MCM多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步骤分别、顺序或同时进行。

22.如权利要求21所述的方法，其中，使所述细胞样本与前列腺抗原的特异性结合元件接触的步骤与使所述细胞样本与MCM多肽的一种或多种特异性结合元件接触的步骤同时进行。

23.一种组合物，其包含前列腺抗原的特异性结合元件和MCM多肽的一种或多种特异性结合元件。

24.一种用于检测和测定来自受试者的体液样本中存在前列腺癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求23所述的组合物。

25.如权利要求24所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含一个或多个可检测的标签。

26.一种用于治疗受试者的前列腺癌的方法，所述方法包括：

(i)根据如前述任一项权利要求所述的方法，检测或测定来自所述受试者的体液样本中前列腺癌细胞的存在，所述体液样本例如尿液；

27.一种将前列腺组织分类为(i)正常或(ii)潜在或实际上为癌症前期或患癌症的、发育异常的或患肿瘤的方法，所述方法包括测定体液样本与能够结合前列腺抗原的特异性结合元件和/或能够结合微小染色体维持(MCM)多肽的特异性结合元件的结合。