JPH01141355A - 癌性および前癌性の結腸直腸疾患の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は癌性または前癌性の結腸直腸疾患と癌性でない
かまたは肺癌性でない組織学的に同様の疾患を区別する
ための診断法に関する。この方法ではモノクローナル抗
体、好ましくはアデノーマ性結腸直腸ポリープにおける
形成異常に関連した抗原である血液個物質Ｈを認識する
抗体ＩＢＤ−１２が使用される。

潰瘍性大腸炎はアメリカ北部工業地帯の人口の約α０５
％を冒す結腸の慢性、特発性かつ炎症性の状態である。

この疾患は下痢と直腸出血が再発することが特徴で、−
生にわたる医学的管理を必要としよう。より重要なこと
は、潰瘍性大腸炎が前癌状態であることが今や十分に認
識されていること、および全大腸炎患者の約１３％に癌
が発生するであろうと見積もられているっ米国の結腸癌
の新しい患者全部の約１％が慢性炎症性腸疾患の合併症
として生ずる。大部分の結腸悪性腫瘍に比較して、これ
らの癌はより若年層に生じ、多病巣性でありそしてより
侵襲性挙動をする傾向がある。

潰瘍性大腸炎における悪性腫瘍の大部分は予防されつる
と信じられている、何故なら冒された結腸の上皮が癌の
発生に先立ち前癌性の形成異常性変化を来し、そしてこ
れら前癌性変化が規則的な検査バイオプシーにより検出
されつるからである。悪性腫瘍の危険性は疾患の期間が
長くなるに伴い増大し、１５年で約５％そして続く１０
年毎に２０％ずつ増大するので、潰瘍性大腸炎のある患
者は診断されて７〜１０年目から毎年結腸内視術および
検査バイオプシーを行うことが推奨される。

理論的には一応簡単であるが、検査の器具は問題を孕ん
でいる。それぞれの結腸内視術で通常結腸の異なる領域
からランダムに６または７個のバイオプシーが採取され
る。形成異常は肉眼では識別できない。従って、方向性
のある／シイオプシーは排除されることになり、そして
試料採取の過誤がこの操作の有効性を主として限定する
ものとなる。闘えって、急性炎症または上皮再生（治癒
）により生じた非定型的細胞学的変化が形成異常に似て
いるので、バイオプシー標本それ自体が病理学者にとっ
て解釈困難である。検査バイオプシーの解釈におけるｍ
ａ者間の変動は経験を積んだ病理学者の間で４〜８％で
ありそして未熟練病理学者では疑い無くもつと高い。こ
れらの問題は形成異常が総体的および顕微鏡的のいずれ
においても識別されうるならば大きく軽減されるかまた
は排除されさえしよう。

潰瘍性大腸炎および炭水化物発現に関する多数の刊行物
が存在する。しかしながら、これらは８ｈａａｈａｎ氏
のＦｒｏｎｔ、　ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ、　Ｒｅｓ
、　４　ｓ５１〜６４　（Ｋａｒｇｅｒ、　Ｂａ５ａｌ
　１９７９　）を除けば直接Ｈ物質の検出に関するもの
ではない。血液型物質Ｈを規定する化学的部分はＮ−ア
セチルグルコサミンにβ１−３／４結合したガラクトー
スにβ１−３結合した非還元性末端α−Ｌ−フコースを
含有するオリゴサツカライドである。５ｅａｈａｎ氏の
論文である「Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐ　ＡＢＨＩｓｏａ
ｎｔｉｇｅｎａ　１ｎＣｏｌｏｎｉａ　　Ｍｕｏｏａａ
　　ｏｆ　　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　　ｒｎｆｌ
ａｍｍａ　−ｔｏｒｙ　Ｂｏｗｅｌ　ＤｉｓｅａａｅＪ
ではＨ物質の存在を判定するためにレクチンであるウレ
ツクス・ユーロはウス（υｌａｗ　ｅｕｒｏｐａｅｕａ
　）を用いている０レクチンにはＣｏｍｐｔｏｎ氏のＣ
ａｎ０ｅｒ　５９　：　１１８〜１２７（Ｉ９８７）に
記載される欠点がある。％にウレツクス・ユーロベウス
レクチンは物質Ｈに対するＩＢＤ−１２モノクローナル
抗体より本来特異性が劣る。何故ならレクチンの特異性
はＬ−７コースが何に結合されているかに関わりなくそ
のＬ−フフース基との反応性にのみ存在するが、ＩＢＤ
−１２は血液型物質Ｈの一部分である糖部分関連の７コ
ース基のみしか認識しない。

本発明は癌性の結腸直腸疾患による状態と癌性でない組
織学的に同様の状態を区別するにあたり、以下の工程す
なわち、 （Ｉ）患者の結腸直腸組織を血液型物質Ｈに結合する抗
体／マーカー接合体と接触させ、（Ｉ１）血液型物質Ｈ
を発現した結腸直腸組織に抗体を結合させ、 （Ｉｌｌ）　　結合された抗体について組織を検量し、
そして （ｌｖ）　　抗体が結合された組織中における結腸直腸
癌の存在、および抗体が結合されなかった組織中におけ
るかかる疾患の非存在について判定する、 ことからなる診断方法に関する。

組織学的には同様であるが癌性でない状態の組織には結
合しないならば、血液型物質Ｈと特徴的に結合するすべ
ての抗体が本発明方法で用いられうる。これらの基準に
合致する好ましい抗体はＩＢＤ−１２すなわちヒト上皮
抗原である血液型０物質Ｈに対して特異的なモノクロー
ナルハイプリドーマ抗体である。ここで用いられる「モ
ノクローナル抗体」なる用語にはモノクローナル抗体単
独またはモノクローナル抗体の混合物、単一特異性ポリ
クローナル（抗血清）抗体、のみならず、これらのいず
れかに由来する活性フラグメントも包含される。ＩＢＤ
−１２の特徴を示せば次のとおりである。

（Ｉ）　　組織培養物中によりＤ−１２ハイプリドーマ
細胞系によって分泌され、そして適当な抗血清を用いる
慣用の免疫化学的方法によってＩｇＭｋであることが示
された。

（２）腹水液中に存在する主要なイムノグロブリンはオ
クチルｏ　ニー　（０ｕａｈｔｅｒｌｏｎｙ　）分析に
よりＩｇＭであることが示された。

（３）　　ｐＨ８，０のα１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液中
でインキュベートした場合、セファロースに接合したタ
ンパク質Ａにより吸着されない。

（４）　　セファロース４Ｂからの溶離プロフィルがＩ
ｇＭと一致する。さらに、セファロース４Ｂで精製され
たｒＢＤ−１２抗体の電気泳動分析ではこのタンパク質
が９０％純粋なＩｇＭより大きいこと、およびジスルフ
イツド結合を還元すると、ＩｇＭモノマーが２個のＨ鎧
および２個のＬ釦からなっており約２００　ＫＤの分子
量を有すると仮定した場合にｌＸ１０’ダルトンの五量
体工ｇＭから予想される７５，０００ダルトンのｍｕ重
（Ｈ）鎖および２５，０００ダルトンの軽（Ｌ）　ｍが
生ずることが示される。

（５）　　エンザイム連結イムノソルベントアッセイ（
ＥＬＩ８Ａ　ｓ実施例に記載）で測定した種々のメタノ
ール固定腫瘍細胞系への結合特性を第１表に示す。

第１表 ４８８　ｎｍ 細胞系　　　での吸収 乳房細胞系　　　ＭＣＦ−７’［５ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１０，４５ ＨＢＬ−１０００７ Ｈｓ０５７８Ｔ　　　　　　α０ ＺＲ−７５−１α９ ＢＴ−２０１９ 正常な繊維芽　　ｗｒ−ｓａ　　　　　　　　ｏ、。

細胞系　　　　　ＨＥＬ　　　　　　　　　Ｑ、　０他
ｑ誼瘍細胞系　ＷｉＤｒ　　　　　　　　Ｏ，５５ＳＷ
−１３０，０ Ａ５４９　　　　　　　α１５ Ｇ−３６１０，０ 第１表に示されるように、ＩＢＤ−１２抗体は全部では
ないがいくつかの乳房腫瘍細胞系と反応し、正常な繊維
芽細胞系とは反応せず、そして結腸直腸細胞系ＷｉＤｒ
を含む他の腫瘍細胞系と反応する。

（６）　　この抗体はまた５ＨＰ−７７、ＳＷ−１５７
３，５ｌｃＬｕａｉ　６および５ｋＬｕｏｉ　１５のよ
うないくつかの肺癌細胞系とは反応するが、Ｃａ１ｕ　
１　、ＳｋＭＥ８１．５Ｗ−１２７１および９８１２の
ような他の肺癌細胞系とは反応しないことも見出された
。

（７）　　第１表に示される同じ細胞系から得られる生
きた固定されてない細胞と同様の反応性を示し、このこ
とはＩＢＤ１２抗体が細胞表面上に存在する抗原を認識
することを示している。

（８）　　ホルマリン固定されパラフィン包埋された患
者組織標本から得られた６ミクロン厚さの切片とＩＢＤ
−１２との反応性は実施例の前に詳細に記載されるイム
ノ堅ルオキシダーゼ染色法により判定された。

この方法はインビボでもインヒドロでも行うことができ
る。結合の存在は当業者に明らかなどの操作によって検
出してもよい。例えば、抗体は抗体／マーカー接合体を
形成させるために染料、酵素、放射性標識、蛍光性標識
、燐光性標識等で標識することができる。本発明を実施
するのに用いられる酵素標識は複合体形成について検査
するための酵素染色プロトコルを用いて使用されうる。

あるいはまた、結合された血液型物質Ｈ抗原を染色する
のに免疫学的試薬を使用することもできる。

工程（ＩＶ）により癌の存在または非存在を判定するこ
とは、見出される染色／非染色（結合／非結合）のそれ
ぞれのパターンの如何にある程度よるであろうことは当
業者に認識されよう。

従って、工程（Ｉｖ）の判定は結合／非結合に関連する
染色パターンの解釈次第でありうることが予想される。

本発明の方法により、生命を脅かすものでない炎症性疾
患に関連する細胞性変化と生命を脅かすかまたは進行し
て生命を脅かす可能性のある癌性変化とを医療従事者が
区別できる。「癌性」なる用語は以下癌性状態および前
癌性状態の両方を含めて簡略して示すために用いられる
。

有用な抗体の他の特徴にはアデノーマ性結腸直腸ポリー
プにおける形成異常に関連する抗原である血液型物質Ｈ
なそれらが認識しうろことが包含される。意図されるモ
ノクローナル抗体は真正の形成異常と生命を脅かすもの
でない再生性／修復性の上皮変化とを区別するのに使用
され得る。この抗体の結合はＨ物質の存在を示すもので
あり、そして結腸に広汎な上皮性結合が見いだされる場
合はそれは悪性または前癌性病変を示すものである。潰
瘍性大腸炎の早期ではしばしばかかる新生物性の変化に
似た細胞性変化が存在する。本発明方法で開示された抗
体を使用するととＫより、かかる良性の再生性変化を悪
性／前癌性変化と区別できる。

ＩＢＤ−１２を含む有用な抗体は当該技術上一般的に知
られた下記操作により生成されうる。即ち、 （ａ）　　マウスをある種の免疫原で免疫し、■）　免
疫されたマウスから肺臓を崗出しそして適当な培地中に
おける肺臓の懸濁液を調製し、（０）　　この懸濁され
た肺臓細胞を適当な細胞系からのマウスミエローマ細胞
と融合させ、（ｄ）　　非融合ミエローマ細胞の生長を
支持しない選択培地中で非融合肺臓細胞、非融合ミエロ
ーマ細胞および融合細胞の混合物を別々の容器中で希釈
しそしてすべての非融合細胞を死滅させるに十分な時間
培養し、 （ｅ）　　ハイプリドーマを含有するそれぞれの容器中
の上澄み液を免疫原に対する抗体が存在するか否か評価
し、そして （ｆ）　　所望の抗体を産生ずるハイプリドーマを選択
しそしてりｐ−ンさせる。

一旦所望のハイプリドーマが選択されクローンされると
、抗体は所望のハイプリドーマを適当な培地中でインビ
トロ培養するととＫより産生される。別の方法では、所
望のハイプリドーマをマウスに直接腹腔的注射して腹水
液を生成させることもできる。

ＩＢＤ−１２を分泌する細胞系はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ
　８７５１を有する。ＩＢＤ　−１２を生成させるため
のもつと詳しい操作を以下に述べる。

抗体分泌性の体細胞ハイブリッドの生成に用いられる一
般的方法はＧｅｆｔ＠ｒ氏他の８ｏｍａｔｉ。

Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｏｓ　３．３２１（Ｉ９７７）
およびＭａｒａｈａｋ−Ｒｏｔｈｇｔｅｉｎ氏他のＪｏ
ｕｒ、　ＩｍｍｕｎＯｓ　１２２．２４９１（Ｉ９７９
）に記載されている。簡単に言えば、Ｂａ１ｂ１０マウ
スを、完全フロインドアジュバントと１；１で混合した
ＭＣＦ　−７（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ　２２　）膜（
タンパク質１００μり）の総量α２ｆｌＩｌを用いて第
０日目ＫＭ腔内免疫した。このマウスを！５１日目日目
び第７３８目に不完全フロインドアジュバントと１＝１
で混合した同量の免疫原を用いてブースター処置した。

第１００日日に完全フロインドアシュパンＦと１：１”
？混合した免疫原１００μりを用いてマウスをブースタ
ー処置した。

４日後に、マウスの膵臓をとり出し、そして細胞系Ｐ３
ＸＡｇ８、変異体６５５　（ＡＴＣＣを託番号ＣＲＬ　
１５８０　；　Ｋａａｒｎｅｙ氏他のＪｏｕｒ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、１２３．１５４８〜１５５０（Ｉ９７９）
参照）の非分泌型ミエローマ細胞と融合させた。より詳
細には、マウスを殺したのちＲＰＭＩ　１６４０培地中
における肺臓−細胞懸濁液を調製した（リンパ球５Ｘ１
０７個／−）。

膵臓細胞１ｍｇＫ対し丸底プラスチック管中で５×１０
６個のミエローマ細胞Ｐ３ＸＡｇ８、変異体６５３を加
えた。この細胞混合物を７００）ｌで５分間室温で遠心
分離した。上澄み液を除去したのち、管を軽くたたいて
細胞を懸濁させそして３７℃の３０％Ｗ／Ｖポリエチレ
ングリフール１０００（ＰＫ（）　）　（Ｂａｋｅｒ　
Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、　）　０．５−を加えた。

ＰＥＧを含有する細胞を直ちに室温および７００Ｘ９で
五５分間遠心分離した。ＰＩＧ添加添加１俵細胞を穏や
かに再懸濁させそしてＲＰＭＩ　１　６　４　０の４、
０−を管舛加えた。次にこの懸濁液をＲＰＭ１１６４０
の４、５ｄおよびウマ血清ｔｓｙを含有する直径１００
１のペトリ皿に注いだ。これら細胞を３７℃で１８〜２
４時間インキエベーションした。

この細胞を１０％のウマ血清およびヒポキサンチン／ア
ミノプテリン／チミジン（ＨＡτ；それぞれ１０　　Ｍ
：　８Ｘ１０　　Ｍ：　ｔ６Ｘ１０”’Ｍ）を含有する
ＲＰＭＩ　１　６　４　０の６５−中に穏やかに再懸濁
および希釈した。

次に細胞を１ウ工ル当９２滴ずつ９６−ウェルのミクロ
滴定プレートにピはットで加えた（Ｉウェル当り肺臓細
胞約２Ｘ１０５個）。約１４日後に、コロニーを含有す
るウェルからの組織培養上澄み液を以下の操作に従いＭ
ＣＦ　−　７細胞への結合について検査した〇 操作（Ｉ）：エンザイム一連結イムノソルベントアッセ
イ（　ＢＬＩ８Ａ　）操作。ＭＯＩＰ−７細胞をほぼ集
密的となるまで９６−ウェルポリ塩化ビニルミクロ滴定
プレート（　Ｃｏ８ｔａｒカタログ属２　５　９６）中
で増殖させる。このミクロ滴定プレートはα１％ｗ／ｖ
ポリーＬーリジン（Ｓｉｇｍａ　Ｐ−０８７９）、分子
１１４０００、で被覆されており、そして細胞の増殖に
用いられるに先立ちＵＶ滅菌されたものである。これら
付着細胞はプレートを１００％メタノール中に浸漬させ
続いて風乾させることにより固定させた。固定されたＭ
ＣＦ−７細胞を含有するウェルにハイプリドーマ上澄み
液を加え、そしてこのプレートを４℃で１６〜２０時間
インキエベーションした。次にハイプリドーマ上澄み液
を吸い出して除来しそしてウェルを１％ｗ／ｖの血清ア
ルブミンを含有するＰＢ８緩衝液（ＦＢ８ＢＳＡ）で３
回洗浄した。

次にセイヨウワサビはルオキシダーゼに接合された抗−
マウスＩｇ（）抗体（　ＧＡＭＨＲＰ　）　（　Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｏｌｅａｒ　Ｃａｒｐ．　）のＰ
ＢＳＢＳＡ中Ｋ　１　：　５００で希釈されたもの１０
０μｔをウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーシ
ョンした。次にＧＡＭＨＲＰを吸い出して除去し、ウェ
ルをＰＢ８ＢＳＡ　１００　ＰＬで１回そして蒸留水で
２回洗った。結合されたＧＡＭＨＲＰの存在は０．０１
５％の過酸化水素を含有するクエン酸塩−燐酸塩緩衝液
（０，００９Ｍクエン酸、０．０３Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４）
中の０．２％ｗ／ｖ　ｏ−フェニレンジアミン１００μ
ｔ　ｔＨＲＰの基質としてウェルに加えることにより判
定された。ＨＲＰはその基質と組み合わさると黄色生成
物を生ずる。

生成物の発色は室温で１０〜２０分間行われた。

４、５　Ｍ　Ｈ２ＳＯ４１００μｔの添加により酵素反
応を終止させた。生成する反応生成物は４８８　ｎｍで
の光学濃度を計測することにより測定された。

ウェル中に黄色が存在することは固定されたＭＣＦ−７
細胞に結合できかつＧＡＭＨＲＰ試薬によりａｔｔａさ
れうる抗体がハイプリドーマ上澄み液中に存在すること
を示す。

操作（２）：軟質プラスチック製ミクロ滴定プレートの
ウェルにハイプリドーマ上澄み液を加えた。

このミクロ滴定プレートは使用に先立ちＢ８Ａで被覆さ
れたものである。次にｐＨ６，８の２０　ｍＭトリスマ
レエート１００μｔおよびＭＣＦ　−７膜（タンパク質
的７μｇ／５ｄ）１０μｔを各ウェルに加えた。ハイプ
リドーマ上澄み液をＭＣＦ　−７膜と３０℃ジョンした
。次に５　ｍＭ　ＭｎＣｌ２とＣＭＰ（’Ｈ）ＮＡＮＡ
（ＮＥＮ　Ｃｏｒｐ、　）との混合物１０μｔおよび脱
シアリル化され、脱ガラクトシル化されたフェチュイン
（タンパク質２５ｔｑ／＋ａｇ）１０μｔ、あるいは５
鮨ＭｎＣＬ２およびＵＤＰ（’Ｈ）Ｇａｌ（ＮＥＮ　Ｃ
ｏｒｐ、　）の混合物１０μｔおよｄ脱シアリル化され
、説ガラクトシル化された７エチエイン（タンパク質２
５■／、０１０μＬを各ウェルに加えた。フェチュイン
（ｆｅ−ｔｕｉｎ　）でないトリチウム標識されたヌク
レオチド糖を含有する対照プレートも同様に操作した。

プレートを３７℃で２〜２ｉ時間インキエベートした。

次に各ウェルに氷冷ＴＣＡを加えた。このプレートを４
℃で１０分間貯蔵し、次に１０分間遠心分離した。吸引
後、ミクロ滴定ウェルをプレートから切断しそして慣用
の液体シンチレーション計測操作によりｓＨ−糖を計測
した。

操作（Ｉ）により測定してＭＣＦ　−７細胞に結合して
おり、操作（２）により測定してヌクレオチド−糖から
のＭＣＦ　−７膜に関連する炭水化物部分への糖の移行
を阻止しており、そして操作（２）ｋより測定してＭＣ
Ｆ　−７膜と関連するグリフジルトランスフェラーゼ酵
素の活性を阻害しないＸｇＣｋを分泌するハイブリッド
を含有するウェル中の細胞を増殖させそして限界希釈ク
ローニングにかけた。

限界希釈クローニング後、ＭＣＦ−７反応性抗体を含有
する腹水液を下記のようにしてＢａ１ｂ／ａマウス中に
生成させた。マウスはｌＸ１０’個のクローンされたＩ
ＢＤ　１２ハイプリドーマ細胞を腹腔内接櫨する２週間
前にプリスタン（Ｐｒｉａｔａｎｅ）■（Ａｌｄｒｉｏ
ｈ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、　）　Ｑ、５　ｔｄを腹腔内（
ｉｐ）注射することにより初回免疫した。２〜６週間後
に、注射器で腹水液をとり出した。ＭＣＦ　−７反応性
抗体の存在について腹水液を櫨々に希釈して前記操作（
Ｉ）を用いて判定した。最大力価（Ｉ：１０．０００〜
１：ｓｏ、ｏｏｏ）を示す検体を集め、そして４℃で５
０％硫酸アンモニウムを用いて塩析させた。ＩＢＤ　−
１２抗体を含有する沈殿を遠心分離により集めそして蒸
留水中に溶解させた。

次にこの物質をセファｏ　−ス４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａ
ｏｉａ　）上のダル濾過クロマトグラフィーにかけそし
てＭＣＦ−７細胞に対する反応性を含有するピークを集
めて□部分精製されたＩＢＤ　１２抗体を得た。

実施例　１〜７ インビトロにおけるｒＢＤ　−１２の種々の組織との反
応性を測定するために、ホルマリンで固定され、パラフ
ィンで包埋された組織切片を用いた。イムノペルオキシ
ダーゼ染色法を下記プロトコル（ト）〜（Ｊ）　Ｋ従い
実施した、すなわち、囚　結腸直腸組織検体からの、１
０％ホルマリにより固定され、パラフィンにより包埋さ
れた６ミクロンの切片を卓上ミクロトームを用いて調製
する。切片をアルプさンで被覆したスライド上にとり、
５６℃で２〜３時間ベークした（　ｂａｋｅｄ　）。

（ト）切片を１００％キシレン中３０分間、そして次に
１００％エタノール中５分間脱パラフィンさせる。内因
性Ｒルオキシドを１００％メタノール中０．６％過酸化
水素と３０分間インキュベーションすることによりクエ
ンチさせる〇（Ｃ）　　これら切片をＰＢＳ中ですすぎ
そして１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ　（ＰＢＳ：Ｂ８Ａ
　）中の１０％正常ヤギ血清でブロックする。

（至）　これらスライドを拭いて乾かし、そして組織切
片の上からＰＢＳ　：　Ｂ８Ａ中の２００〜５００μ９
７ｙｄを加える。次に切片を湿度調節した室内で室温で
９０〜１２０分間インキュベーションする。各組織切片
試料をクラスが一致するＩｇＧを用いて検査し、そして
正常な食塩水対照も操作する。

（ト））組織切片をＰＢＳ中で充分に洗浄する。この洗
浄は特異的なＡｂ検体が対照スライドと分離して保持さ
れるように別々の染色トレー中で行われる。

（ト）　ウサギ抗−マウスＩｇＭからなる第２の抗血清
（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｓ　）をＰＢＳ　：　ＢＡＡ中１
＝１００の希釈度ですべての組織切片に添加する。次に
これを湿度調節された室内で室温で３０分間インキュベ
ーションする。

（（））　　切片をＰＢＳ　１３回洗い、続いてＰＢＳ
　！　ＢｓＡ中１＝２００で希釈したヤギ抗−ウサギＩ
ｇ（）　：ビオチンとインキュベーションする。ヤギ抗
−ウサギＩｇＧ　：ビオチンはＶｅｏｔｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓからのＡＢＣイムノはルオキシダーゼ
キットの一部分である。

（６）　切片をＰＢＳで３回洗い、そしてＰＢＳ　Ｓ　
ＢＡＡ中１：１００に希釈されたアビジン−ビオチン−
セイヨウワサビＲルオキシダーゼ複合体（前記ＡＢＣキ
ットの一部分）とインキュイージョンする。

インキュベーションは室温で３０分間行われる。

（Ｉ）　　ＰＢＳで５回洗浄したのち、切片Ｋ　ＰＢＳ
中４００μり／−濃度のジアミノに７ジジンな加える口
ｇ）約１０分間インキエペーションしたのち、切片をＰ
ＢＳで１回そして蒸留水で２回洗う。次にこれらを二重
強度のギル（ｇｉｌｌ　）マドキシリン（Ｌｅｒｎｅｒ
　Ｌａｂｓ　）中で２分間対比染色し、水洗し、０．０
３Ｍ酢酸中に浸漬し、再び水洗し、０．０１％水酸化ア
ンモニウム中で発色させ、水洗し、そして終りに９５％
エタノール、１００％エタノールおよび１００％キシレ
ンによって脱水する。次に切片を／ぐ−マウント（Ｐｄ
ｒｍｏｕｎｔ　）■で処理し、そして切片にカバーグラ
スをのせる。得られるスライドを視認により検査する。

組織切片当り４〜１０μりのＩＢＤ−１２抗体を用いる
と、結腸癌患者からの検体ではｎ鵜細胞が強く染色され
た。帯赤褐色を検出し、そしてこれは種々の中間体を介
してＩＢＤ　−１２に結合されたセイヨウワサビはルオ
キシダーゼの反応生成物が存在するためとされる。核を
青色に染めるヘマトキシリンは帯赤褐色沈殿との対比を
＾めるための対比染色として用いられた。抗体で染まる
物質は分泌され、細胞表面に結合されそして細胞質性の
ものであると思われる。

長期持続性潰瘍性大腸炎の患者から得られる全結腸摘出
標本を用いて下記の結果が得られた。

（Ｉ）段階、程度または組織学的種類に関わりなくすべ
ての癌が、ある場合には不連続性ではあるが、陽性に染
色される。

（２）すべての高度の形成異常では、ある場合には不連
続性ではあるが、拡散性パターンで陽性染色される。

（３）いくつかの低度形成異常では、これも拡散性パタ
ーンで陽性染色される。

（４）　　形成異常を伴わない慢性の休止型大腸炎では
何ら染色なし。

（５′）急性の炎症を起した上皮では何ら染色なし。

（６）　　関係のない粘膜（炎症性腸疾患のない結腸部
分）には染色なし。

（力　再生性腺の１部で、または潰瘍後の回復／修復に
おける上皮再形成性潰瘍の端部での個々の細胞または少
数の隣接細胞の病巣染色。

前記（Ｉ）〜（７）の染色パターンは、医療従事者によ
り（Ｉ）、（２）および（３）は癌性状態を示し、（４
）〜（７）は非癌性状態を示すと解釈された。

実施例　８ 癌性状態と非癌性状態とを区別するために本発明方法を
以下のとおりインビボで実施することができる。

蛍光性または燐光性標識された抗体を適当な生理学的緩
衝液中の空にした結腸中に導入できる。Ｈ物質を発現す
る組織に抗体を結合せしめるに充分な時間インキエベー
ションしたのち、結合されなかった抗体はＰＢＳのよう
な生理学的緩衝液で浣腸することにより洗い去ることが
できる。結腸上皮へのまたは肛門／直腸上皮への標識さ
れた抗体の結合は、抗体が存在するか否か判定するため
に抗体に結合された蛍光性標識または燐光性標識を励起
させるための光源を用いる蛍光または可視光線結腸内視
術により判定されうる。もし標識された抗体が存在する
場合は、医療従事者が観察できる光線シグナルを生じよ
う。標識された抗体が結合されていることが判明したす
べての組織を次にバイオプシーし、そして実施例１〜７
で記載されたような操作によりインビトロで検査してＨ
物質が不適切に存在することを確認できた。かかる方向
性をもったバイオプシーはランダムな組織バイオプシー
を計測するものである現在の操作と対照的に関連性を有
する組織検体について評価する機会を高めることになろ
う。

本発明の態様を要約して示せば以下のとおりである。

１）癌性結腸直腸疾患による状態と癌性でない組織学的
に同様の状態を区別するにあたり、以下の工程すなわち
、 （Ｉ）　　患者の結腸直腸組織を血液型物質Ｈに結合す
る抗体／マーカー接合体と接触させ、（Ｉ）　　血液型
物質Ｈを発現した結腸直腸組織に抗体を結合させ、 ０１１）結合された抗体について組織を検査し、そして （ｌｖ）　　抗体が結合された組織中における結腸直腸
癌の存在、および抗体が結合されなかった組織中におけ
るかかる疾患の非存在について判定する、 ことからなる方法。

２）抗体がＩＢＤ　−１２であることからなる前記１項
記載の方法。

５）インビボで行われることからなる前記１項記載の方
法。

４）インビボで行われることからなる前記２項記載の方
法。

５）エクスビボで行われることからなる前記１項記載の
方法。

６）エクスビボで行われることからなる前記２項記載の
方法。

７）マーカーが染料、酵素、放射性標識、蛍光性標識、
および燐光性標識からなる群から選択されることからな
る前記１〜６項のいずれかに記載の方法。

８）マーカーが染料であることからなる前記７項記載の
方法。

９）マーカーが酵素であることからなる前記７項記載の
方法。

１０）マーカーが放射性標識であることからなる前記７
項記載の方法。

１１）マーカーが蛍光性標識であることからなる前記７
項記載の方法。

１２）マーカーが燐光性標識であることからなる前記７
項記載の方法。

１３）結合された血液型物質Ｈを染色するのに免疫学的
試薬を使用することからなる前記１〜７項のいずれかに
記載の方法。

特許出願人　　イー・アイ・デュポン・ド４ネモアース
・アンド・コンパニー 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 癌性結腸直腸疾患による状態と癌性でない組織学的に同
   様の状態を区別するにあたり、以下の工程すなわち、 （ I ）患者の結腸直腸組織を血液型物質Ｈに結合する
   抗体／マーカー接合体と接触させ、 （II）血液型物質Ｈを発現した結腸直腸組織に抗体を結
   合させ、 （III）結合された抗体について組織を検査し、そして （IV）抗体が結合された組織中における結腸直腸癌の存
   在、および抗体が結合されなかつた組織中におけるかか
   る疾患の非存在について判定する、 ことからなる方法。