CN106868104A - 肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒 - Google Patents

肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有以下三类：选自TTF1、NSE、ASC中的至少两种的肺癌细胞标志基因mRNA，选自EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19、KRT20中的至少一种的上皮细胞标志基因mRNA，选自SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1、SERPINE1中的至少一种的间质细胞标志基因mRNA。本发明在各种类型癌症通用CTCs上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因的基础上增加了肺癌细胞标志基因的检测，避免了假阳性结果，进一步提高了检测结果的准确度和可信度。

Description

肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒。
背景技术
肺癌是严重威胁人类健康的疾病，其发病率和死亡率均居各类恶性肿瘤之首。尽管随着手术、化疗、放疗及生物治疗的不断进步，对肺癌尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗已经有了长足的进步，但是由于许多患者就诊时已经发生了不同程度的转移，导致目前非小细胞肺癌5年生存率仍较低。
肿瘤的侵袭和转移是指肿瘤细胞从原发部位脱落，通过血液、淋巴及直接浸润等方式在不连续的靶部位生长出具有相同性质的肿瘤的过程。其中入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)，CTC通过血液传播转移到身体的其他器官，是导致肿瘤患者死亡的主要原因。
上皮-间质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)是指在某种生理和病理状态下出现的上皮细胞向间质细胞转化的现象。EMT以上皮细胞表型的缺失和间充质细胞表型的出现为主要特征。EMT过程一方面可以改变肿瘤细胞的特性是肿瘤细胞间连接分子表达缺失，极性丧失黏附能力减弱运动性提高，使肿瘤细胞本身的侵袭迁移能力增强；另一方面，EMT还可以通过改变肿瘤生长、侵袭和转移以及血管形成等微环境，增强肿瘤侵袭和转移能力。因此，如何能早发现肺癌，并对其侵袭和转移加以有效的控制就成为肺癌治疗的一个迫切需要解决的问题。
虽然CTCs检测在肺癌中得到较广泛的应用，通过美国FDA批准进行临床应用的CellSearch检测系统也可用于肺癌患者外周血中CTCs的检测和计数，但是CellSearch检测系统是以上皮细胞标志物为靶点对CTCs进行计数，因此无法检测到丢失上皮抗原的CTCs。与其他癌症类型一样，目前肺癌患者CTCs的鉴定和分型主要依赖于通用CTCs上皮和间质型标志物分子的检测，由于外周血中可能存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞，且采血可能造成正常上皮细胞污染血样，加上一些上皮和间质型标志物在不同癌症类型中表达存在差异，从而会导致一些假阳性和假阴性的检测结果。目前，国内外均没有稳定的用于肺癌患者CTCs鉴定和分型的产品。因此，急需一种能提高现有CTCs检测和分型准确度的检测方法，实现肺癌患者CTCs的精确鉴定与分型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高和精确度高的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有以下三类：选自TTF1、NSE、ASC中的至少两种的肺癌细胞标志基因mRNA，选自EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19、KRT20中的至少一种的上皮细胞标志基因mRNA，选自SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1、SERPINE1中的至少一种的间质细胞标志基因mRNA；其中，
所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；
每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
在其中一个实施例中，所述标志基因mRNA还包括有针对白细胞标志基因的mRNA的一类，所述白细胞标志mRNA为CD45。使用白细胞标志基因，有助于进一步区分白细胞和肿瘤细胞，排除白细胞对检测结果的干扰，保证结果的准确性。
在其中一个实施例中，所述肺癌细胞标志基因的捕获探针中：针对TTF1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的2条或2条以上，针对NSE基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的2条或2条以上，针对ASC基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的2条或2条以上；针对肺癌细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.151；所述肺癌细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ IDNO.155，P4序列为SEQ ID NO.159。
在其中一个实施例中，所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的2条或2条以上，针对KRT5基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.50中的2条或2条以上，针对KRT7基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60中的2条或2条以上，针对KRT18基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70中的2条或2条以上，针对KRT19基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上，针对KRT20基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.152；所述上皮细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.156，P4序列为SEQ ID NO.160。
在其中一个实施例中，所述间质细胞标志基因的捕获探针中：针对SNAI2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100中的2条或2条以上，针对FOXC2基因特异性序列P1选自SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.110中的2条或2条以上，针对TWIST1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.111～SEQ ID NO.120中的2条或2条以上，针对ZEB1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.130中的2条或2条以上，针对SERPINE1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.131～SEQ ID NO.140中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.153；所述间质细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.157，P4序列为SEQ ID NO.161。
在其中一个实施例中，还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对CD45基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.141～SEQ IDNO.150中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.154；所述白细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.158，P4序列为SEQ ID NO.162。
在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5－10个T。
在其中一个实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明在各种类型癌症通用CTCs上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因的基础上增加了肺癌细胞标志基因的检测，避免了血液中非肿瘤上皮细胞及采样过程引入正常上皮细胞等因素造成的假阳性结果，确保检测到上皮细胞标志基因和/或间质细胞标志基因的细胞为肺癌循环肿瘤细胞，进一步提高了检测结果的准确度和可信度。
(2)本发明所选择的肺癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的。本发明提供的肺癌细胞标志基因可以联合上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因对样品进行检测。本发明标志基因的选取，除了能实现单个标志基因的检测外，更与其它标志基因一起使用，从而能够最全面地检测出循环体液中的肺癌CTC，并区分其细胞类型，解决了循环肿瘤细胞个体之间由于某些标志基因表达水平的差异而造成假阴性，极大地提高检测的灵敏度。
(3)本发明所述鉴定方法采用多重RNA探针，能够同时标记多种肺癌CTC特异性基因，并将其从CTC中鉴别出来，并且将其分型为上皮型肺癌CTC、上皮-间质混合型肺癌CTC及间质型肺癌CTC，降低肺癌CTC在进入外周血循环的过程中因缺失部分特异性基因而导致的假阳性结果。本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
(4)RNA原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的RNA原位杂交方法，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的mRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏度。
附图说明
图1是本发明阳性肺癌CTC鉴定结果示意图；
图2是本发明阳性肺癌CTC分型结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一种肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定方法，主要包括以下步骤：
(1)得到去除红细胞后的生物体液样本；
(2)过滤，在滤膜上富集肺癌循环肿瘤细胞，通过透化处理，消化细胞，使mRNA暴露；
(3)检测肺癌细胞标志基因mRNA、和/或上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，所述肺癌细胞标志基因选自：TTF1、NSE、ASC中的两个或两个以上；所述上皮细胞标志基因选自：EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19、KRT20中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1、SERPINE1中的一个或一个以上。
所述检测肺癌细胞标志基因mRNA、和/或上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，包括以下步骤：
(3.1)每种标志基因的捕获探针特异性序列P1与对应的目标mRNA序列结合；每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.2)捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4分别为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.3)所述扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；
(3.4)通过荧光检测仪检测。
所述检测肺癌细胞标志基因mRNA、和/或上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，还可以包括以下步骤：
(3.1)每种标志基因的捕获探针的特异性序列P1与对应的目标mRNA序列特异性结合；每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.2)捕获探针的P2序列与带有荧光基团标记的扩增探针的P3序列结合，从而实现目标mRNA信号的放大；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.3)通过荧光检测仪检测。
实施例1
本实施例所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，有两种类型，具有标记探针的与不具有标记探针。
其中，具有标记探针的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒A，主要包括有：
一、捕获探针
捕获探针由三部分组成，5’端至3’依次是与对应的标志基因的mRNA互补配对的序列P1，间隔臂序列，与对应的扩增探针P3序列互补配对的P2序列，同一类别的标志基因其捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T。每个标志基因分别设计10条捕获探针，以提高检测的特异性。(使用时，针对每种目标基因，选择2条或2条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例8)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的标志基因的捕获探针见表1、不同类型的标志基因的捕获探针的P2序列见表2。
表1 目标基因捕获探针的P1序列
表2 标志基因捕获探针的P2序列
二、扩增探针
扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分组成，5’端是能与捕获探针P2互补配对的P3序列，间隔臂序列，3’端是能与标记探针互补配对的P4序列(如不运用标记探针检测时，则P4序列的3’端修饰有荧光基团，如试剂盒B)，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增探针间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T)。
标志基因的扩增探针的P3序列见表3。所述P4序列为序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列，本实施例P4序列优选的碱基组成见表4。
表3 目标基因的扩增探针的P3序列
表4 目标基因的扩增探针的P4序列
三、标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针P4序列互补结合的P5序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。(当检测体系中使用标记探针时，扩增探针的P4序列3’端不带有荧光基团标记，而由标记探针的3’端带有荧光基团标记，如试剂盒A)标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 750和Alexa Fluor 488，标记探针的FL1、FL2、FL3和FL4选择的荧光基团互不相同，且所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的标志基因。本实施例标记探针的荧光基团标记优选如表5所示。
表5 标记探针
本实施例所述不具有标记探针的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒B，主要包括有：
一、捕获探针：与上述具有标记探针的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒中的捕获探针相同。
二、扩增探针：与上述具有标记探针的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒中的捕获探针的序列相同，但P4序列的3’端修饰有荧光基团。
所述P4序列的3’端修饰有荧光基团，具体为：针对肺癌细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL1，上皮细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL2，间质细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL3，白细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL4，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，其中FL1、FL2和FL3、FL4对应的荧光基团互不相同，且所对应的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的标志基因。标志基因扩增探针的P4序列的3’端的荧光基团标记优选如表6所示。
表6 标志基因的染料标记
实施例2运用实施例1中的试剂盒A对肺癌患者外周血循环肿瘤细胞进行检测
所述各种溶液的配方如下：
本实施例中的探针混合液、扩增混合液、显色混合液均使用实施例1具有标记探针的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒A相应基因列表中的全部探针。
一、样本预处理，将肺癌循环肿瘤细胞过滤至滤膜上
1.在样本保存管中使用保存液保存血液样本，600×g水平离心5min，弃上清，去除红细胞。
2.加入4mL PBS和1ml固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。
3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4ml PBS，洗涤管壁后抽滤液体。
4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μl 4％甲醛溶液，室温固定1h。
5.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。
二、透化处理
1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。
2.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
三、消化细胞，暴露mRNA，使其与探针杂交
1.配制相应浓度的消化酶工作液：
试剂组分 每个样本用量
消化酶 1.25μl
PBS 48.75μl
总体积 50μl
2.消化酶工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。
4.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。
四、探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合
1.探针缓冲液、扩增缓冲液和显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制探针工作液：
试剂组分 每个样本用量
探针混合液 8μl
探针缓冲液(40℃预热) 42μl
总体积 50.0μl
涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
五、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大
1.配制扩增工作液：
试剂组分 每个样本用量
扩增混合液 2μl
扩增缓冲液(40℃预热) 48μl
总体积 50.0μl
涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
六、显色，荧光标记目标信号
1.配制RI显色工作液
试剂组分 每个样本用量
显色混合液 2μl
显色缓冲液(40℃预热) 48μl
总体积 50.0μl
避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
七、荧光显微镜观察
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。
2.通过20倍物镜计数CTC异性核数量。
3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。
5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。显微镜使用通道如下：
表7 荧光基团的激发波长和发射波长
八、检测结果判断及分析
1.阳性肺癌CTC鉴定标准
在滤膜上，富集有少量的肺癌循环肿瘤细胞以及残留的白细胞，肺癌循环肿瘤细胞阳性的判定标准为(参见图1)：
1)具有肺癌细胞标识物和循环肿瘤细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Cy5通道和/或Cy3通道和/或Alexa Fluor 488通道下能够显示紫色荧光信号点和/或红色荧光信号点和/或绿色荧光信号点。
2)不具有白细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Alexa Fluor 750通道下不显示荧光信号点。
3)细胞核DAPI染色阳性。
4)肺癌循环肿瘤细胞核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。白细胞大小与滤膜孔大小相近。
2.检测细胞分型标准：
本试剂盒采用多重RNA探针，分别针对多种肺癌CTCs特异性基因，通过不同颜色荧光信号，可进一步将肺癌CTCs分型。其中Ⅰ型(上皮型)CTCs携带Cy5荧光基团(显示为紫色荧光信号点)和Cy3荧光基团(显示为红色荧光信号点)，Ⅲ型(间质型)CTCs携带Cy5荧光基团(显示为紫色荧光信号点)和Alexa Fluor 488荧光基团(显示为绿色荧光信号点)，同时表达Ⅰ型和Ⅲ型特异性基因的CTCs为Ⅱ型(上皮-间质混合型，同时显示紫色荧光信号点、红色荧光及绿色荧光信号点)。参见图2。肺癌CTCs分型标准如下：
表8 阳性肺癌CTCs分型标准
3.使用上述检测方法，对20例肺癌患者外周血样本进行检测和观察，具体结果为(表中数据为CTC数目)：
表9 样本检测结果
实施例3运用实施例1中的试剂盒A对肺癌细胞株进行检测
一、细胞株的选择
本发明试剂盒肺癌细胞标志基因选自：TTF1、NSE、ASC中的两个或两个以上；上皮细胞标志基因选自：EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19、KRT20中的一个或一个以上；间质细胞标志基因选自：SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1、SERPINE1中的一个或一个以上；白细胞标志基因为CD45。本发明选用的肺癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和白细胞标志基因中的各种标志基因，是发明人经过大量实验和统计分析筛选得出的在肺癌CTCs上特异表达的基因，对肺癌细胞的检测具有很好的特异性和准确性。
本实施例选用上皮-间质混合型肺癌细胞株NCI-H1975和HCC827进行实验，阴性对照细胞株选用CCRF-HSB-2淋巴母细胞，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个NCI-H1975细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号21-25；取约1000个HCC827(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号26-30；取约1000个CCRF-HSB-2淋巴母细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号31-35。
二、样本检测
运用实施例1中的试剂盒A的全部探针(包括所有的标志基因，肺癌细胞标志基因TTF1、NSE、ASC；上皮细胞标志基因EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19、KRT20；间质细胞标志基因SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1、SERPINE1)，白细胞标志基因CD45，按实施例2所述检测过程和方法对样本21-35进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下：
表10 样本检测结果
通过比较样本中三种细胞株的检测结果可知，本发明试剂盒能实现肺癌细胞相关标志基因的检测，对样本中肺癌细胞株NCI-H1975和HCC827、淋巴母细胞CCRF-HSB-2的检出率均为100％，其中，肺癌标志基因仅在肺癌细胞株中检测到mRNA表达，而在淋巴母细胞中没有表达，由此可见，本发明试剂盒能够检出肺癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和白细胞标志基因mRNA表达情况，同时，肺癌标志基因的检出具有癌种特异性，也就是说，肺癌标志基因的检出，能有效区分样本中的肺癌细胞和白细胞，确保检测到上皮细胞标志基因和/或间质细胞标志基因的细胞为肺癌循环肿瘤细胞，进一步提高了检测结果的准确度和可信度。
实施例4不同细胞种类标志基因的选择
一、试剂盒制备的设计(目标检测标志基因数量和种类的选择)
本发明试剂盒肺癌细胞标志基因选自：TTF1、NSE、ASC，根据实验组做相应的选择；上皮细胞标志基因为：EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19和KRT20，间质细胞标志基因为：SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1和SERPINE1。
肺癌细胞标志基因的选择参见实施组1-3，分别选取一种、两种及三种的标志基因，对比其检测效果，而上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因使用全部的目标基因以及白细胞标志基因的全部目标基因，具体设计如表11所示。
本实施例每组相应标志基因的所述捕获探针、扩增探针与标记探针的组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒A和实施例2所述。
表11 肺癌细胞标志基因基因的选择
二、样本检测
本实施例选用上皮-间质混合型肺癌细胞株NCI-H1975、HCC827和PC9进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个NCI-H1975细胞(通过细胞计数器确定)混合均匀后将样本均分为5份，编号36-40；取约1000个HCC827细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号41-45；取约1000个PC9细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号46-50。
采用表11标志基因制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本36-50进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个肺癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下(表12中数据为细胞数目，表13中数据为平均荧光点数)：
表12 使用不同数量肺癌细胞标志基因检测效果的比较
表13 使用不同数量肺癌细胞标志基因平均荧光信号点数检测效果的比较
对比实验组1-3的实验结果可知，当肺癌细胞标志基因分别选取一种、两种及三种，上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因使用全部基因时，上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因检测结果稳定，而肺癌细胞标志基因检测结果有差异：由于不同肺癌细胞标志基因表达的差异，只选用1种标志基因进行检测时，会造成一定程度的漏检，使用2种或2种以上时，检测效果达到稳定，且紫色荧光信号点从实验组1到实验组3随着肺癌细胞标志基因数量的增加而逐渐增加，检测效果更优，其中，选用全部的肺癌细胞标记基因时，检测信号最强最稳定，效果最优，同时，肺癌细胞标志基因的增加并不影响上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因的检测结果，由此可知，本发明试剂盒所设计的各种类型探针之间基本不存在非特异性结合，特异性好。上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因基因数量的选择实验结果与肺癌细胞标志基因一致。其它针对使用不同数量和种类的肺癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例5试剂盒目标检测标志基因的选择
一、试剂盒制备的设计(目标检测标志基因数量和种类的选择)
本发明试剂盒肺癌细胞标志基因选自：TTF1、NSE、ASC；上皮细胞标志基因选自：EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19、KRT20，间质细胞标志基因选自：SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1、SERPINE1。
设计实验组4--7，分别选取三种、六种、九种及十四种的标志基因，对比其检测效果，白细胞使用标志基因CD45，具体设计如表14所示。
本实施例每组相应标志基因的所述捕获探针、扩增探针与标记探针的组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒A和实施例2所述。
表14 试剂盒标志基因基因的选择
二、样本检测
本实施例选用上皮-间质混合型肺癌细胞株NCI-H1975、HCC827和PC9进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个NCI-H1975细胞(通过细胞计数器确定)混合均匀后将样本均分为5份，编号51-55；取约1000个HCC827细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号56-60；取约1000个PC9细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号61-65。
采用表11标志基因制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本51-65进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个肺癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下(表15中数据为细胞数目，表16中数据为平均荧光点数)：
表15 试剂盒使用不同数量标志基因检测效果的比较
表16 试剂盒使用不同数量标志基因平均荧光信号点数检测效果的比较
对比实验组4-7的检测结果可知，使用3种标志基因时会由于不同肺癌细胞上基因的差异表达而照成假阴性的结果，使用6种及6种以上标志基因进行检测时效果达到稳定，且细胞上3种细胞种类标志基因对应的荧光信号点从实验组4到实验组7随着标志基因数量的增加而逐渐增加，检测效果更优，其中，选用全部的标记基因时，检测信号最强最稳定，效果最优。其它针对使用不同数量和种类的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例6不同间隔臂的试剂盒对肺癌循环肿瘤细胞mRNA原位杂交的检测
一、试剂盒制备的设计(间隔臂的选择)
以肺癌细胞标志基因(共3个基因)为例，分别选用不同的间隔臂，具体设计如表17所示。其余捕获探针、扩增探针与标记探针的碱基组成以及所用数量全部与实施例1试剂盒A相同、不同之处仅在于间隔臂不同，检测方法如实施例2所述。对应的捕获探针、扩增探针的间隔臂相同。
表17 间隔臂及其长度
间隔臂种类 长度 实验组
poly(dT) 5 8
poly(dA) 8 9
(CH2)n 15 10
poly(TTG) 3 11
二、样本检测
本实施例选用上皮-间质混合型肺癌细胞株NCI-H1975、HCC827和PC9进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个NCI-H1975细胞(通过细胞计数器确定)混合均匀后将样本均分为5份，编号66-70；取约1000个HCC827细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号71-75；取约1000个PC9细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号76-80。
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本66-80进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，具体检测结果如下(表中数据为细胞数目)：
表18 肺癌细胞标志基因检测探针使用不同间隔臂的实验结果比较
经过对比4个实验的检测结果可知，4组实验设计的检测效果没有差异，因此，这4种间隔臂的设计是等效的。上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因以及白细胞标志基因检测探针使用不同的间隔壁检测结果与肺癌细胞标志基因一致，具体数据省略。其它针对捕获探针、扩增探针和标记探针内部不同的间隔序列的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例7：标记探针的运用
一、试剂盒制备的设计(信号检测组分)
本发明试剂盒信号检测组分有两种选择，1)扩增探针P4序列的3’端修饰有荧光基团；2)扩增探针3’端P4序列与标记探针的P5序列通过碱基互补配对结合，同时标记探针的3’端带有荧光基团。这两种信号检测组分均能实现信号放大，检测到正常信号。其中，使用荧光基团修饰的标记探针，检测信号更加稳定，效果较优。
以所述试剂盒的检测上皮细胞标志基因的两种信号检测组分为例，具体设计如表19所示。即所述试剂盒的组成为：
实验组12：相应捕获探针和扩增探针组成和数量同实施例1试剂盒A，但扩增探针3’端修饰有荧光基团Cy3；没有标记探针；
实验组13：相应捕获探针、扩增探针和标记探针组成和数量同实施例1试剂盒A，扩增探针不具有荧光基团，但配置有标记探针，标记探针的P5序列3’端修饰有荧光基团Cy3。
表19 信号检测组分
二、样本检测
本实施例选用上皮-间质混合型肺癌细胞株NCI-H1975、HCC827和PC9进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个NCI-H1975细胞(通过细胞计数器确定)混合均匀后将样本均分为5份，编号81-85；取约1000个HCC827细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号86-90；取约1000个PC9细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号91-95。
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本81-95进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个肺癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下(表20中数据为细胞数目，表21中数据为平均荧光点数)：
表20 上皮细胞标志基因使用不同信号检测探针的检测结果比较
表21 上皮细胞标志基因使用不同信号检测探针平均荧光点数检测结果比较
将两组设计的检测结果进行统计学分析，证明两组设计对样本中细胞数目的检测结果没有差异，因此，这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。其中，使用荧光基团修饰的标记探针(即实验组13)，其检测到上皮细胞标志基因荧光点数更多，信号更加稳定，效果较优。其他针对肺癌细胞标志基因和间质细胞标志基因标记探针的运用检测结果与上皮细胞标志基因检测结果一致，具体数据省略。
实施例8标志基因的捕获探针的数量选择
一、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
本发明肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，针对不同细胞种类的每个标志基因分别设计了10条捕获探针，且同一细胞种类的标志基因的捕获探针中的P2序列相同。在实际使用时，可以针对每种标志基因，选择对应的至少2条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都能达到需求。
为考察捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，以上皮细胞标志基因EpCAM的捕获探针数量选择为例，参见实验组14-16，分别选取1条、2条及10条的捕获探针，对比其检测效果。在该对比实验中，上皮细胞标志基因仅使用EpCAM(参见表22)，而肺癌细胞标志基因和间质细胞标志基因使用如实施例1试剂盒A所列出的全部的基因和探针以及白细胞标志基因CD45及其对应的检测探针。
表22 上皮细胞标志基因EpCAM的捕获探针的选择
二、样本检测
本实施例选用上皮-间质混合型肺癌细胞株NCI-H1975、HCC827和PC9进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。取约1000个NCI-H1975细胞(通过细胞计数器确定)混合均匀后将样本均分为5份，编号96-100；取约1000个HCC827细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号101-105；取约1000个PC9细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本均分为5份，编号106-110。
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本96-110进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个肺癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果如下(表23中数据为细胞数目，表24中数据为平均荧光点数)：
表23 上皮细胞标志基因EpCAM使用不同数量捕获探针的检测结果比较
表24 上皮细胞标志基因EpCAM使用不同数量捕获探针平均荧光点数检测结果比较
通过三组实验对比可知，当仅选用上皮细胞标志基因EpCAM，使用1条、2条和10条的捕获探针均可完成检测，当捕获探针使用2条或以上时，其特异性和稳定性都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时，上皮基因检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。
其它针对肺癌细胞标志基因、上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和白细胞标志基因的使用不同数量捕获探针的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，包括针对每种标志基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述标志基因mRNA包括有以下三类：选自TTF1、NSE、ASC中的至少两种的肺癌细胞标志基因mRNA，选自EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19、KRT20中的至少一种的上皮细胞标志基因mRNA，选自SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1、SERPINE1中的至少一种的间质细胞标志基因mRNA；其中，
所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和标志基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别的标志基因的捕获探针的P2序列相同；
每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
2.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述标志基因mRNA还包括有针对白细胞标志基因的mRNA的一类，所述白细胞标志mRNA为CD45。
3.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述肺癌细胞标志基因的捕获探针中：针对TTF1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.10中的2条或2条以上，针对NSE基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的2条或2条以上，针对ASC基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的2条或2条以上；针对肺癌细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.151；所述肺癌细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.155，P4序列为SEQ ID NO.159。
4.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的2条或2条以上，针对KRT5基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.50中的2条或2条以上，针对KRT7基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60中的2条或2条以上，针对KRT18基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70中的2条或2条以上，针对KRT19基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上，针对KRT20基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.152；所述上皮细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.156，P4序列为SEQ ID NO.160。
5.根据权利要求1所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述间质细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对SNAI2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.91～SEQ IDNO.100中的2条或2条以上，针对FOXC2基因特异性序列P1选自SEQ ID NO.101～SEQ IDNO.110中的2条或2条以上，针对TWIST1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.111～SEQ IDNO.120中的2条或2条以上，针对ZEB1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.121～SEQ IDNO.130中的2条或2条以上，针对SERPINE1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.131～SEQID NO.140中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ IDNO.153；所述间质细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.157，P4序列为SEQID NO.161。
6.根据权利要求1至5任一项所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述白细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对CD45基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.141～SEQ ID NO.150中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ IDNO.154；所述白细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.158，P4序列为SEQ IDNO.162。
7.根据权利要求1至5任一项所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述标志基因mRNA有：TTF1、NSE和ASC的肺癌细胞标志基因mRNA，EpCAM、KRT5、KRT7、KRT18、KRT19和KRT20的上皮细胞标志基因mRNA，SNAI2、FOXC2、TWIST1、ZEB1和SERPINE1间质细胞标志基因mRNA，CD45的白细胞标志基因的mRNA。
8.根据权利要求7所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述肺癌细胞标志基因的捕获探针，包括：针对TTF1基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.10，针对NSE基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20，针对ASC基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30；针对肺癌细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.151；所述肺癌细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.155，P4序列为SEQ ID NO.159；
所述上皮细胞标志基因的捕获探针中：针对EPCAM基因的特异性序列P1有SEQ IDNO.31～SEQ ID NO.40，针对KRT5基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.50，针对KRT7基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60，针对KRT18基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70，针对KRT19基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80，针对KRT20基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.152；所述上皮细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.156，P4序列为SEQ ID NO.160；
所述间质细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对SNAI2基因的特异性序列P1有SEQ IDNO.91～SEQ ID NO.100，针对FOXC2基因特异性序列P1有SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.110，针对TWIST1基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.111～SEQ ID NO.120，针对ZEB1基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.130，针对SERPINE1基因的特异性序列P1有SEQ IDNO.131～SEQ ID NO.140；针对间质细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.153；所述间质细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.157，P4序列为SEQ IDNO.161；
所述白细胞标志基因mRNA捕获探针中：针对CD45基因的特异性序列P1有SEQ IDNO.141～SEQ ID NO.150；针对白细胞标志基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.154；所述白细胞标志基因mRNA扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.158，P4序列为SEQ ID NO.162。
9.根据权利要求1至5任一项所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列为5－10个T。
10.根据权利要求1至5任一项所述的肺癌循环肿瘤细胞分型鉴定试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
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