CN111024624B - 基于暗场散射成像的parp-1单粒子检测方法 - Google Patents

基于暗场散射成像的parp-1单粒子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶‑1（PARP‑1）单粒子检测方法，本发明还公开了一种免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒。基于纳米粒子散射光谱位移的变化实现了对PARP‑1活性的定量检测和在单粒子水平上对细胞内的PARP‑1进行暗场成像，从而显著区分癌细胞和正常细胞。本发明通过使用白光作为光源结合暗场显微镜和单粒子散射光谱仪，可以实现对单个等离子纳米粒子的暗场成像和散射光谱的采集，相比传统的平均测量手段具有更高的检测灵敏度。本发明的试剂盒具有免标记、检测灵敏度高、空间分辨率较高等优点。

Description

基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法
技术领域
本发明生物技术领域，具体涉及基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)单粒子检测方法。
背景技术
多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)是一类广泛存在于真核细胞中的多功能蛋白质翻译后修饰酶，参与DNA的复制和转录、并维持基因组稳定。据报道，PARP-1是PARP家族成员之一，在碱基切除修复进程中占据核心功能，是DNA损伤的分子感应器，当DNA出现链内或链间交联、单/双链断裂或损伤时，PARP-1被激活，活化的PARP-1能结合形成同源二聚体并催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)分解为烟碱和ADP核糖元，将聚ADP核糖聚合物(PAR)产生到靶蛋白上。一旦表面带有大量负电荷的PAR形成，受体蛋白的电荷性质则发生显著改变，引发DNA损伤控制和修复过程。许多研究表明PARP-1在多种恶性肿瘤细胞中过度表达使其成为癌症治疗的潜在靶点，因此开发高灵敏、高特异性的PARP-1活性检测方法至关重要，对于今后癌症的临床诊断和相关药物筛选具有重大意义。
基于激活的PARP-1催化NAD+生成支状聚合物PAR的过程，PARP-1活性可通过NAD+的消耗量或者PAR的生成量来测定。传统的PARP-1检测方法主要有：酶联免疫法，蛋白质印迹法，化学定量NAD+，放射性标记NAD+等方法。这些方法虽然具有很高的灵敏度，但是实验过程比较长，操作也比较复杂，往往需要放射性标记底物，所以检测费用通常也比较高。
目前发展了一系列基于总体测量的PARP-1活性检测策略，包括比色法、荧光光谱法、电化学法和石英晶体微量天平(QCM)法，但是上述检测方法无法在单粒子水平上检测PARP-1活性以及在活细胞中对PARP-1进行成像，因此实际应用有限。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)单粒子检测方法。本发明将Au50作为散射探针，PARP-1被激活、催化生成PAR，通过静电相互作用，许多正电Au8被吸附在Au50表面上，改变了Au50周围的介电环境，导致其散射光颜色和LSPR散射光谱均发生显著变化，通过使用白光作为光源结合暗场显微镜和单粒子散射光谱仪，可以实现对单个Au50的暗场成像和散射光谱的采集，与传统的PARP-l检测方法(酶联免疫法，蛋白质印迹法，化学定量NAD+，放射性标记NAD+等)相比，本发明无需对NAD+进行标记；且相比传统的平均测量方法(比色法、荧光光谱法、电化学法和QCM法等)具有更高的检测灵敏度，检测限降低了约两个数量级。本发明具有免标记、检测灵敏度高、空间分辨率较高等优点。
技术方案：我们利用暗场显微镜(DFM)建立了一种免标记的光谱分辨单粒子检测方法，这种方法不仅可以体外检测PARP-1活性，还能对活细胞内的PARP-1进行成像。通过使用白光作为光源结合暗场显微镜和单粒子散射光谱仪，可以实现对单个等离子纳米粒子的暗场成像和散射光谱的采集，相比传统的平均测量手段具有更高的检测灵敏度和空间分辨率。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
1)直径为50nm的金纳米粒子(Au50)的制备；
2)表面修饰有活性双链DNA的Au50(Au50-dsDNA)的制备；
3)直径为8nm的正电金纳米粒子(Au8)的制备；
4)在Au50-dsDNA中加入加入烟酰胺二核苷酸(NAD+)和含有PARP-1的待测溶液中扩增，然后取样滴加在氨基功能化的玻璃片上，静电吸附后，洗去未结合的探针，加入过量的Au8，静电吸附后，洗去未结合的Au8，在暗场显微镜下采集图像和利用光谱仪采集单粒子的光谱曲线，根据位移的变化来确定PARP-1的浓度。
其中，所述Au50的合成步骤如下：
S1)通过柠檬酸三钠还原法制备粒径为13nm的金纳米粒子：将柠檬酸三钠溶液快速加入搅拌中且沸腾的氯金酸溶液，混合溶液颜色依次从黄色到无色，再变为黑色、紫色，最终为酒红色，继续搅拌并保持沸腾，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中储存备用；
S2)通过种子生长法制备粒径为50nm的金纳米粒子：将超纯水、新鲜制备的Au13、NH2OH·HCl溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液依次加入圆底烧瓶中，然后室温下将氯金酸逐滴加入上述混合溶液中并剧烈搅拌，停止搅拌后室温放置，最后所制得的Au50于4℃冰箱中储存备用。
其中，所述Au50-dsDNA的合成步骤如下：
A1)首先，将BSPP加入到Au50溶液中，在室温搅拌下孵育过夜，然后混合物离心后，沉淀复溶于超纯水，向溶液中加入少量BSPP，摇晃均匀后获得Au50-BSPP；
A2)其次，将Au50-BSPP与s-DNA混合，然后在室温下轻轻搅拌后，每隔3h加NaCl，使其最终盐浓度达到150mM得到Au50溶液；
A3)将SH-PEG-800加入上述Au50溶液中并孵育1h，然后加入c-DNA轻轻摇晃2h，最后进行离心得到Au50-dsDNA。
其中，所述Au8的合成步骤如下：
B1)将氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵在室温下连续搅拌；
B2)滴入硼氢化钠，溶液颜色由藏红花黄色变为橙红色，表明成功制备了Au8。
本发明内容还包括一种免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括Au50-dsDNA、NAD+和Au8。
其中，所述试剂盒还包括氨基功能化的玻璃片。
其中，所述NAD+浓度为1-10μM。
其中，所述癌细胞包括但不仅限于卵巢癌A2780细胞或人乳腺癌MCF-7细胞，其他含有PARP-1的癌细胞均可。
本发明将Au50作为散射探针，当PARP-1被Au50表面的活性双链DNA激活，会将NAD+裂解成烟酰胺和ADP核糖，从而形成一种超支化聚ADP核糖聚合物PAR。PAR带有丰富的负电荷，由于静电吸附作用，加入的正电Au8被吸附到Au50表面上，改变了Au50周围的介电环境，导致其暗场显微镜下散射光颜色和LSPR散射光谱均发生显著变化，呈现为单粒子的局域表面等离子体共振(LSPR)散射光谱发生位移，根据位移的变化来确定PARP-1的浓度。
本发明基于纳米粒子散射光谱位移的变化实现了对PARP-1活性的定量检测和在单粒子水平上对细胞内的PARP-1进行暗场成像，从而显著区分癌细胞和正常细胞。
其中，所述Au50的具体合成步骤如下：
C1)通过柠檬酸三钠还原法制备粒径为13nm的金纳米粒子(Au13)：将柠檬酸三钠溶液(38.8mM，5mL)快速加入搅拌中且沸腾的氯金酸溶液(1mM，50mL)，混合溶液颜色在2min内依次从黄色到无色，再变为黑色、紫色，最终为酒红色，继续搅拌并保持沸腾15min，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中储存备用；
C2)通过种子生长法制备粒径为50nm的金纳米粒子(Au50)：将25mL超纯水、1mL新鲜制备的Au13、NH2OH·HCl溶液(0.2M，360μL)和聚乙烯吡咯烷酮溶液(PVP，1％w/v，300μL)依次加入50mL圆底烧瓶中，然后室温下将8mL 0.1wt％氯金酸逐滴加入上述混合溶液中并剧烈搅拌30min，停止搅拌后室温放置30min，最后所制得的Au50于4℃冰箱中储存备用。
其中，所述Au50表面修饰有活性双链DNA的具体合成步骤如下：
1)首先，将1mg BSPP加入到1mL Au50溶液中(初始浓度为0.1nM)，在室温搅拌下孵育过夜，然后混合物以8000rpm/min离心15min后，沉淀复溶于1mL超纯水，向溶液中加入少量BSPP(10mM，50μL)，摇晃均匀后获得BSPP保护的Au50(Au50-BSPP)；
2)其次，将Au50-BSPP与s-DNA(1μM，30μL)混合，然后在室温下轻轻搅拌12h后，每隔3h加1M NaCl，使其最终盐浓度达到150mM；
3)将SH-PEG-800(10μM，18μL)加入上述Au50溶液中并孵育1h，以阻断Au50的非特异性结合位点，然后加入c-DNA(1μM，30μL)轻轻摇晃2h，最后以8000rpm/min离心15min后，得到表面修饰有活性双链DNA的Au50(Au50-dsDNA)。
其中，所述Au8的具体合成步骤如下：
1)将氯金酸溶液(1mM，15mL)和CTAB(10mM，2mL)在室温下连续搅拌15min；
2)滴入NaBH4(10mM，2mL)，溶液颜色由藏红花黄色变为橙红色，且15min内不发生变化，表明成功制备了Au8，获得的Au8储存在棕色玻璃瓶中并于4℃冰箱中储存备用。
其中，所述Au50浓度为0.1nM。
其中，所述Au8浓度为1-50nM。
其中，所述NAD+要求过量，浓度为1-10μM。
其中，所述分析方法不仅可以根据纳米粒子散射光谱位移的变化实现对PARP-1活性的定量检测，还可以在单粒子水平上对活细胞内的PARP-1进行暗场成像。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：
1、本发明通过使用白光作为光源结合暗场显微镜和单粒子散射光谱仪，可以实现对单个等离子纳米粒子的暗场成像和散射光谱的采集，相比传统的平均测量手段具有更高的检测灵敏度。将Au50作为散射探针，当PARP-1被Au50表面的活性双链DNA激活，会将NAD+裂解成烟酰胺和ADP核糖，从而形成一种超支化聚ADP核糖聚合物PAR。PAR带有丰富的负电荷，由于静电吸附作用，加入的正电Au8被吸附到Au50表面上，改变了Au50周围的介电环境，导致其暗场显微镜下散射光颜色和LSPR散射光谱均发生显著变化。基于纳米粒子散射光谱位移的变化实现了对PARP-1活性的定量检测和在单粒子水平上对细胞内的PARP-1进行暗场成像，从而显著区分癌细胞和正常细胞。本发明具有免标记、检测灵敏度高、空间分辨率较高等优点。
本发明的试剂盒可以对体外的PARP-1活性进行超灵敏免标记检测，与比色法、荧光光谱法、电化学法等方法相比，检测限降低了两个数量级；通过标准加入法，利用该试剂盒测定了人血清样品中的PARP-1含量，回收率在93％至107％之间，相对标准偏差(RSD)小于5.52％，表明该试剂盒可用于实际样品中PARP-1的检测；该试剂盒成功地应用于检测已提取的三种细胞(A2780，MCF-7和IOSE80)的细胞质和细胞核中的PARP-1活性，检测结果与商业化的ELISA结果基本一致；该试剂盒还可以对活细胞内的PARP-1进行免标记成像。
附图说明
图1显示了基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)单粒子检测方法的流程图；
图2显示了Au50和Au8的表征，图2A和图2B分别为Au50和Au8的透射电子显微镜(TEM)图像，图2C和图2D分别为Au50和Au8的紫外可见光谱；图2E和图2F分别为Au50和Au8的粒径分布数据；
图3A显示了暗场图像和相应的散射光谱：Au50(a)，Au50-dsDNA(b)，Au50-dsDNA/1μMNAD+/5.0mU PARP-1(c)，然后分别与Au8孵育10min，图3B、图3C、图3D是与图3A相对应的扫描电子显微镜(SEM)图像，在氨基功能化的ITO载玻片上进行拍摄；
图4A显示了检测不同浓度PARP-1的暗场图及其相应的散射光谱，图4B显示了散射峰位移和不同浓度PARP-1的校准曲线(插图：散射峰位移值和PARP-1对数浓度之间的线性关系，范围为0.2mU～10mU)，图4C、图4D、图4E是在溶液中分别对三种浓度的PARP-1(0.2，2.0和10mU)进行了TEM表征；
图5显示了纳米探针Au50-dsDNA-aptamer或Au8-aptamer和A2780、MCF-7、IOSE80细胞孵育不同时间后的细胞存活率；
图6优化了探针Au50-dsDNA-aptamer和MCF-7细胞孵育的浓度，优化后的浓度为10pM，以及优化了探针Au8-aptamer和MCF-7细胞的孵育时间，优化后的时间为1h；
图7显示了10pM Au50-dsDNA-aptamer和MCF-7(A)，A2780(B)，IOSE80(C)细胞孵育5h，Au8-aptamer孵育了1h后的暗场图像和被红色虚线标记的单个粒子的对应散射谱，进一步利用TEM来表征两种细胞MCF-7(G)和IOSE80细胞(H)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
本实验中用到的试剂和仪器：
所有寡核苷酸均由上海生工生物技术有限公司(中国上海)合成，如表1所示。双(对磺苯基)苯基膦(BSPP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)均购自Sigma-Aldrich(中国上海)。(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(APTES)购自上海麦克林生化科技有限公司(中国上海)。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自百灵威科学有限公司(中国北京)。柠檬酸三钠、四水氯金酸(HAuCl4·4H2O)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均购自国药化学试剂公司(中国上海)。三水氯金酸(HAuCl4·3H2O)购自安耐吉化学(中国上海)。人PARP-1购自Trevigen(中国武汉)。DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2-二苯基四唑溴化铵(MTT)均购自江苏凯基生物技术股份有限公司(中国南京)。
表1
Figure BDA0002327909260000061
通过JEM-2010TEM(JEOL，Japan)测得透射电子显微镜(TEM)图像。通过JSM-7001FSEM(JEOL，Japan)测得扫描电子显微镜(SEM)图像。紫外-可见光谱在紫外-可见光谱仪(Shimadzu UV-2450，Kyoto，Japan)上测得。每个样品的Zeta电位均在25℃下由NanoBrookOmni Zeta电位分析仪(Brookheaven，USA)测量，并在去离子水稀释后至少测量三次。在配备有暗场聚光器(0.8＜NA＜0.95)，60X物镜(NA＝0.7)和彩色CCD(S45，佳能，日本)的暗场显微镜(DFM)(Eclipse Ti-U，尼康，日本)上收集并获取暗场图像。安装在该显微镜上的SP2556光谱仪和512B模块电子倍增电荷耦合器件(普林斯顿仪器，美国)作为探测器，通过将光路切换到配备有光栅的光谱仪(光栅密度：300线/mm；闪耀波长：600nm)来获得散射光谱。
本发明实施例中PARP-1催化PAR在反应缓冲液(R-buffer)中进行，R-buffer缓冲液为50mM Tris-HCl、2mM MgCl2、50μM Zn(OAc)2、50mM KCl、pH 7.4。
实施例1直径为50nm的金纳米粒子(Au50)的合成
首先，通过柠檬酸三钠还原法制备粒径为13nm的金纳米粒子(Au13)：将柠檬酸三钠溶液(38.8mM，5mL)快速加入搅拌中且沸腾的氯金酸溶液(1mM，50mL)，混合溶液颜色在2min内依次从黄色到无色，再变为黑色、紫色，最终为酒红色，继续搅拌并保持沸腾15min，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中储存备用；
其次，通过种子生长法制备粒径为50nm的金纳米粒子(Au50)：将25mL超纯水、1mL新鲜制备的Au13、NH2OH·HCl溶液(0.2M，360μL)和聚乙烯吡咯烷酮溶液(PVP，1％w/v，300μL)依次加入50mL圆底烧瓶中，然后室温下将8mL 0.1wt％氯金酸逐滴加入上述混合溶液中并剧烈搅拌30min，停止搅拌后室温放置30min，最后所制得的Au50于4℃冰箱中储存备用。
图2显示了Au50的表征，图2A为Au50的透射电子显微镜(TEM)图像，为均一球形，且在溶液中单分散性良好；图2C为Au50的紫外可见光谱，峰集中在534nm处；图2E为Au50的粒径分布数据，主要分布在50nm。以上结果表明成功合成Au50。
实施例2直径为8nm的正电金纳米粒子(Au8)的合成
首先，将氯金酸溶液(1mM，15mL)和CTAB(10mM，2mL)在室温下连续搅拌15min；其次，滴入NaBH4(10mM，2mL)，溶液颜色由藏红花黄色变为橙红色，且15min内不发生变化，表明成功制备了Au8，获得的Au8储存在棕色玻璃瓶中并于4℃冰箱中储存备用。
图2显示了Au8的表征，图2B为Au8的TEM图像，为均一球形，且在溶液中单分散性良好；图2D为Au8的紫外可见光谱，峰集中在518nm处；图2F为Au8的粒径分布数据，主要分布在8nm。以上结果表明成功合成Au8。
实施例3基于暗场散射成像的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1单粒子检测方法原理验证
首先将两种活性DNA链(s-DNA和c-DNA，序列见表1)修饰到实施例1制备的Au50表面形成Au50-dsDNA，然后加入PARP-1，PARP-1被Au50表面的活性双链DNA激活，将NAD+裂解成烟酰胺和ADP核糖，这些单元通过共价结合连接到PARP-1并聚合形成超支化聚ADP核糖聚合物(PAR)，随后为了避免吸附过程中的团聚，先将Au50-dsDNA@PAR涂覆在氨基功能化玻璃片上静电吸附5min，吸走未吸附的液体，然后加入Au8以形成Au50-dsDNA@PAR@Au8。与ds-DNA相比，PAR的负电荷较多，可以吸附更多的Au8，从而使得Au50散射峰发生明显红移，并表现出散射光的颜色变化。
具体步骤为：
1)首先，将1mg BSPP加入到1mL Au50溶液中(初始浓度为0.1nM)，在室温搅拌下孵育过夜，然后混合物以8000rpm/min离心15min后，沉淀复溶于1mL超纯水，向溶液中加入少量BSPP(10mM，50μL)，摇晃均匀后获得BSPP保护的Au50(Au50-BSPP)；
2)其次，将Au50-BSPP与s-DNA(1μM，30μL)混合，然后在室温下轻轻搅拌12h后，每隔3h加1M NaCl，使其最终盐浓度达到150mM；
3)将SH-PEG-800(10μM，18μL)加入上述Au50溶液中并孵育1h，以阻断Au50的非特异性结合位点，然后加入c-DNA(1μM，30μL)轻轻摇晃2h，最后以8000rpm/min离心15min后，得到表面修饰有活性双链DNA的Au50(Au50-dsDNA)；
4)在Au50-dsDNA中加入烟酰胺二核苷酸(NAD+)(1μM，10μL)和5.0mU PARP-1，在37℃下扩增1h，然后取样滴加在氨基功能化的玻璃片上，静电吸附5min后，洗去未结合的探针，加入过量的Au8，静电吸附10min，洗去未结合的Au8，在暗场显微镜下采集图像和利用光谱仪采集单粒子的光谱曲线。
图3A显示当没有PARP-1时，Au50(曲线a)和Au50-dsDNA(曲线b)的散射颜色几乎保持绿色，因为它们的负电性不足以吸附Au8。当加入5.0mU PARP-1时，被吸附的多个Au8改变了Au50周围的介电环境，散射颜色变红(曲线c)，散射光谱红移了约83nm。此外，用SEM进一步验证了Au50-dsDNA@PAR的吸附能力，确实几乎没有Au8存在于Au50(图3B)和Au50-dsDNA(图3C)的表面上，而在加入5.0mU PARP-1(图3D)后，Au50表面上吸附有许多Au8。
实施例4不同浓度PARP-1的体外检测
首先，将1mg BSPP加入到1mL Au50溶液中，在室温搅拌下孵育过夜，然后混合物以8000rpm/min离心15min后，沉淀复溶于1mL超纯水，向溶液中加入少量BSPP(10mM，50μL)，摇晃均匀后获得BSPP保护的Au50(Au50-BSPP)；
其次，将Au50-BSPP与s-DNA(1μM，30μL)混合，然后在室温下轻轻搅拌12h后，每隔3h加1M NaCl，使其最终盐浓度达到150mM；将SH-PEG-800(10μM，18μL)加入上述Au50溶液中并孵育1h，以阻断Au50的非特异性结合位点，然后加入c-DNA(1μM，30μL)轻轻摇晃2h，最后以8000rpm/min离心15min后，得到表面修饰有活性双链DNA的Au50(Au50-dsDNA)复溶于1mL R-buffer缓冲液中。各取50μL Au50-dsDNA，加入NAD+(1μM，10μL)和0.2mU，0.3mU，1.0mU，2.0mU，5.0mU、10mU PARP-1在37℃下扩增1h，然后取样滴加在氨基功能化的玻璃片上，静电吸附5min后，洗去未结合的探针，加入过量的Au8，静电吸附10min，洗去未结合的Au8，在暗场显微镜下采集图像和利用光谱仪采集单粒子的光谱曲线。
图4A显示了检测不同浓度PARP-1的暗场图及其相应的散射光谱，在最佳实验条件下，随着PARP-1浓度的增加，Au50的散射光谱表现出明显的红移，散射色逐渐由绿色变为黄色，最终为红色。图4B显示了散射峰位移和不同浓度PARP-1的校准曲线(插图：散射峰位移值和PARP-1对数浓度之间的线性关系，范围为0.2mU～10mU，检测限是0.067mU。图4C、图4D、图4E是在溶液中分别对三种浓度的PARP-1(0.2，2.0和10mU)进行了TEM表征，随着PARP-1浓度的增加，Au50表面吸附的Au8确实越来越多，进一步证明了暗场散射成像结果。
实施例5纳米探针Au50-dsDNA-aptamer的制备
首先，将1mg BSPP加入到1mL实施例1制备的Au50溶液中，在室温搅拌下孵育过夜，然后混合物以8000rpm/min离心15min后，沉淀复溶于1mL超纯水，向溶液中加入少量BSPP(10mM，50μL)，摇晃均匀后获得BSPP保护的Au50(Au50-BSPP)；
其次，依次将s-DNA(1μM，30μL)、AS1411-aptamer(1μM，30μL)加入到Au50-BSPP中，然后在室温下轻轻搅拌12h后，每隔3h加1M NaCl，使其最终盐浓度达到150mM得到Au50溶液；
最后，将SH-PEG-800(10μM，18μL)加入到Au50溶液中并孵育1h，以阻断Au50的非特异性结合位点，然后加入c-DNA(1μM，30μL)轻轻摇晃2h，最后以8000rpm/min离心15min后，得到Au50-dsDNA-aptamer。
实施例6纳米探针Au8-aptamer的制备
首先，将AS1411-aptamer(1μM，30μL)加入到实施例2制备的1mL Au8中，然后在室温下轻轻搅拌12h后，以13000rpm/min离心15min后，得到Au8-aptamer。
实施例7两种纳米探针(Au50-dsDNA-aptamer和Au8-aptamer)的细胞毒性评价
首先，将三种细胞(A2780，MCF-7，IOSE80)接种于96孔板中，然后分别将制备好的Au50-dsDNA-aptamer和Au8-aptamer在不同时间点(2，4，6，12，24，32，48h)加入，整个过程细胞都在37℃、5％CO2的孵箱中培养。加样结束后，在每孔中加入200μL MTT(0.5mg/mL)培养4小时，然后加入200μL二甲亚砜(DMSO)将活细胞还原MTT后产生的蓝色甲瓒溶解，震荡孵育5min，用微型读板器记录490nm处的吸光度。
图5显示了纳米探针Au50-dsDNA-aptamer或Au8-aptamer和A2780、MCF-7、IOSE80细胞孵育不同时间后的细胞存活率，12h后两种纳米探针的细胞存活率都达到了85％以上。
实施例8探针Au50-dsDNA-aptamer的浓度优化以及探针Au8-aptamer的孵育时间优化
首先，对探针Au50-dsDNA-aptamer的浓度进行优化，将MCF-7细胞接种于干净的共焦培养皿中培育12h，然后加入400μL含有不同浓度Au50-dsDNA-aptamer(1，10，100pM)的新鲜血清培养基并孵育5h，用1×PBS(pH 7.4)清洗三次以除去多余的探针，最后加入400μL含有Au8-aptamer的新鲜血清培养基并孵育1h后，用1×PBS(pH 7.4)仔细冲洗细胞，再加200μL 1×PBS(pH 7.4)保持细胞形态并在DFM下采集图像。
其次，对探针Au8-aptamer的孵育时间进行优化，同样地，将MCF-7细胞接种于干净的共焦培养皿中培育12h，然后加入400μL含有10pM Au50-dsDNA-aptamer的新鲜血清培养基并孵育5h，用1×PBS(pH 7.4)清洗三次以除去多余的探针，最后加入400μL含有Au8-aptamer的新鲜血清培养基并孵育不同时间(0.5，1，2h)后，用1×PBS(pH 7.4)仔细冲洗细胞，再加200μL 1×PBS(pH 7.4)保持细胞形态并在DFM下采集图像。
图6优化了探针Au50-dsDNA-aptamer和MCF-7细胞孵育的浓度，优化后的浓度为10pM，以及探针Au8-aptamer和MCF-7细胞的孵育时间，优化后的时间为1h。
实施例9细胞内PARP-1成像
将三种细胞(A2780，MCF-7，IOSE80)分别接种于干净的共焦培养皿中培育12h，然后各加入400μL含有10pM Au50-dsDNA-aptamer的新鲜血清培养基并孵育5h，用1×PBS(pH7.4)清洗三次以除去多余的探针，最后各加入400μL含有Au8-aptamer的新鲜血清培养基并孵育1h后，用1×PBS(pH 7.4)仔细冲洗细胞，再加200μL 1×PBS(pH 7.4)保持细胞形态并在DFM下观察以及进行单粒子光谱采集。
此外，选择MCF-7和IOSE80细胞制备TEM细胞样品。细胞与两种探针孵育的步骤同上，然后将20μL细胞悬液滴在铜网上并静置1h，再滴入4wt％多聚甲醛固定细胞15min，最后加入1wt％磷钨酸钠(Na3O40PW12)作为阴性染色剂进行观察。
如图7所示，在癌细胞MCF-7(图7A)和A2780细胞(图7B)中纳米探针的散射光颜色均呈橙色，其峰值波长分别位于612(图7D)和607nm(图7E)(用红色虚线圆圈标记)。相反，在正常细胞IOSE80细胞中纳米探针的散射光颜色(图7C)为淡黄色，其峰值波长位于557nm(图7F)(用红色虚线圆圈标记)。结果表明癌细胞含有更多PARP-1，利用本发明可以区分癌细胞与正常细胞。
为了进一步验证纳米探针通过细胞内吞进入细胞，用TEM进行了表征。在高倍镜下，由于MCF-7细胞含有PARP-1，催化生成了聚合物PAR，许多Au8被吸附在Au50周围(图7G)，而IOSE80细胞中存在极少量的PARP-1，Au50周围几乎没有Au8(图7H)。
实施例10
为了进一步研究此方法在实际样品中的应用性，通过标准加入法，按照实施例4所建立的检测方法检测了东南大学校医院健康志愿者捐赠的三份血清中PARP-1活性，实验结果如表2所示，回收率在93％至107％之间，相对标准偏差(RSD)小于5.52％，表明本发明的方法准确性良好，可用于检测实际血样中的PARP-1活性；此外，分别提取了三种细胞(A2780，MCF-7和IOSE80)的细胞质和细胞核，将其取代PARP-1，其他反应物和反应条件均与体外检测PARP-1活性实验保持一致，检测结果也如表2所示，癌细胞的检测结果与商业化的ELISA结果基本一致(表3)。这些结果表明本发明的方法具有良好的性能，在今后的临床诊断中具有潜在应用价值。
表2
Figure BDA0002327909260000111
表3
Figure BDA0002327909260000121
序列表
<110> 东南大学
<120> 基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> S-DNA(Artificial Sequence)
<400> 1
cccgtgcgtg cgcgagtgag ttg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> C-DNA(Artificial Sequence)
<400> 2
caactcactc gcgcacgcac ggg 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> AS1411 aptamer(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26

Claims (7)

1.基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
1 ） Au50的制备；
2 ） Au50-dsDNA的制备；
3）Au8的制备；
4）在Au50-dsDNA中加入NAD+和含有PARP-1的待测溶液中扩增，然后取样滴加在氨基功能化的玻璃片上，静电吸附后，洗去未结合的探针，加入过量的Au8，静电吸附后，洗去未结合的Au8，在暗场显微镜下采集图像和利用光谱仪采集单粒子的光谱曲线，根据位移的变化来确定PARP-1的浓度；
所述Au50-dsDNA的合成步骤如下：
A1）首先，将BSPP加入到Au50溶液中，在室温搅拌下孵育过夜，然后混合物离心后，沉淀复溶于超纯水，向溶液中加入少量BSPP，摇晃均匀后获得Au50-BSPP；
A2）其次，将Au50-BSPP与s-DNA混合，然后在室温下轻轻搅拌后，每隔3 h加NaCl，使其最终盐浓度达到150 mM得到Au50溶液；
A3）将SH-PEG-800加入上述Au50溶液中并孵育1h，然后加入c-DNA轻轻摇晃2 h，最后进行离心得到Au50-dsDNA；所述s-DNA和c-DNA序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述Au50的合成步骤如下：
S1）通过柠檬酸三钠还原法制备粒径为13nm的金纳米粒子：将柠檬酸三钠溶液快速加入搅拌中且沸腾的氯金酸溶液，混合溶液颜色依次从黄色到无色，再变为黑色、紫色，最终为酒红色，继续搅拌并保持沸腾，待自然冷却至室温后，4℃冰箱中储存备用；
S2）通过种子生长法制备粒径为50nm的金纳米粒子：将超纯水、新鲜制备的Au13、NH2OH·HCl溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液依次加入圆底烧瓶中，然后室温下将氯金酸逐滴加入上述混合溶液中并剧烈搅拌，停止搅拌后室温放置，最后所制得的Au50于4℃冰箱中储存备用。
3.根据权利要求1所述基于暗场散射成像的PARP-1单粒子检测方法，其特征在于，所述Au8的合成步骤如下：
B1）将氯金酸溶液和十六烷基三甲基溴化铵在室温下连续搅拌；
B2）滴入硼氢化钠，溶液颜色由藏红花黄色变为橙红色，表明成功制备了Au8。
4.一种免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Au50-dsDNA、NAD+和Au8。
5.根据权利要求4所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括氨基功能化的玻璃片。
6.根据权利要求4所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述NAD+浓度为1-10μM。
7.根据权利要求4~6任一项所述的免标记的用于鉴定癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述癌细胞为卵巢癌A2780细胞或人乳腺癌MCF-7细胞。
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