CN111521602B - 一种parp-1浓度的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种PARP‑1浓度的检测方法及其应用，属于生物分析技术领域。其中，检测方法包括：合成金纳米棒，合成AuNPs‑DNA分离体系，在AuNPs‑DNA分离体系中加入NAD+、含MoO4 2‑的酶反应缓冲液以及待测PARP‑1进行反应。将反应后溶液的上清液加入至金纳米棒中，并加入KI，H2O2和酸性缓冲液进行反应，对反应后的溶液进行检测，以得到待测PARP‑1的浓度。本发明通过降低KI和H2O2刻蚀金纳米棒的催化效率，使溶液的紫外‑可见峰发生明显蓝移，溶液的颜色也由浅蓝色变成棕色，可通过肉眼简单识别，极大地简化了操作过程，缩短了检测时间，无复杂的操作步骤、无需任何大型仪器。并且，本发明可将该方法应用于对人体细胞中的PARP‑1进行检测，具有较高的选择性和实际应用价值。

Description

一种PARP-1浓度的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种PARP-1浓度 的检测方法及其一种PARP-1浓度检测方法的应用。
背景技术
聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是真核生物中存在的一类 蛋白质家族，PARP-1作为PARP家族的一员，在DNA复制，转 录调控和碱基切除修复中起着至关重要的作用，同时，PARP-1也 是细胞对DNA损伤反应的重要组成部分，因此是被研究最为广泛 的PARP。其中，PARP-1是一种分子量为113kDa的酶，具有三 个功能域：一个包含两个锌指基序的N端DNA结合域；一个包 含蛋白质-蛋白质相互作用界面的中央自修饰域，也存在于其他与 维持基因组完整性有关的酶和因子中；以及涉及聚(ADP-核糖) 合成的C端催化结构域。PARP-1在与受损DNA或者dsDNA结 合后被激活，并催化裂解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)为烟酰 胺和ADP-核糖，其中ADP-核糖部分(50-200个分子)以线性或 支链聚合物[聚(ADP-核糖)(PAR)]依附于受体蛋白质上，形成的聚 合物PAR含有大量负电荷的磷酸根基团裸露在支链上。
尽管PARP-1作为肿瘤标志物之一已经为人们所熟知，但是 由于其本身的性质，在检测方法上比较单一，研究较少，传统使 用较多的是酶免疫测定(ELISA)和放射性标记方法，因此，有必 要提出一种新的检测方法，基于金纳米棒可视化、无标记的比色 探针来检测PARP-1活性的方法，省去许多繁琐的标记步骤。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供 一种PARP-1浓度的检测方法以及一种PARP-1浓度检测方法的应 用。
本发明的第一方面，提供一种PARP-1浓度的检测方法，包 括：
合成金纳米棒；
合成AuNPs-DNA分离体系；
在所述AuNPs-DNA分离体系中加入NAD+、含MoO4 2-的酶 反应缓冲液以及待测PARP-1进行反应；
将反应后溶液的上清液加入至所述金纳米棒中，并加入KI， H2O2和酸性缓冲液进行反应，对反应后的溶液进行检测，以得到 所述待测PARP-1的浓度。
可选的，所述合成AuNPs-DNA分离体系，包括：
将金纳米粒子、HS-ssDNA1与NaCl混合反应18h～24h，之后， 加入HS-PEG和ssDNA2进行反应，离心处理后，以得到所述 AuNPs-DNA分离体系。
可选的，所述将金纳米粒子、HS-ssDNA1与NaCl混合反应 18h～24h，之后，加入HS-PEG和ssDNA2进行反应，离心处理后， 以得到所述AuNPs-DNA分离体系，包括：
将40μL～50μL的金纳米粒子加入0.5mg～1.5mg的BSPP中反 应10h～15h，离心除去上清液；
将所述金纳米粒子再次分散在超纯水中，与2μL～4μL的 HS-ssDNA1反应1h～3h，并在等间隔时间内添加NaCl进行混合反 应18h～24h，得到盐化后的金纳米粒子溶液；
将1μL～2μL的HS-PEG加入至所述盐化后的金纳米粒子溶液 中反应1h～3h，并加入2μL～4μL的ssDNA2与所述HS-ssDNA1进 行杂交反应1h～3h，离心除去上清液，以得到所述AuNPs-DNA分 离体系。
可选的，所述在所述AuNPs-DNA分离体系中加入NAD+、含 MoO4 2-的酶反应缓冲液以及待测PARP-1进行反应，包括：
将40μL～60μL的所述AuNPs-DNA分离体系、5μL～15μL的NAD+和待测PARP-1在30℃～45℃温育1h～2h，第一次离心水洗 去除上清液；
之后，分散在10μL～30μL含MoO4 2-的酶反应缓冲液中，反应 0.5h～1.5h后进行第二次离心处理。
可选的，所述将反应后溶液的上清液加入至所述金纳米棒中， 并加入KI，H2O2和酸性缓冲液进行反应，对反应后的溶液进行检 测，以得到所述待测PARP-1的浓度，包括：
将所述第二次离心处理后的上清液加入至含有2μL～3μL KI， 5μL～15μL H2O2和40μL～60μL所述金纳米棒的酸性缓冲液中，在 40℃～60℃下反应10min～20min；
对反应后的溶液放入紫外-可见光谱仪中进行检测，并观察溶 液的颜色，以得到所述待测PARP-1的浓度。
可选的，所述NAD+浓度范围为80μmol/L～120μmol/L；
所述含MoO4 2-的酶反应缓冲液浓度范围为30nmol/L～50nmol/ L。
可选的，所述含MoO4 2-的酶反应缓冲液包括：浓度范围为 20nmol/L～40nmol/L的MoO4 2-、浓度范围为5mmol/L～15mmol/L 的Tris-HCl，以及浓度范围为0.1mol/L～0.2mol/L的NaCl。
可选的，所述金纳米棒与所述酸性缓冲液的体积比范围为 0.1～1。
可选的，所述HS-ssDNA1浓度范围为5μmol/L～15μmol/L；
所述NaCl浓度范围为10mmol/L～30mmol/L；
所述HS-PEG浓度范围为5mmol/L～15mmol/L；
所述ssDNA2浓度范围为5μmol/L～15μmol/L。
本发明的第二方面，提供一种PARP-1浓度检测方法的应用， 采用前文记载的所述方法用于检测人体细胞中PARP-1的含量。
本发明提供一种PARP-1浓度的检测方法，具体包括：合成 金纳米棒，合成AuNPs-DNA分离体系，在AuNPs-DNA分离体系 中加入NAD+、含MoO4 2-的酶反应缓冲液以及待测PARP-1进行反 应，并将反应后溶液的上清液加入至金纳米棒中，并加入KI，H2O2和酸性缓冲液进行反应，对反应后的溶液进行检测，以得到待测 PARP-1的浓度。本发明提供的检测方法无需任何大型仪器，并能 通过肉眼快速的判断实验进程，由于酶反应缓冲溶液中的MoO4 2-可以明显的催化KI和H2O2刻蚀金纳米棒，并且当PARP-1存在 时，AuNPs-DNA上可以扩增形成的富含PO4 3-的PAR结构，会与 溶液中的MoO4 2-结合形成PMo12O40 3-，从而减少溶液中MoO4 2-的 含量，降低对KI和H2O2刻蚀金纳米棒的催化效率，使得溶液的 紫外-可见峰发生明显的蓝移，溶液的颜色也由浅蓝色变成棕色。 本发明具有很高的选择性和实际应用价值，并且可以通过肉眼简 单识别，极大地简化了操作过程，缩短了检测时间。
附图说明
图1为本发明一实施例的一种PARP-1浓度的检测方法的流 程框图；
图2为本发明另一实施例的一种PARP-1浓度的检测方法流 程示意图；
图3(a)为本发明另一实施例的未被刻蚀的金纳米棒的透射电 子显微镜图像；
图3(b)为本发明另一实施例的无PARP-1时，40nmol/L MoO4 2-催化H2O2和KI刻蚀金纳米棒的透射电子显微镜图像；
图3(c)为本发明另一实施例的0.5U PARP-1抑制MoO4 2-催化 H2O2和KI刻蚀金纳米棒的透射电子显微镜图像；
图4为本发明另一实施例的不同组分探针对MoO4 2-催化H2O2和KI刻蚀金纳米棒的影响紫外-可见光谱；
图4(a)为本发明另一实施例中的dsDNA比色探针；
图4(b)为本发明另一实施例中的dsDNA/NAD+的比色探针；
图4(c)为本发明另一实施例的dsDNA/0.5U PARP-1的比色探 针；
图4(d)为本发明另一实施例的dsDNA/NAD+/0.5U PARP-1的 比色探针；
图5(a)为本发明另一实施例的金纳米棒随着PARP-1浓度变 化而发生的颜色变化图；
图5(b)为本发明另一实施例的在不同浓度PARP-1的条件下， 金纳米棒的紫外吸收峰变化图；
图5(c)为本发明另一实施例的金纳米棒的紫外吸收峰的位移 值与不同浓度PARP-1的标准曲线图；
图6为本发明另一实施例的不同活性酶对金纳米棒刻蚀的影 响结果图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结 合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
如图1所示，本发明的第一方面，提供一种PARP-1浓度的 检测方法S100，该检测方法具体包括以下步骤S110～S140：
S110、合成金纳米棒。
具体地，如图1所示，本实施例采用一锅法合成金纳米棒， 首先，在250mL的锥形瓶中，先加入30mL～40mL的超纯水，再 加入35mL～40mL提前溶解好的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 溶液(浓度范围为0.1mol/L～0.4mol/L)，锥形瓶保持30℃～40℃ 恒温，再快速加入590μL～600μL三水合氯金酸(10nmol/L～12nmol /L)，摇晃均匀，紧接着逐滴滴加270μL～290μL现配制的硝酸银 (AgNO3)溶液(浓度范围为0.01mol/L～0.04mol/L)，边加边振荡，使溶液混合均匀。随后加入2mL～4mL的对苯二酚(浓度范围 为0.1mol/L～0.4mol/L)，反应4min～8min左右，至溶液完全变为 无色后，加入2.0mL～3.0mL由冰水现配的硼氢化钠(NaBH4)溶 液(浓度范围为0.1mmol/L～0.6mmol/L)，恒温反应10h～14h。反 应结束后，溶液为棕色，离心(13000rpm，20分钟)，去除上清 液，再重复离心一次，最终复溶于超纯水中，室温保存，得到金 纳米棒，该金纳米棒可作为可视化，无标记的比色探针用于后续 实验中，通过观察溶液的颜色变化即可判断出待测PARP-1的浓 度。
如图3(a)所示，由TEM图像可以看出，本实施例制备得到的 金纳米棒呈均匀的长棒状
S120、合成AuNPs-DNA分离体系。
示例性的，包括以下步骤：首先，将金纳米粒子、HS-ssDNA1 与NaCl混合反应18h～24h，之后，加入HS-PEG和ssDNA2进行 反应，离心处理后，以得到AuNPs-DNA分离体系。具体地，将 40μL～50μL的金纳米粒子(10nm～15nm)加入0.5mg～1.5mg的双 (对-磺酰基苯基)苯基膦二水合物二钾盐(BSPP)中反应 10h～15h，离心除去上清液。之后，将金纳米粒子再次分散在超纯 水中，与2μL～4μL的HS-ssDNA1(浓度范围为5μmol/L～15μmol/L) 反应1h～3h，并在等间隔时间内添加NaCl(浓度范围为 10mmol/L～30mmol/L)进行混合反应18h～24h(例如，每隔1h～3h 添加一次NaCl)，得到盐化后的金纳米粒子溶液，增加其抗盐性， 最终使得溶液中的盐浓度达到150mmol/L～250mmol/L。
进一步的，在反应20h～30h之后，再将1μL～2μL的硫基聚乙 二醇(HS-PEG)(浓度范围为5mmol/L～15mmol/L)加入至上述 盐化后的金纳米粒子溶液中反应1h～3h，并加入2μL～4μL的 ssDNA2(浓度范围为5μmol/L～15μmol/L)与HS-ssDNA1进行杂 交反应1h～3h，离心除去上清液，以得到AuNPs-DNA分离体系， 并将该分离体系保存在酶反应缓冲液中备用。也就是说，该步骤 在金纳米颗粒上负载DNA形成AuNPs-DNA，其中，DNA促使 PARP-1扩增形成富含PO4 3-的PAR结构，该分离体系可有效提高 检测灵敏度。
需要说明的是，本实施例中采用的DNA链由生工生物(中国 上海)提供，当然，也可以选择其他DNA链，对比并不作具体限 定，示例性的，本实施的DNA链序列如下所示：
HS-ssDNA1：
5’-HS-AAAAAAAAACCCGTGCGTGCGCGAGTGAGTTG-3’
ssDNA2：5’-CAACTCACTCGCGCACGCACGGG-3’。
进一步需要说明的是，本实施例采用的酶反应缓冲液包括 5mmol/L～15mmol/L的Tris-HCl与0.1mol/L～0.2mol/L的NaCl，并 且，该酶反应缓冲液的pH值范围为6～8。另外，本实施例各物质 计算出的最终浓度范围具体如下：金纳米粒子浓度范围为 5nmol/L～8nmol/L，HS-ssDNA1浓度范围为400nmol/L～600nmol/ L，NaCl浓度范围为100mmol/L～150mmol/L，HS-PEG浓度范围 为0.1mmol/L～0.4mmol/L，ssDNA2浓度范围为400nmol/L～600 nmol/L。
S130、在AuNPs-DNA分离体系中加入NAD+、含MoO4 2-的 酶反应缓冲液以及待测PARP-1进行反应。
具体地，将40μL～60μL的AuNPs-DNA分离体系、5μL～15μL 的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)(浓度范围为80μmol/L～120 μmol/L)和待测人体聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)在30℃～45℃ 温育1h～2h，第一次离心水洗两次～四次去除上清液，以去除溶液 中残存的PARP-1。之后，再重新分散在10μL～30μL含有MoO4 2-的酶反应缓冲液(浓度范围为30nmol/L～50nmol/L)中，反应 0.5h～1.5h后进行第二次离心处理。
需要说明的是，本实施例的NAD+计算出的最终浓度范围为 5mmol/L～20mmol/L。应当理解的是，含MoO4 2-的酶反应缓冲液包 括前文提及的浓度范围为5mmol/L～15mmol/L的Tris-HCl与浓度 范围为0.1mol/L～0.2mol/L的NaCl，以及浓度范围为20nmol/L～40nmol/L的MoO4 2-。
进一步需要说明的是，由于本实施例采用紫外-可见光谱进行 检测PARP-1的浓度含量，因此，需要先绘制标准曲线，也就是说， 需要将40μL～60μL的AuNPs-DNA分离体系、5μL～15μL的NAD+以及已知的不同浓度的PARP-1进行温育，离心水洗除去上清液， 并重新分散在含有MoO4 2-的酶反应缓冲液中进行反应并再次离心 处理，对已经不同浓度的PARP-1进行后续检测，得出相应的紫外 吸收峰位移值，以绘制标准曲线，根据标准曲线再得出待测的 PARP-1浓度值。示例性的，一并结合如图5(c)所示，金纳米棒的 紫外吸收峰位移值(Δλ)与不同浓度的PARP-1的校准曲线图， 金纳米棒的紫外吸收峰的位移值与PARP-1浓度呈现明显的线性 关系。也就是说，采用相同的方法对已知浓度的PARP-1进行检测 后，得出标准曲线，再对未知浓度的待测PARP-1进行检测，反应 一段时间后观察记录溶液颜色变化，并记录紫外光谱的峰位置， 根据标准曲线的峰位移值得出PARP-1酶的浓度。
S140、将反应后溶液的上清液加入至金纳米棒中，并加入KI， H2O2和酸性缓冲液进行反应，对反应后的溶液进行检测，以得到 待测PARP-1的浓度。
具体的，本实施例将步骤S130第二次离心处理后的上清液加 入至含有2μL～3μL的KI，5μL～15μL的H2O2和40μL～60μL的金 纳米棒的酸性缓冲液中，在40℃～60℃水浴锅中反应 10min～20min。之后，对反应后的溶液放入紫外-可见光谱仪中进 行检测，并观察溶液的颜色，以得到待测PARP-1的浓度。
需要说明的是，本实施例中金纳米棒与酸性缓冲液的体积比 范围为0.1～1。并且，酸性缓冲液采用0.1mol/L～0.3mol/L的 CH3COONa，pH值范围为3～6。另外，本实施例各物质计算出的 最终浓度范围具体如下：KI浓度范围为10mmol/L～30mmol/L， H2O2浓度范围为10mmol/L～20mmol/L。
进一步需要说明的是，本实施例对于PARP-1浓度的检测原 理如下：如图2所示，由于缓冲溶液中的MoO4 2-可以明显的催化 KI和H2O2刻蚀金纳米棒，在仅含有AuNPs-DNA与NAD+的条件 下，将其加入至含有金纳米棒的溶液中，其含有金纳米棒的溶液 变为浅蓝色，相应的金纳米棒明显变短。但是，当PARP-1存在时， 即含有AuNPs-DNA、NAD+以及PARP-1的条件下，同样的，将 其加入至含有金纳米棒的溶液中，溶液颜色变成棕色，并且，金 纳米棒变短程度明显减弱，与原金纳米棒长度基本一致。这是由 于，在PARP-1存在时，AuNPs-DNA上可以扩增形成的富含PO4 3-的PAR结构，会与溶液中的MoO4 2-结合形成PMo12O40 3-，从而减 少溶液中MoO4 2-的含量，降低对KI和H2O2刻蚀金纳米棒的催化 效率，抑制对金纳米棒的刻蚀，使得溶液的紫外-可见峰发生明显 的蓝移，溶液的颜色也由浅蓝色变成棕色。也就是说，本实施例 将金纳米棒的刻蚀过程与PARP-1浓度检测相结合，有效避免了繁 琐的标记步骤，并且，基于抑制金纳米棒的刻蚀过程而实现对 PARP-1浓度的检测，可通过颜色变化以及紫外-可见峰位移进行 判断PARP-1的浓度值。
本实施的对PARP-1浓度的检测方法基于可视化、无标记的 比色探针的构建更利于PARP-1活性的检测，不需要复杂的操作过 程，更不需要繁琐的标记步骤，仅通过肉眼观察溶液的颜色变化， 就能快速判断实验进程，极大地简化了操作过程，缩短了检测时 间，具有运行成本低、检测快速、简便、选择性好等优点。
下面以具体实施例进行说明具体检测步骤：
实施例1
S110、在250mL的锥形瓶中，先加入30mL的超纯水，再 加入38mL已经提前溶解好的CTAB溶液(0.2mol/L)。锥形瓶 保持32℃恒温，再快速加入598μL三水合氯金酸，摇晃均匀，紧 接着逐滴滴加280μL现配制的硝酸银溶液(0.02mol/L)，边加 边振荡，使溶液混合均匀。随后加入2mL的对苯二酚(0.044g)， 反应5分钟左右，至溶液完全变为无色后，加入2.6mL由冰水现 配的硼氢化钠溶液(0.5mmol/L)，恒温反应12h。反应结束后， 溶液为棕色，离心(13000rpm，20分钟)，去除上清液，再重复 离心一次，最终复溶于超纯水中，室温保存，备用。一并结合图 3(a)所示，本实施例制备得到的金纳米棒呈现均匀的长棒状。
S120、在50μL 13nm的金纳米粒子溶液中加入1mg BSPP 孵育反应12h，离心(13000rpm，18min)，去除上清液。再将 金纳米粒子重新分散在超纯水中，并与3μL 10μmol/L的 HS-ssDNA1反应2h，然后每2小时添加NaCl(20mmol/L)，并 逐渐增加NaCl的浓度以盐老化金纳米粒子，增加其抗盐性，最终 使得溶液中的盐浓度达到200mmol/L。24小时后，将1μL10 mmol/L的HS-PEG加入溶液中反应2小时以封闭金纳米粒子上的 活性位点。最后，将3μL10μmol/L的ssDNA2加入溶液中与 HS-ssDNA1进行杂交反应2h，离心(13000rpm，18min)除去上 清液，保存在酶反应缓冲液中备用。
S130、将50μL的AuNPs-DNA与10μL 100μmol/L的NAD+和不同浓度的PARP-1(0U，0.05U，0.1U，0.2U，0.5U，1U， 1.5U，2U)在37℃温育1.5h，离心(13000rpm，10min)水洗 两次后去除上清液以去除溶液中残存的PARP-1，然后再重新分散 在含有20μL MoO4 2-的酶反应缓冲液中。反应1h后，再次离心 (13000rpm，10min)后，将上清液加入含有2.5μL KI，10μLH2O2和50μL的金纳米棒的醋酸缓冲液中，快速放入已加热好的50℃ 水浴锅中反应15分钟，对反应后的溶液进行检测，以得到PARP-1 的浓度值，即得到PARP-1的活性值。
需要说明的是，本实施例除了对PARP-1酶活性进行检测外， 还在不同实施例中采用上述记载的相同的检测方法做了多个对照 组实验，各实施例的检测结果如下。示例性的，如图3(a)所示， 本实施例制备的比色探针金纳米棒在未做任何处理时呈现均匀的 长棒状，再如图3(b)所示，其中一个实施例中不存在PARP-1时， 溶液中的MoO4 2-可以有效的催化H2O2和KI刻蚀金纳米棒，使得 金纳米棒的形态由长棒状变成短棒状，有的甚至成为圆球状。一 并结合图3(c)所示，另一个实施例中存在PARP-1时，TEM结果 表明，PARP-1对MoO4 2-催化H2O2和KI刻蚀金纳米棒起到了明 显的抑制作用，金纳米棒的形态由长棒状变短的程度大大减小。
进一步的，结合图4所示，图4(a/b/c/d)分别示出了采用不同 组分的探针对MoO4 2-催化H2O2和KI刻蚀金纳米棒的影响紫外- 可见光谱，由此可见，图4(d)对应的实施例中紫外吸收峰位于长 波位置处，图4(a/b/c)对应的实施例的紫外吸收峰均处于短波位置 处，这说明，当溶液中不存在PARP-1时，其溶液中不会形成PAR 结构，相应的，溶液中的MoO4 2-催化H2O2和KI刻蚀金纳米棒的 作用增强，而当同时存在dsDNA、NAD+以及PARP-1的情况下，AuNPs-DNA上可以扩增形成的富含PO4 3-的PAR结构，会与溶液 中的MoO4 2-结合形成PMo12O40 3-，从而减少溶液中MoO4 2-的含量， 降低对KI和H2O2刻蚀金纳米棒的催化效率，使得溶液的紫外-可 见峰发生明显的蓝移现象。
更进一步的，图5示出了金纳米棒随不同浓度PARP-1的变 化结果，其中，由图中a到h分别代表PARP-1的浓度依次为：0U， 0.05U，0.1U，0.2U，0.5U，1U，1.5U，2U。具体地，图5(a) 给出了随着PARP-1浓度的变化，溶液的颜色变化图，溶液的颜色 也由浅蓝色变成棕色。图5(b)显示了随着PARP-1浓度的变化，紫 外-可见光谱变化图，随着PARP-1浓度的增加，其紫外吸收峰向 长波方向移动，发生蓝移现象显著。图5(c)示出了金纳米棒的紫 外吸收峰位移值(Δλ)与不同浓度的PARP-1的校准曲线图，可 见，金纳米棒的紫外吸收峰的位移值与PARP-1浓度呈现明显的线 性关系，范围0.05U～2U，检测限为0.02U。
需要说明的是，为了说明本实施例的检测方法针对PARP-1 进行活性检测具有良好的效果，采用相同的检测方法还对不同活 性酶对金纳米棒刻蚀做了对比实验。具体的，如图6所示，分别 将PARP-1、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖氧化酶(GOX)、谷胱甘 肽(GSH)、辣根过氧化物酶(HRP)对金纳米棒刻蚀的影响做了具体 分析，其中，PARP-1酶对金纳米棒刻蚀后溶液的位移变化值最大， 颜色变成棕色，其他四类酶对金纳米棒的刻蚀影响较弱。也就是 说，采用PARP-1存在时的检测方法对金纳米棒刻蚀的影响最大， 远远高于其他四类活性酶，可见，上述记载的检测方法可应用于 PARP-1活性的可视化检测，具有较高的灵敏性。
基于上述结果，本实施例可通过待测PARP-1抑制MoO4 2-催 化H2O2和KI刻蚀金纳米棒，以使金纳米棒的形态由长棒状变短 的程度大大减小，其对应紫外吸收峰发生蓝移，并通过溶液颜色 变化即可得到待测PARP-1的浓度，即PARP-1的活性。
本发明的第二方面，提供一种PARP-1浓度检测方法的应用， 采用前文记载的方法用于检测人体不同细胞中PARP-1的含量，具 体检测方法参考前文，在此不再赘述。
实施例2
为了验证本实施例的检测方法在实际样品中的应用价值，参 照了前文记载的实施例中建立的分析检测方法分别对正常细胞 (IOSE80)和癌细胞(A2780，MCF-7)的细胞核和细胞质中PARP-1 的含量进行检测，每种细胞数量为500个，实验结果如表1所示。
表1不同细胞中PARP-1的含量检测结果
Figure BDA0002500605710000121
由表1可以得出，癌细胞(A2780，MCF-7)的细胞核和细胞 质中的PARP-1含量均明显高于正常细胞中的PARP-1的含量，可 见，本实施例的检测方法用于检测人体不同细胞中PARP-1的含量 是可行的，且原理简单，无需复杂的操作步骤，操作简单，并且 可以通过肉眼简单识别，对肿瘤的预防检测具有重要意义。
实施例3
进一步的，在另外的实施例中还对人体血清缓冲液中的 PARP-1溶液进行了加标回收实验。具体地，用人体血清缓冲液稀 释获得不同浓度的PARP-1(0.1U、0.3U、0.6U、0.9U)溶液， 进行加标回收实验，结果如表2所示。
表2人体血清缓冲液中不同浓度的PARP-1的加标回收结果
Figure BDA0002500605710000122
由表2可知，采用本实施例的检测方法具有较高的回收率和 较低的相对标准偏差，因此，本实施例的检测方案具有较高的选 择性和很大的实际应用价值。
本发明提供一种PARP-1浓度的检测方法及其应用。与传统 的酶免疫测定(ELISA)和放射性标记方法相比，本发明采用的比 色法能够用肉眼快速地观察溶液颜色的变化从而对PARP-1活性 进行半定量分析，同时操作简单，具有较高的应用价值，而且免 标记省去了许多繁琐的标记步骤。并且，本发明的检测方法主要 通过在酶反应缓冲溶液中加入MoO4 2-，可以明显催化KI和H2O2刻蚀金纳米棒，但是当溶液中存在待测PARP-1时，AuNPs-DNA上可以扩增形成的富含PO4 3-的PAR结构，会与溶液中的MoO4 2-结合形成PMo12O40 3-，从而减少溶液中MoO4 2-的含量，降低对KI 和H2O2刻蚀金纳米棒的催化效率，使得溶液的紫外-可见峰发生 明显的蓝移，溶液的颜色也由浅蓝色变成棕色，可以通过肉眼简 单识别，极大地简化了操作过程，缩短了检测时间。本发明提供 的检测方法原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，无需任 何大型仪器。并且，本发明可将该检测方法应用于对人体细胞中 的PARP-1进行检测，具有很高的选择性和实际应用价值，对肿瘤 的预防检测具有重要意义。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理 而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领 域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况 下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的 保护范围。

Claims (9)

1.一种PARP-1浓度的检测方法，其特征在于，包括：
合成金纳米棒；
合成AuNPs-DNA分离体系；
在所述AuNPs-DNA分离体系中加入NAD+、含MoO4 2-的酶反应缓冲液以及待测PARP-1进行反应；
将反应后溶液的上清液加入至含有2μL～3μL KI，5μL～15μL H2O2和40μL～60μL所述金纳米棒的酸性缓冲液中，在40℃～60℃下反应10min～20min；
对反应后的溶液放入紫外-可见光谱仪中进行检测，并观察溶液的颜色，以得到所述待测PARP-1的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成AuNPs-DNA分离体系，包括：
将金纳米粒子、HS-ssDNA1与NaCl混合反应18h～24h，之后，加入HS-PEG和ssDNA2进行反应，离心处理后，以得到所述AuNPs-DNA分离体系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将金纳米粒子、HS-ssDNA1与NaCl混合反应18h～24h，之后，加入HS-PEG和ssDNA2进行反应，离心处理后，以得到所述AuNPs-DNA分离体系，包括：
将40μL～50μL的金纳米粒子加入0.5mg～1.5mg的BSPP中反应10h～15h，离心除去上清液；
将所述金纳米粒子再次分散在超纯水中，与2μL～4μL的HS-ssDNA1反应1h～3h，并每隔1h～3h添加一次NaCl，以进行混合反应18h～24h，得到盐化后的金纳米粒子溶液；
将1μL～2μL的HS-PEG加入至所述盐化后的金纳米粒子溶液中反应1h～3h，并加入2μL～4μL的ssDNA2与所述HS-ssDNA1进行杂交反应1h～3h，离心除去上清液，以得到所述AuNPs-DNA分离体系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述在所述AuNPs-DNA分离体系中加入NAD+、含MoO4 2-的酶反应缓冲液以及待测PARP-1进行反应，包括：
将40μL～60μL的所述AuNPs-DNA分离体系、5μL～15μL的NAD+和待测PARP-1在30℃～45℃温育1h～2h，第一次离心水洗去除上清液；
之后，分散在10μL～30μL含MoO4 2-的酶反应缓冲液中，反应0.5h～1.5h后进行第二次离心处理。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述NAD+浓度范围为80μmol/L～120μmol/L；
所述含MoO4 2-的酶反应缓冲液浓度范围为30nmol/L～50nmol/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含MoO4 2-的酶反应缓冲液包括：浓度范围为20nmol/L～40nmol/L的MoO4 2-、浓度范围为5mmol/L～15mmol/L的Tris-HCl，以及浓度范围为0.1mol/L～0.2mol/L的NaCl。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述金纳米棒与所述酸性缓冲液的体积比范围为0.1～1。
8.根据权利要求3至6任一项所述的方法，其特征在于，所述HS-ssDNA1浓度范围为5μmol/L～15μmol/L；
所述NaCl浓度范围为10mmol/L～30mmol/L；
所述HS-PEG浓度范围为5mmol/L～15mmol/L；
所述ssDNA2浓度范围为5μmol/L～15μmol/L。
9.一种PARP-1浓度检测方法的应用，其特征在于，采用权利要求1至8任一项所述的方法用于检测人体细胞中PARP-1的含量。
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