CN118090378A - 一种套染的染色方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种套染的染色方法及应用。该套染染色方法，在同一张切片上先进行Gordon银氨染色，再进行Masson染色，并省略了Masson染色中的苏木素染色步骤，实现了将两种染色染方法合并套染，获得良好的染色效果，提高了工作效率。该套染染色方法所得的切片可在同一视野下观察肝组织的网状纤维、胶原纤维和肌纤维等变化，方便了阅片及档案管理。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种套染的染色方法及应用。
背景技术
肝纤维化（hepaticfibrosis）或肝硬化（cirrhosis）在国际疾病分类-11（internationalclassificationofdiseases，ICD-11）为DB93.0。肝纤维化是指肝脏细胞外基质（即胶原、糖蛋白和蛋白多糖等）的弥漫性过度沉积与异常分布，是肝脏对慢性损伤的病理性修复反应，是各种慢性肝病向肝硬化发展过程中的关键步骤和影响慢性肝病预后的重要环节。肝纤维化进一步发展可引起肝小叶结构紊乱，肝细胞结节性再生，形成假小叶结构即肝硬化，临床上出现肝功能减退和门静脉高压症表现。
目前，判断肝脏的炎症和纤维化程度的常用的方法是Gordon银氨染色和Masson染色，其中，Gordon银氨染色显示肝组织内的网状纤维；Masson染色显示肝脏组织内胶原纤维、肌纤维等的结构变化情况。但是，现有技术中，常将上述两种染色方法分别染色在2张切片上。因此，不能在同一视野下，同时观察网状纤维支架分布和胶原纤维增生情况；同时肝脏穿刺标本较为珍贵，而在两张玻片上染色易造成标本的浪费，且在观察比对两种染色切片时，需要反复更换切片，导致阅片不方便；最后，两张玻片上染色还会增加人力和耗材成本。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种套染的染色方法及应用。该方法将Gordon银氨染色和Masson染色进行改良后，合并套染在一张切片上，获得良好的染色效果，可在同一视野下观察肝组织的网状纤维、胶原纤维、肌纤维等变化，降低受检者有创采集样本的量，减轻受检者负担。
为解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种套染的染色方法，在同一切片上先后进行Gordon银氨染色和Masson染色，其中，在Masson染色过程中省略苏木素染色步骤。
结合第一方面，在切片上首先进行Gordon银氨染色操作，然后将所述切片浸入丽春红酸性品红染液浸染，再在磷钼酸水溶液分化、苯胺蓝染液染色、冰醋酸水溶液冲洗切片，直至切片无蓝色脱出，封固，得套染切片。
本发明实施例提供的套染染色方法，通过在同一张切片上先进行Gordon银氨染色，再进行Masson染色，并省略了Masson染色中苏木素染色步骤，实现了将两种染色染方法合并套染，可在同一视野下观察到网状纤维呈黑色，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，定位准确，染色清晰，利于观察不同纤维化程度改变，获得良好的染色效果。从切片、烤片和染色处理等方面提高了工作效率；还节约了玻片和实验相关耗材和人力成本；还可节约珍贵切片一张以用于其他检测，避免了受检者的再次有创采集样本，减轻患者负担。
结合第一方面，具体包括以下步骤：
S1、取一石蜡组织的切片，脱蜡至水，再经以下处理：高锰酸钾氧化、草酸水溶液漂白、硫酸铁胺水溶液浸泡切片媒染；
S2、在经步骤S1处理后的切片上滴加Gordon银氨染液、避光5min，滴加新配制的甲醛染液还原，再经氯化金水溶液调色、硫代硫酸钠水溶液固定；
S3、切片浸入丽春红酸性品红染液浸染，然后在磷钼酸水溶液分化、再经苯胺蓝染液染色、冰醋酸水溶液冲洗切片，直至切片无蓝色脱出；
S4、切片经乙醇稍洗、无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，得套染切片。
第二方面，本发明还提供一种上述套染的染色方法在组织染色中的应用。
可选的，上述套染的染色方法在肝脏组织染色中的应用。
本发明实施例中将Gordon银氨染色和Masson染色染在同一张肝脏组织切片上，使肝组织内的网状纤维、胶原纤维和肌纤维等结构变化情况显示在同一张组织切片上，实现在同一视野下观察网状纤维支架分布和胶原纤维增生变化情况，极大提高了阅片效率，且减少受检者有创采集样本的量。
附图说明
图1为本发明的实施例1的肝脏组织切片镜下染色图；
图2为本发明的对比例1的肝脏组织切片镜下染色图；
图3为本发明的对比例2的肝脏组织切片镜下染色图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
目前的临床检测中，判断肝脏的炎症和纤维化程度的常用的方法是对肝脏组织制备2个切片，在不同的切片上分别进行Gordon银氨染色和Masson染色。其中，Gordon银氨染色显示肝组织内的网状纤维；Masson染色显示肝脏组织内胶原纤维、肌纤维等结构变化情况。而肝脏穿刺标本较为珍贵，而在两张玻片上染色易造成标本的浪费，且观察比对两种染色切片时，需要反复更换切片，导致阅片不方便。基于此，发明人在研发过程中，试图将两种染色方法进行合并套染，并做了大量的尝试。
若直接将两种方法套染，无论是先Masson染色、后Gordon银氨染色，还是先Gordon银氨染色、再Masson染色，均无法实现切片染色清晰。在大量实验摸索中发明人发现，若先Gordon银氨染色、再进行Masson染色，在Masson染色过程中，省去苏木素染色步骤，直接进行丽春红酸性品红染液浸染及后续的Masson染色步骤，则制备的切片网状纤维呈黑色或黑灰色，胶原纤维呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞染红色，染色清晰、定位准确。
即在切片上首先进行Gordon银氨染色操作，然后将所述切片浸入丽春红酸性品红染液浸染，再在磷钼酸水溶液分化、苯胺蓝染液染色、冰醋酸水溶液冲洗切片，直至切片无蓝色脱出，中性树胶封固，得套染切片。
以下结合具体的实施例进行说明。需要说明的是，本发明实施例中，如无特别说明，采用溶液浓度均为质量浓度，采用的试剂均为市售试剂。
实施例1
本发明提供一种套染的染色方法，包括以下步骤：
S1、取一石蜡组织的切片，脱蜡至水，再经以下处理：高锰酸钾氧化、草酸水溶液漂白、硫酸铁胺水溶液浸泡切片媒染。
具体的，S11、将一石蜡组织的切片在65℃烤片30min，脱蜡至水；S12、切片浸入0.5%高锰酸钾水溶液氧化5min，然后用蒸馏水冲洗；S13、用2%草酸水溶液漂白切片1min，至切片组织无色时终止，再用蒸馏水冲洗；S14、用2%硫酸铁胺水溶液浸泡切片媒染5min，用蒸馏水冲洗。
S2、在经过步骤S1处理后的切片上滴加Gordon银氨染液、并避光保持5min，滴加新配制的甲醛染液进行还原，再用氯化金水溶液调色、并用硫代硫酸钠水溶液固定。
具体的，S21、在切片上滴加Gordon银氨染液避光5min，蒸馏水冲洗；S22、继续在切片上滴加新配制的10%甲醛染液，还原1min，蒸馏水冲洗；S23、切片浸入0.2%氯化金水溶液调色1min，蒸馏水冲洗；S24、切片浸入5%硫代硫酸钠水溶液固定2min，蒸馏水冲洗。
其中，Gordon银氨染液主要成分为硝酸银和氨水，溶液中带正电荷的二氨合银离子被组织吸附、与组织中的蛋白结合，再经甲醛还原成黑色金属银沉积于组织内及表面。
Gordon银氨染液的配制方法如下：10%硝酸银水溶液2ml,逐滴滴入氢氧化铵，边滴边摇动容器。先出现沉淀物，继续滴入氢氧化铵至所形成的沉淀物恰好溶解。加入3%氢氧化钠水溶液2mL，再次形成沉淀。继续滴入氢氧化铵，直至沉淀物又再恰好溶解。最后加蒸馏水至40mL，配好后用棕色砂塞瓶盛装，放于冰箱内保存，用前取出恢复到室温。
S3、切片浸入丽春红酸性品红染液浸染，然后在磷钼酸水溶液分化、再经苯胺蓝染液染色、冰醋酸水溶液冲洗切片，直至切片无蓝色脱出。
具体的，S31、切片浸入丽春红酸性品红染液浸染5min，蒸馏水冲洗；S32、切片浸入1%磷钼酸水溶液分化5-10min，倾去染液；S33、切片浸入苯胺蓝染液3-5min；S34、1%冰醋酸水溶液冲洗切片，分化数秒，直至切片无蓝色脱出。
其中，丽春红酸性品红染液的主要成分为丽春红、酸性品红、冰醋酸；
苯胺蓝染液的主要成分为苯胺蓝粉剂、冰醋酸水溶液。
S4、切片经乙醇稍洗、无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，得套染切片。
切片经95%乙醇稍洗，再依次使用体积分数为95％、95％、100％、100％的乙醇梯度脱水，直至二甲苯透明无水乙醇脱水后入二甲苯透明，中性树胶封固。
图1为本发明的实施例1的肝脏组织切片镜下染色图；从图1可以看到，镜下观察实施例1的肝脏组织切片，发现网状纤维和胶原纤维、肌纤维着色良好，可在同一视野下观察到网状纤维呈黑色，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。定位准确，染色清晰，有利于观察肝脏组织的纤维化程度的改变。
对比例1
与实施例1的区别为：按照常规流程先进行Masson染色，再进行Gordon银氨染色。具体包括以下步骤：
（1）石蜡组织切片在65℃烤片30min，脱蜡至水；
（2）切片浸入体积比为1：1的苏木素A液、B液的混合染液中染色5min，蒸馏水冲洗；
（3）切片浸入丽春红酸性品红染液中染色5min，蒸馏水冲洗；
（4）切片浸入1%磷钼酸水溶液分化5min，倾去染液；
（5）切片浸入苯胺蓝染液3min；
（6）1%冰醋酸水溶液冲洗切片，分化数秒，直至切片无蓝色脱出；
（7）切片浸入0.5%高锰酸钾水溶液氧化5min，蒸馏水冲洗；
（8）2%草酸水溶液漂白切片1min，至切片组织无色时终止，蒸馏水冲洗；
（9）2%硫酸铁胺水溶液浸泡切片媒染5min，蒸馏水冲洗；
（10）在切片上滴加Gordon银氨染液避光5min，蒸馏水冲洗；
（11）继续在切片上滴加新配制的10%甲醛染液，还原1min，蒸馏水冲洗；
（12）切片浸入0.2%氯化金调色1min，蒸馏水冲洗；
（13）切片浸入5%硫代硫酸钠水溶液固定2min，蒸馏水冲洗；
（14）切片经95%乙醇稍洗、无水乙醇脱水后入二甲苯透明，中性树胶封固。
本实施例中，苏木素A液主要成分是苏木素，质量浓度为1%；苏木素B液主要成分是三氯化铁，质量浓度为5%。下同。
图2为本发明对比例1的肝脏组织切片镜下染色图；从图2中可以看出，镜下观察对比例2的肝脏组织切片，发现丽春红和苯胺蓝着色不佳。发明人分析可能是因为：Gordon银氨色（网状纤维染色）中用到了高锰酸钾试剂，高锰酸钾具有氧化性，影响了Masson染色的效果，使丽春红和苯胺蓝着色不佳。
对比例2
与实施例1的区别为：改变染色顺序，即先进行Gordon银氨染色，再进行Masson染色。具体包括以下步骤：
（1）石蜡组织切片在65℃烤片30min，脱蜡至水；
（2）切片浸入0.5%高锰酸钾水溶液氧化5min，蒸馏水冲洗；
（3）2%草酸水溶液漂白切片1min，至切片组织无色时终止，蒸馏水冲洗；
（4）2%硫酸铁胺水溶液浸泡切片媒染5min，蒸馏水冲洗；
（5）在切片上滴加Gordon银氨染液避光5min，蒸馏水冲洗；
（6）继续在切片上滴加新配制的10%甲醛染液，还原1min，蒸馏水冲洗；
（7）切片浸入0.2%氯化金调色1min，蒸馏水冲洗；
（8）切片浸入5%硫代硫酸钠水溶液固定2min，蒸馏水冲洗；
（9）切片浸入体积比为1：1苏木素A、B液的混合染液中染色5min，蒸馏水冲洗；
（10）切片浸入丽春红酸性品红染液中染色5min，蒸馏水冲洗；
（11）切片浸入1%磷钼酸水溶液分化5min，倾去染液；
（12）切片浸入苯胺蓝染液3min；
（13）1%冰醋酸水溶液冲洗切片，分化数秒，直至切片无蓝色脱出；
（14）切片经95%乙醇稍洗、无水乙醇脱水后入二甲苯透明，中性树胶封固。
图3为本发明的对比例2的肝脏组织切片镜下染色图。从图3可知，镜下观察对比例2的肝脏组织切片，发现在细胞中胶原纤维、肌纤维着色较浅，网状纤维着色较深，背景色较深，考虑为Masson试剂中的苏木素复染导致此结果。
综上，实施例1先进行Gordon银氨染色，再进行Masson染色，并省略了Masson染色中苏木素染色步骤，所得切片的染色效果优于对比例1-2，网状纤维呈黑色或黑灰色，胶原纤维呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞染红色，染色清晰、定位准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种套染的染色方法，其特征在于，在同一切片上先后进行Gordon银氨染色和Masson染色，其中，在Masson染色过程中省略苏木素染色步骤。
2.根据权利要求1所述的套染的染色方法，其特征在于，在切片上首先进行Gordon银氨染色操作，然后将所述切片浸入丽春红酸性品红染液浸染，再在磷钼酸水溶液分化、苯胺蓝染液染色、冰醋酸水溶液冲洗切片，直至切片无蓝色脱出，中性树胶封固，得套染切片。
3.根据权利要求1或2所述的套染的染色方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、取一石蜡组织的切片，脱蜡至水，再经以下处理：高锰酸钾氧化、草酸水溶液漂白、硫酸铁胺水溶液浸泡切片媒染；
S2、在经步骤S1处理后的切片上滴加Gordon银氨染液、避光5min，滴加新配制的甲醛染液还原，再经氯化金水溶液调色、硫代硫酸钠水溶液固定；
S3、切片浸入丽春红酸性品红染液浸染，然后在磷钼酸水溶液分化、再经苯胺蓝染液染色、冰醋酸水溶液冲洗切片，直至切片无蓝色脱出；
S4、切片经95%乙醇稍洗、无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，得套染切片。
4.根据权利要求3所述的套染的染色方法，其特征在于，步骤S1中，具体包括：
S11、将一石蜡组织的切片在65℃烤片30min，脱蜡至水；
S12、切片浸入0.5%高锰酸钾水溶液氧化5min，蒸馏水冲洗；
S13、2%草酸水溶液漂白切片1min，至切片组织无色时终止，蒸馏水冲洗；
S14、2%硫酸铁胺水溶液浸泡切片媒染5min，蒸馏水冲洗；
步骤S2中，具体包括：
S21、在切片上滴加Gordon银氨染液避光5min，蒸馏水冲洗；
S22、继续在切片上滴加新配制的10%甲醛染液，还原1min，蒸馏水冲洗；
S23、切片浸入0.2%氯化金水溶液调色1min，蒸馏水冲洗；
S24、切片浸入5%硫代硫酸钠水溶液固定2min，蒸馏水冲洗。
5.根据权利要求3所述的套染的染色方法，其特征在于，步骤S3中，具体包括：
S31、切片浸入丽春红酸性品红染液浸染5min，蒸馏水冲洗；
S32、切片浸入1%磷钼酸水溶液分化5-10min，倾去染液；
S33、切片浸入苯胺蓝染液3-5min；
S34、1%冰醋酸水溶液冲洗切片，分化数秒，直至切片无蓝色脱出。
6.根据权利要求3所述的套染的染色方法，其特征在于，步骤S4中，所述无水乙醇脱水为依次使用体积分数为95％、95％、100％、100％的乙醇梯度脱水，直至二甲苯透明。
7.一种权利要求1-6所述套染的染色方法在组织染色中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述套染的染色方法在肝脏组织染色中的应用。
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