CN112857948A - 一种苏木精—伊红改良试剂及其快速染色法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苏木精—伊红改良试剂，按重量百分比分别包括：HE‑苏木素：硫酸铝钾0.14‑0.20％；纯化水40‑60％；苏木素0.024‑0.03％；无水乙醇0.15‑0.19％；碘酸钠0.0024‑0.0033％；柠檬酸0.024‑0.25％；丙三醇0.2‑0.4％；HE‑伊红：酒精50‑70％；纯化水15‑30％；冰醋酸0.06‑0.08％；伊红0.01‑0.03％。还公开了一种苏木精—伊红快速染色法，使用该试剂进行染色配置简单快捷，操作简单，耗时短，适合大批量染色，而且应用范围广，不但可以对细胞块切片或者组织切片进行染色，还可以对脱落细胞进行染色。
Description
技术领域
本发明属于涉及检测方法技术领域，尤其涉及一种苏木精—伊红改良试剂及其快速染色法。
背景技术
1.原理：苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
构成组织内蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。
脱氧核糖核酸(DNA)两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。伊红是细胞浆的良好染料。
由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。故各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来
2.试剂的配置：
2.1传统伊红配置：称取伊红Y 0.5～1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95％酒精(即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可)100毫升溶解。
2.2传统苏木素配置：苏木素染液配方:(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g、无水乙醇100ml、硫酸铝钾150g、蒸馏水2000ml、碘酸钠1.2g、冰醋酸120ml、甘油900ml配制方法:将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。
2.3 1％盐酸酒精分化液:将1毫升浓盐酸加入99毫升70％酒精中即可。
染色结果:细胞核蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色。
4.实验结果：
细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。
着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。
H-E染色评定标准：
(1)切片完整，厚度4-6微米，厚薄均匀，无皱褶无刀痕；
(2)染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。
以上现有技术存在以下问题：
(1)伊红的配置过程过于繁琐复杂；
(2)实验历时长，只适用于传统染色流程；
(3)只适用于对细胞块或者组织片进行染色。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种苏木精—伊红改良试剂及应用其进行染色的方法，使用该试剂进行染色配置简单快捷，操作简单，耗时短，适合大批量染色，而且应用范围广，不但可以对细胞块切片或者组织切片进行染色，还可以对脱落细胞进行染色。
本专利方案提供一种苏木精—伊红改良试剂，按重量百分比分别包括：
HE-苏木素：
硫酸铝钾0.14-0.20％；
纯化水40-60％；
苏木素0.024-0.03％；
无水乙醇0.15-0.19％；
碘酸钠0.0024-0.0033％；
柠檬酸0.024-0.25％；
丙三醇0.2-0.4％；
HE-伊红：
酒精50-70％；
纯化水15-30％；
冰醋酸0.06-0.08％；
伊红0.01-0.03％。
进一步地，配置所述HE-苏木素时，先将所述硫酸铝钾溶于所述纯化水，所述苏木素溶于所述无水乙醇，后再与其余各组分充分混匀；配置所述HE-伊红时，将所述冰醋酸及所述伊红溶解于所述纯化水及酒精，并混合均匀。
进一步地，所述HE-苏木素的组分按重量百分比具体为：硫酸铝钾0.15％-0.17％，苏木素0.024％-0.027％，碘酸钠0.0024％-0.0028％，纯化水52-57％，无水乙醇0.15-0.17％，柠檬酸0.024％，丙三醇0.3-0.34％；所述HE-伊红的组分按重量百分比具体为：冰醋酸0.065％-0.075％，伊红0.02％-0.028％，酒精62-67％，纯化水18-22％。
进一步地，所述HE-苏木素的组分按重量百分比具体为：硫酸铝钾0.16％，苏木素0.024％，碘酸钠0.0024％，纯化水55％，无水乙醇0.16％，柠檬酸0.024％，丙三醇0.32％；所述HE-伊红的组分按重量百分比具体为：冰醋酸0.071％，伊红0.028％，酒精65％，纯化水20％。
还公开了一种苏木精—伊红快速染色法，该染色法使用权利要求1-3任一项所述的苏木精—伊红改良试剂进行染色，包括以下步骤：
①让细胞通过重力自然沉降到玻片上，保留其三维立体结构；
②使用无水乙醇将细胞固定在玻片上；
③使用缓冲液冲洗玻片，直至其PH值适合所述HE-苏木素进行染色；
④使用所述HE-苏木素对细胞核进行染色；
⑤再次使用缓冲液清洗玻片，清洗细胞中的多余染色；
⑥使用无水乙醇清洗玻片，创造一个适合伊红着色的无水环境；
⑦使用所述HE-伊红对细胞浆进行染色；
⑧使用无水乙醇清洗多余染色。
进一步地，还包括：⑨使用无水乙醇对细胞进行脱水。
进一步地，还包括：⑩用二甲苯对细胞进行透明化处理。
进一步地，所述步骤①持续8-12分钟，所述步骤②持续1-3秒，所述步骤③持续8-12秒，所述步骤④持续2-4分钟，所述步骤⑤-⑧均持续8-12秒，所述步骤⑨持续20-40秒，所述步骤⑩持续8-12分钟。
进一步地，所述步骤①持续10分钟，所述步骤②持续2秒，所述步骤③持续10秒，所述步骤④持续3分钟，所述步骤⑤-⑧均持续10秒，所述步骤⑨持续30秒，所述步骤⑩持续10分钟。
本专利的改进带来如下优点：
(1)本申请首创的苏木精—伊红改良试剂及应用其进行染色的快速染色法，与现有技术相比，试剂的配置方法简单快捷，操作简便，只需要普通的器具即可，无需复杂的机器设备，耗时大为缩短，也同样适用于传统的染色流程，实用性强，具有很高的经济效益。
(2)不但试剂的配置过程简单，染色方法同样做了非常有益的改进，操作流程相比现有技术大幅度简化，染色耗时缩小到现有技术耗时的1/4左右。而且同时适用于手工或者设备制片染色，可应用于沉降式液基制片设备上，染色效果优良清晰，整个上色有别于传统现有技术，适合大批量生产。
(3)本试剂应用了碘酸钠，若碘酸钠配置不当，则碘酸钠过量会破坏苏木红(苏木精氧化后的产物，苏木精需要氧化为苏木红后才能成为染色剂)，导致苏木精染液染色力减弱。该发明的碘酸钠与苏木精比例为0.1:1，碘酸钠与苏木精用量小，不会形成氧化膜，由于染色力减弱不会过染，便不需要跟传统现有技术那样先使用盐酸分化后再返蓝。且还应用了柠檬酸与之搭配，柠檬酸是一种强酸，能有效延缓氧化，使之不会过染，从而达到快速染色的效果。
(4)伊红以往只是单纯的一种醇溶或者水溶原料的配置，水溶性伊红溶液呈绿色荧光，组织学用于上皮细胞、肌肉纤维和细胞浆染色。醇溶性伊红能溶于碱，微溶于乙醇，不溶于水。本发明主要用于显示各种组织，细胞，细胞块的正常成分和病变的形态结构，染色后能进行全面观察。
(5)细胞中的细胞核是由酸性物质组成，它与碱性染料(苏木素)的亲和力较强，而细胞浆则相反，它含有碱性物质和酸性染料(伊红)的亲和力较大。因此，细胞，组织切片，细胞块切片经本试剂染色后，细胞核被苏木素染成鲜明的红紫色，细胞浆、肌纤维、胶元纤维等呈不同程度的红色，红细胞则呈橙红色。
(6)该试剂不但适用于现有技术中的细胞块或者组织片进行染色，还可以对现有技术无法染色的脱落细胞进行快速染色，适用范围广。
(7)以往传统HE染色是通过人工操作染色，效率低，耗时长，1小时制片24张。本申请很好地解决了这些问题，对量大的脱落细胞液基制片，除了手工制片，还能应用于沉降式设备上，设备全自动制片染色，提高出片率，1小时能达64张。
附图说明
图1为使用现有技术对脱落细胞进行染色的显微图；
图2为本申请实施例2对脱落细胞进行染色的显微图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本申请实施例1一种苏木精—伊红改良试剂按重量百分比分别包括：
HE-苏木素：
硫酸铝钾0.14-0.20％；
纯化水40-60％；
苏木素0.024-0.03％；
无水乙醇0.15-0.19％；
碘酸钠0.0024-0.0033％；
柠檬酸0.024-0.25％；
丙三醇0.2-0.4％；
先将硫酸铝钾溶于纯化水，苏木素溶于无水乙醇，后再与其余各组分充分混匀即可；
HE-伊红：
酒精50-70％；
纯化水15-30％；
冰醋酸0.06-0.08％；
伊红0.01-0.03％；
将冰醋酸及伊红溶解于纯化水及酒精中，并混合均匀即可。
HE-苏木素的组分按重量百分比优选为：硫酸铝钾0.15％-0.17％，苏木素0.024％-0.027％，碘酸钠0.0024％-0.0028％，纯化水52-57％，无水乙醇0.15-0.17％，柠檬酸0.024％，丙三醇0.3-0.34％；HE-伊红的组分按重量百分比优选为：冰醋酸0.065％-0.075％，伊红0.02％-0.028％，酒精62-67％，纯化水18-22％。
具体的，HE-苏木素的组分按重量百分比为：硫酸铝钾0.16％，苏木素0.024％，碘酸钠0.0024％,纯化水55％，无水乙醇0.16％，柠檬酸0.024％，丙三醇0.32％；HE-伊红的组分按重量百分比为：冰醋酸0.071％，伊红0.028％，酒精65％，纯化水20％。
本申请实施例2一种苏木精—伊红快速染色法，该染色法使用实施例1所述的苏木精—伊红改良试剂进行染色，包括以下步骤：
①让细胞通过重力自然沉降到玻片上，保留其三维立体结构；
②使用无水乙醇将细胞固定在玻片上；
③使用缓冲液冲洗玻片，直至其PH值适合HE-苏木素进行染色；
④使用HE-苏木素对细胞核进行染色；
⑤再次使用缓冲液清洗玻片，清洗细胞中的多余染色；
⑥使用无水乙醇清洗玻片，创造一个适合伊红着色的无水环境；
⑦使用所述HE-伊红对细胞浆进行染色；
⑧使用无水乙醇清洗多余染色；
⑨使用无水乙醇对细胞进行脱水；
⑩用二甲苯对细胞进行透明化处理。
步骤①持续8-12分钟，步骤②持续1-3秒，步骤③持续8-12秒，步骤④持续2-4分钟，步骤⑤-⑧均持续8-12秒，步骤⑨持续20-40秒，步骤⑩持续8-12分钟。
优选地，步骤①持续10分钟，步骤②持续2秒，步骤③持续10秒，步骤④持续3分钟，步骤⑤-⑧均持续10秒，步骤⑨持续30秒，步骤⑩持续10分钟。
作为对比，分别使用现有技术及本实施例对脱落细胞进行染色，使用现有技术染色后的显微图可见图1，使用本实施例染色后的显微图可见图2。
由图1可以看出现有技术应用于脱落细胞的图片在显微镜下观察，核浆染色过深，无法辩别核内信息，从而影响诊断；而图2在显微镜下观察清晰，核浆分明，有利于诊断。
还可以使用现有技术常规HE染色流程与本实施例的流程用时进行对比，如表1：
表1
由表1可以看出，本申请实施例的整个染色流程用时只需21分钟25秒，相对于现有技术的染色用时86分钟，整个染色流程流程用时只需原来的1/4即可，染色效率明显提高，经济效益显著。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种苏木精—伊红改良试剂，其特征在于，按重量百分比分别包括：HE-苏木素：
硫酸铝钾0.14-0.20％；
纯化水40-60％；
苏木素0.024-0.03％；
无水乙醇0.15-0.19％；
碘酸钠0.0024-0.0033％；
柠檬酸0.024-0.25％；
丙三醇0.2-0.4％；
HE-伊红：
酒精50-70％；
纯化水15-30％；
冰醋酸0.06-0.08％；
伊红0.01-0.03％。
2.根据权利要求1所述的一种苏木精—伊红改良试剂，其特征在于，配置所述HE-苏木素时，先将所述硫酸铝钾溶于所述纯化水，所述苏木素溶于所述无水乙醇，后再与其余各组分充分混匀；配置所述HE-伊红时，将所述冰醋酸及所述伊红溶解于所述纯化水及酒精，并混合均匀。
3.根据权利要求1所述的一种苏木精—伊红改良试剂，其特征在于，所述HE-苏木素的组分按重量百分比具体为：硫酸铝钾0.15％-0.17％，苏木素0.024％-0.027％，碘酸钠0.0024％-0.0028％，纯化水52-57％，无水乙醇0.15-0.17％，柠檬酸0.024％，丙三醇0.3-0.34％；所述HE-伊红的组分按重量百分比具体为：冰醋酸0.065％-0.075％，伊红0.02％-0.028％，酒精62-67％，纯化水18-22％。
4.根据权利要求3所述的一种苏木精—伊红改良试剂，其特征在于，所述HE-苏木素的组分按重量百分比具体为：硫酸铝钾0.16％，苏木素0.024％，碘酸钠0.0024％，纯化水55％，无水乙醇0.16％，柠檬酸0.024％，丙三醇0.32％；所述HE-伊红的组分按重量百分比具体为：冰醋酸0.071％，伊红0.028％，酒精65％，纯化水20％。
5.一种苏木精—伊红快速染色法，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的苏木精—伊红改良试剂进行染色，包括以下步骤：
①让细胞通过重力自然沉降到玻片上，保留其三维立体结构；
②使用无水乙醇将细胞固定在玻片上；
③使用缓冲液冲洗玻片，直至其PH值适合所述HE-苏木素进行染色；
④使用所述HE-苏木素对细胞核进行染色；
⑤再次使用缓冲液清洗玻片，清洗细胞中的多余染色；
⑥使用无水乙醇清洗玻片，创造一个适合伊红着色的无水环境；
⑦使用所述HE-伊红对细胞浆进行染色；
⑧使用无水乙醇清洗多余染色。
6.根据权利要求5所述的一种苏木精—伊红快速染色法，其特征在于，还包括：⑨使用无水乙醇对细胞进行脱水。
7.根据权利要求6所述的一种苏木精—伊红快速染色法，其特征在于，还包括：⑩用二甲苯对细胞进行透明化处理。
8.根据权利要求5-7任一项所述的一种苏木精—伊红快速染色法，其特征在于，所述步骤①持续8-12分钟，所述步骤②持续1-3秒，所述步骤③持续8-12秒，所述步骤④持续2-4分钟，所述步骤⑤-⑧均持续8-12秒，所述步骤⑨持续20-40秒，所述步骤⑩持续8-12分钟。
9.根据权利要求8所述的一种苏木精—伊红快速染色法，其特征在于，所述步骤①持续10分钟，所述步骤②持续2秒，所述步骤③持续10秒，所述步骤④持续3分钟，所述步骤⑤-⑧均持续10秒，所述步骤⑨持续30秒，所述步骤⑩持续10分钟。
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