CN107312084B - 一种基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺 - Google Patents

一种基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺，包括以下步骤：(1)预处理，将小黄鱼鱼鳞冲洗干净，以5％的氢氧化钠浸泡22h；用自来水冲洗至洗液为中性，以10％的柠檬酸浸泡2h；再用水冲洗至洗液为中性，置于40℃电热恒温鼓风干燥箱中恒温处理8h，最后置于粉碎机中粉碎至粉末，获得小黄鱼鱼鳞粉；(2)将小黄鱼鱼鳞粉，分别按1:13质量体积比的料液比于:66.5℃恒温水浴锅中浸提246min，得到胶原蛋白浸提液；(3)分离得到小黄鱼鱼鳞胶原蛋白粗提产物。本发明的优点是能基本保持了其原有的蛋白质结构且胶原蛋白提取纯度高。

Description

一种基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺
技术领域
本发明涉及一种生物提取工艺，具体是指基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺。
背景技术
近年来，胶原蛋白因具有独特的生物学特性，既与细胞的分化、增生和伤口愈合等有关，同时也与生物免疫特性等有关而成为国内外研究的热点之一。水产品中胶原蛋白含量占鱼体总蛋白含量的25-30％，主要分布于鱼鳞和鱼皮中，且鱼鳞、鱼皮中的粗胶原蛋白就约占80％，而一般水产加工企业却往往将这部分作为下脚料扔掉；同时大部分低值鱼虾也含有丰富的蛋白质，因此蛋白源的开发利用已成为低值鱼虾和水产加工下脚料深度利用的主要途径。
研究表明，将鱼鳞脱色后，经过酸碱处理等工艺，就可将鱼鳞胶原蛋白加工成具有滋阴止血和润肺补肾等独特功能的鱼鳞明胶。另外，利用蛋白酶水解鱼鳞后，可以得到寡肽和游离氨基酸制品。研究表明这类鱼鳞酶解液具有抗氧化、防衰老、降血压和降低胆固醇的功能。因而，利用我国丰富的鱼鳞资源，加大鱼鳞胶原蛋白的研发，对促进我国鱼鳞胶原蛋白产品产业化发展具有现实积极意义。随着我国科技进步与产业发展，鱼鳞胶原蛋白具有广阔的发展前途与应用前景。
目前鱼鳞胶原蛋白的提取方法概括起来分为五种：即热水浸提、酸法浸提、碱法浸提、盐法与酶法浸提等。其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白质从其它蛋白质中分离出来，在实际的提取过程中这几种方法之间有结合。
小黄鱼(Larimichthys polyactis)又名小黄花鱼，脊椎动物，硬骨鱼纲，石首鱼科，又名：小鲜、大眼、花色、小黄瓜、古鱼、黄鳞鱼、小春色、金龙、厚鳞仔，也叫“黄花鱼”、“小黄花”。体形似大黄鱼，但头较长，眼较小，鳞片较大，尾柄短而宽，背鳍起点至侧线间具5-6行鳞，金黄色。小黄鱼作为我国东部地区的重要的水产品，而大量出现在市民的餐桌，但是有关小黄鱼的鱼鳞的胶原蛋白提取工艺却未有研究。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种能基本保持了其原有的蛋白质结构且胶原蛋白提取纯度高的基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺。
为实现上述目的，本发明的技术方案是一种基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺，该方法为一种热水法提取，包括以下步骤：
(1)预处理，将小黄鱼鱼鳞冲洗干净，以5％的氢氧化钠浸泡22h；用自来水冲洗至洗液为中性，以10％的柠檬酸浸泡2h；再用水冲洗至洗液为中性，置于40℃电热恒温鼓风干燥箱中恒温处理8h，最后置于粉碎机中粉碎至粉末，获得小黄鱼鱼鳞粉；
(2)将小黄鱼鱼鳞粉，分别按1:13质量体积比的料液比于:66.5℃恒温水浴锅中浸提246min，得到胶原蛋白浸提液；
(3)对胶原蛋白浸提液进行4000rpm离心20min，将清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液最终NaCl浓度为0.9mol/L，搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃冰箱中静置6h后在4℃，4000rpm下离心20min，得到沉淀物，沉淀物是提取出的粗胶原蛋白，再将沉淀物用0.05mol/L的柠檬酸溶解并在截留分子量为1.4kD的透析袋中透析3天，至用0.1mol/L的HgN03检验外液中无Cl-为止，透析外液为纯净水，最后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，则得到小黄鱼鱼鳞胶原蛋白粗提产物。
本发明还提供了一种基于酶解法的胶原蛋白提取方案，其技术方案是包括以下步骤：
(1)预处理，将小黄鱼鱼鳞冲洗干净，以5％的氢氧化钠浸泡22h；用自来水冲洗至洗液为中性，以10％的柠檬酸浸泡2h；再用水冲洗至洗液为中性，置于40℃电热恒温鼓风干燥箱中恒温处理8h，最后置于粉碎机中粉碎至粉末，获得小黄鱼鱼鳞粉；
(2)将小黄鱼鱼鳞粉，分别按0.433％的质量比的胃蛋白酶酶浓度于38℃恒温水浴锅中浸提10.8h，得到胶原蛋白浸提液；
(3)对胶原蛋白浸提液进行4000rpm离心20min，将清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液最终NaCl浓度为0.9mol/L，搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃冰箱中静置6h后在4℃，4000rpm下离心20min，得到沉淀物，沉淀物是提取出的粗胶原蛋白，再将沉淀物用0.05mol/L的柠檬酸溶解并在截留分子量为1.4kD的透析袋中透析3天，至用0.1mol/L的HgN03检验外液中无Cl-为止，透析外液为纯净水，最后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，则得到小黄鱼鱼鳞胶原蛋白粗提产物。
本发明的工艺促进海水鱼加工废弃物的综合利用、降低海水鱼加工的成本，开发新型胶原蛋白资源，本实施例对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取工艺进行了研究，以期为鱼鳞加工的产业化提供技术参考和理论依据，同时为减少环境污染和资源浪费做出贡献。
本发明的优点是发明人经过系统性的研究和创新性思考，结合多个参量和数学模型获得了热水法提取小黄鱼鱼鳞胶原蛋白的的最佳工艺条件为料液比为1:13，提取时间为246min，提取温度为66.5℃。酶解法的最佳工艺条件为胃蛋白酶酶浓度为0.433％，胃蛋白酶酶提时间为10.8h，胃蛋白酶酶提温度为38℃。具体参数和实验数据见实施例。
此外，本发明所提供的两种工艺各自具有各自的优势，热水法提取的鱼鳞胶原蛋白的起泡性，吸油性优于酶法提取的鱼鳞胶原蛋白，但酶法提取的鱼鳞胶原蛋白的气泡稳定性和纯度优于水法提取的鱼鳞胶原蛋白。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1羟脯氨酸标准曲线测定图；
图2料液比对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取影响的测试图；
图3提取温度对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取影响的测试图；
图4提取时间对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取影响的测试图；
图5热水法的响应面图；
图6酶浓度对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取影响的测试图；
图7酶解时间对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取率影响的测试图；
图8酶解温度对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取率影响的测试图；
图9酶解法的响应面图；
图10热提法胶原蛋白紫外光谱图；
图11酶提法胶原蛋白紫外光谱图；
图12小黄鱼鱼鳞胶原蛋白的电泳图，图12中，1:蛋白质marker；2：水溶性胶原蛋白；3：酶溶性胶原蛋白。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。1材料与方法
1.1材料及来源
小黄鱼鱼鳞，由浙江温州香海食品有限公司提供。
1.2试验主要仪器与设备
HHS型电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；
LT1002E电子天平(常熟市天量仪器有限公司)；
AR2140电子天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司)；
BCD-226SDCZ冰箱(海尔集团)；
DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；
高速多功能粉碎机(永康市天琪盛世工贸有限公司)；
Beta1-8LD plus冷冻干燥机(德国christ公司)；
TD5A型离心机(长沙英泰仪器有限公司)；
TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；
KDN-08B定氮仪(上海洪纪仪器设备有限公司)；
SZF-06C型粗脂肪测定仪(浙江托普仪器有限公司)；
DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)；
JY-SCZ2型电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；
DC-B型马弗炉(北京独创科技有限公司)。
1.3试剂
氯化钠、氢氧化钠、柠檬酸、无水乙酸钠、浓硫酸、正丙醇、氯胺T、对二甲氨基苯甲醛、高氯酸、异丙醇、羟脯氨酸、冰醋酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、盐酸、乙醚，丙烯酰胺(Acr)，亚甲基双丙烯酰胺(Bis)，Tris，盐酸，硫酸铵，甘油，SDS，β-巯基乙醇，溴酚蓝，考马斯亮蓝R-250，以上试剂均为分析纯；胃蛋白酶：1：10000/BR。
1.4测定方法
1.4.1鱼鳞水分的测定：赛多利奇快速水分测定仪测定。
1.4.2鱼鳞粗蛋白的测定:凯氏定氮法。
1.4.3鱼鳞粗脂肪的测定:索氏抽提法。
1.4.4鱼鳞灰分的测定
1.4.5水法提取率的计算
1.4.6羟脯氨酸含量的测定
参照GB9695.23-2008方法，移取4.00mL羟脯氨酸标准工作液于比色管中，加入2.00mL氯胺T，在室温下放置20min。加入2.00mL显色剂于比色管中，充分混合，用塑料薄膜将比色管封口。将比色管迅速放入60℃水浴中，加热20min。取出比色管，用流动水冷却比色管至少3min，在室温下放置30min。用水作参比，于558nm测定吸光度，制得标准曲线，如图1所示。
1.4.7酶提法提取液中胶原蛋白含量的测定
吸取胶原蛋白提取液10mL，加入20mL浓度为3mol/L的硫酸溶液于105℃水解16h后稀释相同的倍数，测吸光度。
胶原蛋白含量＝样品的羟脯氨酸含量*11.1
式中：11.1为羟脯氨酸的含量与胶原蛋白的含量相关系数。
1.4.8两种方法提取后鱼鳞中胶原蛋白残留率的测定
准确称取原料鱼鳞(样品1)4g，经脱脂、脱杂蛋白以及除钙工艺处理后的鱼鳞(样品2)4g，于最佳条件下采用两种方法提取后的鱼鳞残渣(样品3)4g，以上三种样品用测定羟脯氨酸的方法测定吸光度，计算胶原蛋白的含量，以此作为鱼鳞杂蛋白脱除效果和胶原蛋白损失即残留率的评价指标。
1.5实验方法
1.5.1鱼鳞的前处理
将收集来的小黄鱼鱼鳞冲洗干净，以5％的氢氧化钠浸泡22h；用自来水冲洗至洗液为中性，以10％的柠檬酸浸泡2h；再用自来水冲洗至洗液为中性，置于40℃电热恒温鼓风干燥箱中恒温处理8h，最后置于粉碎机中粉碎至粉末，装袋备用。
1.5.2热提法提取鱼鳞胶原蛋白
1.5.2.1料液比的确定
在预实验的基础上，称取3g预处理后的小黄鱼鱼鳞粉，分别按1：6、1：8、1：10、1：12和1：14(w/v)的料液比于60℃恒温水浴锅中浸提4h，计算提取率，每组处理平行三次，考察料液比对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取得率的影响。
1.5.2.2热提温度的确定
分别称取3g预处理后的小黄鱼鱼鳞粉，以料液比为1:12溶于水中，分别于55、60、65、70℃和75℃恒温水浴锅中浸提4h，计算提取率，每组处理平行三次，考察热提温度对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取得率的影响。
1.5.2.3热提时间的确定
分别称取3g预处理后的小黄鱼鱼鳞粉，以料液比为1:12溶于水中，于恒温水浴锅中在温度为65℃下分别浸提3h、3.5h、4h、4.5h和5h，计算提取率，每组处理平行三次，考察热提时间对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取得率的影响。
1.5.2.4响应面法优化热提法提取鱼鳞胶原蛋白的工艺参数
在单因素试验基础上，按照平衡不完全区组(BB)试验设计方案，以鱼鳞胶原蛋白提取率为响应值，以液料比(x1)、热提温度(x2)和热提时间(x3)为响应因子进行正交试验，利用SAS 9.2统计软件进行数据分析。
1.5.3酶解法提取鱼鳞胶原蛋白
1.5.3.1酶浓度的确定
称取2g预处理后的小黄鱼鱼鳞粉，分别按2％、3％、4％、5％和6％(m/m)的胃蛋白酶酶浓度于37℃恒温水浴锅中浸提7h，稀释相同倍数后计算提取液胶原蛋白浓度，每组处理平行三次，考察酶浓度对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取提取液中胶原蛋白浓度的影响。
1.5.3.2酶解时间的确定
分别称取2g预处理后的小黄鱼鱼鳞粉，酶浓度为4％，于恒温水浴锅中在最佳热提温度下分别浸提3h、5h、7h、9h和11h，稀释相同倍数后计算提取液胶原蛋白浓度，每组处理平行三次，考察酶解时间对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取提取液中胶原蛋白浓度的影响。
1.5.3.3酶解温度的确定
分别称取2g预处理后的小黄鱼鱼鳞粉，酶浓度为4％，分别于27、32、37、42℃和47℃恒温水浴锅中浸提9h，稀释相同倍数后计算提取液胶原蛋白浓度，每组处理平行三次，考察酶解温度对小黄鱼鱼鳞胶原蛋白提取提取液胶原蛋白浓度的影响。
1.5.3.4响应面法优化酶法提取鱼鳞胶原蛋白的工艺参数
在单因素试验基础上，按照平衡不完全区组(BB)试验设计方案，以鱼鳞提取液稀释相同倍数后胶原蛋白的浓度为响应值，以酶浓度(x1)、酶解温度(x2)和酶解时间(x3)为响应因子进行正交试验，利用SAS 9.2统计软件进行数据分析。
1.5.4制取鱼鳞胶原蛋白
用两种方法分别在各自最佳的工艺条件下提取鱼鳞胶原蛋白，提取结束后，对提取液进行4000rpm离心20min，将清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液最终NaCl浓度为0.9mol/L，搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃冰箱中静置6h后离心20min(4℃，4000rpm)取沉淀。沉淀物是提取出的粗胶原蛋白，再将沉淀用0.05mol/L的柠檬酸溶解并在截留分子量为1.4kD的透析袋中透析3d，至用0.1mol/L的HgN03检验外液中无Cl-为止。透析外液为纯净水，最后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，则得到小黄鱼鱼鳞胶原蛋白粗提产物，密封保存备用。
1.5.5两种方法制取的鱼鳞胶原蛋白理化性质测定比较
1.5.5.1鱼鳞胶原蛋白的紫外光谱分析
准确称量一定量鱼鳞水提法胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白样品各一组，用0.5mol/L的乙酸溶液溶解配制成浓度为0.5mg/mL的胶原蛋白溶液，胶原蛋白溶液在4℃，5000r/min离心10min，上清液用紫外分光光度计在200～400nm近紫外光区以210nm/min的速度进行扫描测试。
1.5.5.2鱼鳞胶原蛋白吸油性的测定
准确量取10.0mL精练油，放入50mL刻度离心管，再加入0.20g鱼鳞胶原蛋白，用细玻璃棒搅拌1min，静止30min后，用3000r/min的速度离心15min，记下游离油的体积，吸油性计算如下：
公式中：V一一游离油体积；m一一蛋白质量。
1.5.5.3鱼鳞胶原蛋白起泡性和气泡稳定性的测定
用均质机将一定浓度的蛋白溶液置于匀浆机中，均质1min，记录均质停止时泡沫体积，并记录10min后泡沫体积，起泡性(FA)、泡沫稳定性(FS)，计算如下:
FA一一起泡能力
V一一泡沫总体积
V10一一10分钟后泡沫总体
1.5.5.4两种方法提取的鱼鳞胶原蛋白的电泳
(1)装板
将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度,即可灌胶。
(2)凝胶的聚合
分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10％的分离胶和4.8％的浓缩胶。
按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。
待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。
(3)蛋白质样品的处理
若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL 0.5mol/L pH 6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.0～1.5mg/mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为15～20μg的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15—20μl的样品处理液。在100℃水浴中处理2min，冷却至室温后备用。
吸取未知分子量的蛋白质样品20μL，按照标准蛋白的处理方法进行处理。
(4)加样
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法。
用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。
加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加10～15μL(含蛋白质10～15μg)，稀溶液可加20～30μL(还要根据胶的厚度灵活掌握)。
(5)电泳
加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到30～45mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约1-2小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。
(6)染色、脱色
电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。
弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。
2结果与分析
2.1小黄鱼鱼鳞基本成分
表1小黄鱼鱼鳞基本成分
2.2羟脯氨酸标准曲线
以羟脯氨酸质量浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。
2.3热水法提取鱼鳞胶原蛋白
2.3.1料液比的确定
由图2可以看出随着固液比的增加，鱼鳞胶原蛋白的提取率呈增长的趋势，加水量越少，胶原蛋白的提取率越低，这是因为在热水抽提胶原蛋白的过程中，由于胶原蛋白的胶体性质，溶液的粘度越来越大，自由状态下的水饱和程度越来越高，膨胀水的溶解性越来越弱在水量不足的条件下，导致胶原蛋白的提取率下降，固液比在1:10之后提取率增长变小，料液比在1:12之后变化不大，考虑到加水量越大，鱼鳞胶原蛋白后续处理难度加大，综合固液比对提取率的影响初步确定热水浸提鱼鳞胶原蛋白的固液比为1:12。
2.3.2温度的确定
由3可以看出提取温度对胶原蛋白提取率有较大的影响，鱼鳞胶原蛋白的提取率在55℃一65℃之间呈上升趋势。65℃提取率达到最大，65℃之后开始下降，可能原因是胶原蛋白严重变性影响其溶出。故温度选择65℃水浴提取。
2.3.3时间的确定
由图4可知热水提取前4.0h时胶原蛋白的提取率随着时间的延长而逐渐增加，而提取4.0h后胶原蛋白的提取率增加开始变小，可能原因是提取时间过短，不能充分疏松鱼鳞表层结构，除去非纤维蛋白中的球状蛋白，软化胶原蛋白的皮层，因此不能充分提取胶原蛋白。而提取时间过长，鱼鳞中的胶原蛋白已基本被提取完全，从而导致4h后胶原蛋白提取率增加减少，考虑到成本及试验效果，确定热水浸提青鱼鱼鳞胶原蛋白的最佳时间在4h左右为宜。
2.3.4响应面法优化热水提取鱼鳞胶原蛋白的条件
采用BB设计提取水溶性鱼鳞胶原蛋白的3因素3水平试验设计及结果见表2、表3。
表2响应面试验因素及编码水平表
表3提取水溶性鱼鳞胶原蛋白的3因素3水平试验结果表
采用SAS 9.2统计软件进行数据分析，得到提取率与各因素变量的二
次方程(实际值)为：
回归方程：
Y1＝82.75+3.19875×x1+x2+0.83125×x3-2.85375×x1 2-0.635×x1x2-0.5225×x1x3-1.78625×x2 2+0.105×x2x3-0.87875×x3 2
剔除不显著项，
Y1＝82.75+3.19875×x1+x2+0.83125×x3-2.85375×x1 2-1.78625×x2 2
表4二次响应面回归模型方差分析
注：**p<0.01水平极显著，*p<0.05水平显著
回归系数(相关系数)：R2＝98.41％，调整后的R2＝95.54％
由表4可以看出，该工艺建立的回归模型的P<0.01，当P<0.05时，表明该项指标显著，由此可知该工艺的模型是及其显著的，失拟项P＝0..0530>0.05，不显著；回归系数(相关系数)：R2＝98.41％，调整后的R2＝95.54％，说明该模型与实际试验拟合情况很好，故可以使用该回归方程代替真实试验点对试验结果进行分析。
从岭脊分析结果可以看出，当编码半径为0.6时响应值Y最大，此时胶原蛋白提取率为83.7973％，对应的料液比为1：12.97834，提取时间为4.093555h(246min)，提取温度为66.4637(66.5)℃。考虑实际操作的方便，将热水法提取鱼鳞胶原蛋白的最佳工艺条件修改为料液比为1:13，提取时间为246min，提取温度为66.5℃做验证试验，测得提取率为83.08％，表明该模型合理可行。
回归方程中的各个变量对响应值即提取率的影响的显著程度F检验来进行判断，即P值越小，表明该变量对响应值的影响的显著程度越高。表3中的显著性检验结果说明，一次项X1X2的影响极显著，X3的影响显著，二次项X1 2、X2 2影响极显著。由上述结果可以得出，各因素对胶原蛋白提取率的影响并不是简单的线性关系。
各两因素交互作用对胶原蛋白提取率影响的响应面图见图5。
由图5可以看出，提取温度固定不变时，随着液料比的增大，胶原蛋白提取率呈现升高的趋势。因为提取时间过短，不能充分疏松鱼鳞表层结构，除去非纤维蛋白中的球状蛋白，软化胶原蛋白的皮层，因此不能充分提取胶原蛋白，而提取时间过长，鱼鳞中的胶原蛋白已基本被提取完全，从而导致4.1h后胶原蛋白提取率增长不大。
2.4酶法提取鱼鳞胶原蛋白
2.4.1酶浓度的确定
由图6可以看出酶(胃蛋白酶)浓度从小于4％时随着酶(胃蛋白酶)浓度的增加，提取液中胶原蛋白的浓度也随着增加，当酶(胃蛋白酶)浓度达到4％时提取液中胶原蛋白的浓度最高，此后再增加酶(胃蛋白酶)量提取液中胶原蛋白的浓度不再增加，原因是酶(胃蛋白酶)除去胶原蛋白唯一的非螺旋形端部，胶原蛋白物理，化学性质都发生了改变，当然非胶原蛋白成分也被水解，因此，酶(胃蛋白酶)处理后胶原蛋白的溶解性增加。在本实施例中，胃蛋白酶加成到提取介质的影响是明显的，当酶浓度达到一定值之后，所有的底物都与酶(胃蛋白酶)结合了，此后再增加酶(胃蛋白酶)浓度对提取液中胶原蛋白的浓度不再受影响。
2.4.2酶解时间的确定
由图7可以看出酶解前7h，随着酶解时间的延长，提取液中胶原蛋白的浓度升高，当酶解时间超过7h后，提取液中胶原蛋白的浓度基本维持稳定。这是因为胃蛋白酶在酶解前7h活性较高，7h后底物与酶反应完全，此后再增加时间，提取液中胶原蛋白的浓度增加不再明显。考虑到后续试验的简易程度，酶解效果，成本，所以酶解时间控制在7h左右。
2.4.3酶解温度的确定
由图8可以看出当温度在27℃到37℃之间时，随着酶解温度的增加提取液中胶原蛋白的浓度增加，当酶解温度为37℃时提取液中胶原蛋白的浓度最高，此后再升高酶解温度，提取液中胶原蛋白的浓度逐渐减小。原因是，37℃是胃蛋白酶的最适温度，此后再升高温度，酶活性会逐渐降低。
2.4.4响应面法优化酶法提取鱼鳞胶原蛋白的条件
采用BB设计酶提鱼鳞胶原蛋白的3因素3水平试验设计及结果见表6、表7。
表6响应面试验因素及编码水平表
表7Hybrid实验设计及响应值表
回归模型的建立
以酶浓度x1、酶提温度x2、酶提时间x3为自变量，提取液胶原蛋白浓度为因变量Y，建立酶法提取鱼鳞胶原蛋白工艺参数的回归模型：
Y＝2.112333+0.2645x1+0.045625x2+0.099125x3-0.289417x1 2+0.01425x1x2-0.07675x1x3-0.117167x2 2-0.0065x2x3-0.035667x3 2
对正交结果进行方差分析，结果见表。
表8酶法提取鱼鳞胶原蛋白方差分析表
注：*p<0.05显著
去除不显著项，简化回归模型，得到优化后的回归方程为：
Y＝2.112333+0.2645x1+0.045625x2+0.099125x3-0.289417x1 2-0.07675x1x3-0.117167x2 2
从回归模型方差分析可看出，以酶浓度x1、酶提温度x2及酶提温度x3的一次项，酶浓度、酶提温度的二次项，酶浓度和酶提温度的交互项对鱼鳞提取胶原蛋白影响显著。所有参数的一次项对鱼鳞提取胶原蛋白提取液中胶原蛋白的浓度呈正相关；而所有参数的二次项以及其它几个交互项与鱼鳞提取胶原蛋白提取液中胶原蛋白的浓度呈负相关。
多元回归分析表明，回归方程的拟合系数为R2＝97.52％，调整R2＝99.12％，说明模型对实际情况拟合程度较好；对多元回归方程的误差项进行分析，说明建立的三元二次回归方程在整个回归空间内的拟合度较好，可用于本实施例生产条件的模拟估算。
从岭脊分析结果可知，当编码半径为1.0时响应值Y最大，此时提取液中胶原蛋白浓度为2.21005μg/ml，对应的酶浓度为0.433％，酶提时间为10.8h，酶提温度为38℃。在此条件下做验证试验，测得提取液中胶原蛋白浓度为2.18μg/mL表明该模型合理可行。
两因素效应对鱼鳞酶法提取胶原蛋白的影响
固定变量酶提温度在零点，依次得到其它两个变量的响应面，由图11响应面图看出，这两个交互项的交互作用显著，这与回归模型系数显著性检验结果一致，验证了回归模型方差分析的正确性。
图9表明，在酶提温度37条件下，酶浓度和酶提时间的交互作用显著。当酶浓度较低的水平下，随着酶提时间的增长，提取液中胶原蛋白的浓度先升高后趋于不变，变化趋势不显著；当酶浓度处于较高水平时，随着酶提时间的增长，提取液中胶原蛋白的浓度略有上升；当固定酶提时间不变时，随着酶浓度水平加大，提取液中胶原蛋白的浓度上升，之后下降；
2.5两种方法提取后鱼鳞中胶原蛋白残留率的分析
2.5.1水法提取鱼鳞水解吸光度
表10水法提取鱼鳞水解液样品的吸光度
由于脯氨酸的质量浓度和鱼鳞胶原蛋白的质量浓度正相关，则脯氨酸质量浓度的变化可以算出胶原蛋白的变化情况。由表的数据可以计算得出，鱼鳞在预处理脱脂步骤胶原蛋白的损失率为5.64％；热水浸后鱼鳞中胶原蛋白的残留率为30.99％
2.5.2酶法提取鱼鳞水解吸光度
表11酶法提取鱼鳞水解液样品的吸光度
由于脯氨酸的质量浓度和鱼鳞胶原蛋白的质量浓度正相关，则脯氨酸质量浓度的变化可以看出胶原蛋白的变化情况。由表的数据可以计算得出，鱼鳞在预处理脱脂步骤胶原蛋白的损失率为5.64％；酶提后鱼鳞中胶原蛋白的残留率为64.89％
2.6两种方法制取的鱼鳞胶原蛋白理化性质测定比较
2.6.1鱼鳞胶原蛋白的紫外光谱分析
对水法提取的鱼鳞胶原蛋白，酶法提取的鱼鳞胶原蛋白溶液在200--400nm近紫外光区进行扫描测试，结果如图所示。蛋白质组成的20多种氨基酸，在可见光区域都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外光区域(220--300nm)只有芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。原因在于它们的R基含有苯环共扼双键系统，在特定的波长下有最大光吸收。蛋白质由于含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般最大光吸收在280nm波长处。
然而胶原蛋白在220nm附近有特征性吸收，由于胶原蛋白组成中只含少量芳香族氨基酸，在280nm处基本无吸收，而胶原肤链所含的C＝O，-COOH，CONH2都是生色基团，可以产生吸收，在220nm附近产生较强的光吸收。从图10、图11可以看出，两种方法提取的胶原蛋白在230nm附近处有一强吸收峰，这均与以往文献报道的胶原蛋白光吸收特征相一致。
2.6.2鱼鳞胶原蛋白吸油性的测定
表12鱼鳞胶原蛋白吸油性
吸油性是表征蛋白质产品吸附油脂能力大小的物理量，吸附油的毫升数来表示，其能力大小决定于蛋白质产一般用每克蛋白产品品的种类、来源、颗粒大小、温度、加工方法、所使用的油脂、离心速度与时间等。由表可以看出热水法提取的胶原蛋白的吸油性比酶法提取的胶原蛋白的吸油性好。
2.6.3鱼鳞胶原蛋白起泡性和气泡稳定性的测定
起泡性是指蛋白质产品搅打起泡的能力，泡沫稳定性是指泡沫保持稳定的能力。蛋白质产品的起泡性一般随蛋白质产品浓度增加而增加，浓度为3％时，起泡性最高。
表13鱼鳞胶原蛋白起泡性
由表13可以看出水法提取的胶原蛋白起泡性优于酶法提取的胶原蛋白。
表14鱼鳞胶原蛋白起泡稳定性
由表14可以看出水法提取的胶原蛋白起泡性稳定性优于酶法提取的胶原蛋白。
2.6.4两种方法提取的鱼鳞胶原蛋白的电泳分析
胶原蛋白是由三条α左手螺旋相互缠绕成右手超螺旋结构,为了验证本论文提取的小黄鱼鱼鳞胶原蛋白三条α链结构是否保存完整，对所提小黄鱼鱼鳞胶原蛋白进行了SDS-PAGE电泳分析，其结果如图12所示。从图可以看出小黄鱼鱼鳞水溶性胶原蛋白和酶溶性胶原蛋白中存在明显的I型胶原蛋白的特征，即它们都含有3条不同的α链(α1、α2和α3)以及它们的交联体β链。其中α1、α2和α3链的相对分子质量为55～70ku之间，β链的相对分子质量为170ku左右。由图12可以看出，水溶性的相对分子质量与酶溶性的相差不大，而且实验中所提取小黄鱼鱼鳞胶原蛋白的水溶性胶原蛋白、酶溶性胶原蛋白电泳条带均比较清晰，且无明显杂带，说明通过此方法提取的小黄鱼鱼鳞蛋白样品基本保持了其原有的蛋白质结构，因此，利用本实验的提取工艺所提取的小黄鱼鱼鳞胶原蛋白能够达到较高的纯度。
3结论与讨论
3.1热水法的最佳工艺条件为料液比为1:13，提取时间为246min，提取温度为66.5℃。
3.2酶解法的最佳工艺条件为酶浓度为0.433％，酶提时间为10.8h，酶提温度为38℃。
3.3热水法提取的鱼鳞胶原蛋白的起泡性，吸油性优于酶法提取的鱼鳞胶原蛋白，但酶法提取的鱼鳞胶原蛋白的气泡稳定性和纯度优于水法提取的鱼鳞胶原蛋白。
3.4本实施例以期为鱼鳞加工的产业化提供技术参考和理论依据，同时为减少环境污染和资源浪费做出贡献。

Claims (2)

1.一种基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)预处理，将小黄鱼鱼鳞冲洗干净，以5％的氢氧化钠浸泡22h；用自来水冲洗至洗液为中性，以10％的柠檬酸浸泡2h；再用水冲洗至洗液为中性，置于40℃电热恒温鼓风干燥箱中恒温处理8h，最后置于粉碎机中粉碎至粉末，获得小黄鱼鱼鳞粉；
(2)将小黄鱼鱼鳞粉，分别按1:13质量体积比的料液比于:66.5℃恒温水浴锅中浸提246min，得到胶原蛋白浸提液；
(3)对胶原蛋白浸提液进行4000rpm离心20min，将清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液最终NaCl浓度为0.9mol/L，搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃冰箱中静置6h后在4℃，4000rpm下离心20min，得到沉淀物，沉淀物是提取出的粗胶原蛋白，再将沉淀物用0.05mol/L的柠檬酸溶解并在截留分子量为1.4kD的透析袋中透析3天，至用0.1mol/L的HgN03检验外液中无Cl-为止，透析外液为纯净水，最后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，则得到小黄鱼鱼鳞胶原蛋白粗提产物；
(4)鱼鳞胶原蛋白吸油性的测定：准确量取10.0mL精练油，放入50mL刻度离心管，再加入0.20g鱼鳞胶原蛋白，用细玻璃棒搅拌1min，静止30min后，用3000r/min的速度离心15min，记下游离油的体积，吸油性计算如下：
吸油性公式中：V一一游离油体积；m一一蛋白质量，测得的胶原蛋白为6ml/g。
2.一种基于小黄鱼鱼鳞的胶原蛋白提取工艺，其特征在于包括以下步骤：
(1)预处理，将小黄鱼鱼鳞冲洗干净，以5％的氢氧化钠浸泡22h；用自来水冲洗至洗液为中性，以10％的柠檬酸浸泡2h；再用水冲洗至洗液为中性，置于40℃电热恒温鼓风干燥箱中恒温处理8h，最后置于粉碎机中粉碎至粉末，获得小黄鱼鱼鳞粉；
(2)将小黄鱼鱼鳞粉，分别按酶浓度为0.433％的质量比的胃蛋白酶于38℃恒温水浴锅中浸提10.8h，得到胶原蛋白浸提液；
(3)对胶原蛋白浸提液进行4000rpm离心20min，将清液中加入研磨成粉末的NaCl，使溶液最终NaCl浓度为0.9mol/L，搅拌盐析，析出絮状沉淀，在4℃冰箱中静置6h后在4℃，4000rpm下离心20min，得到沉淀物，沉淀物是提取出的粗胶原蛋白，再将沉淀物用0.05mol/L的柠檬酸溶解并在截留分子量为1.4kD的透析袋中透析3天，至用0.1mol/L的HgN03检验外液中无Cl-为止，透析外液为纯净水，最后将透析袋中的胶原蛋白冷冻干燥，则得到小黄鱼鱼鳞胶原蛋白粗提产物；
(4)鱼鳞胶原蛋白吸油性的测定：准确量取10.0mL精练油，放入50mL刻度离心管，再加入0.20g鱼鳞胶原蛋白，用细玻璃棒搅拌1min，静止30min后，用3000r/min的速度离心15min，记下游离油的体积，吸油性计算如下：
吸油性公式中：V一一游离油体积；m一一蛋白质量，测得的胶原蛋白为3.75ml/g。
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