CN113933118A - 一种鸡骨组织切片的快速制片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡骨组织切片的快速制片方法，属于动物医学、生物学的显微组织切片实验领域，步骤如下：S1：骨组织进入特定的脱钙‑固定液A 1.5~5小时，38~55℃，固定和脱钙同时进行；S2：用羽毛刀片将脱钙‑固定1.5~5小时的鸡骨组织切成2毫米的小段；S3：骨组织进入特定的脱钙‑固定液B 3~8小时，50~60℃；S4：骨组织进入30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液，直至骨组织沉至容器底部；S5：包埋好的骨组织冰冻切片10微米；S6：将切片置于PB中，用PB清洗骨切片，勾线笔将骨切片贴至有多聚赖氨酸液滴的防脱玻片上，甘油明胶封片剂封片。本发明提供了两种不同的脱钙‑固定液，在对组织进行固定的同时又对骨组织进行了脱钙‑修块‑再脱钙这种分步脱钙的方法，利用冰冻切片、漂片与贴片相结合的方法，有效地缩短了制作切片的时间。
Description
技术领域
本发明涉及动物医学、生物学的显微组织切片实验领域，是一种鸡骨组织切片的快速处理及切片染色的方法。
背景技术
鸡的骨代谢疾病及鸡骨健康的检测一直是畜禽养殖一直存在的一个问题，而检测骨组织最直接的方式之一就是骨组织的切片染色。
骨组织是一种坚硬的结缔组织，也是由细胞、纤维和基质构成的。纤维为骨胶纤维(和胶原纤维一样)，基质含有大量的固体无机盐。制作骨切片的优良方法在养殖中可以准确地判断疾病的种类及禽类养殖骨的健康程度，在实验中可以保证严谨的科学性和准确性。
就目前来说，禽类骨组织制片的常用方法耗时较长，在一些紧急情况下，这种制片就存在很大的不实用性。便捷、高效、快速的鸡骨的制片方法有利于骨组织的结构及其他成分不被破坏。
因为骨组织含有大量的无机钙盐，与其他内脏器官相比非常坚硬。在骨组织的制片过程中，不论是取材还是比较复杂的脱钙过程对实验者的要求都极其高，如果脱钙不完全，会直接影响骨切片的制作，在切片过程中很难切出完整的切片，若骨组织脱钙过度，染色效果就会变差，进而影响科学实验的工作的进行和对病变组织的病理诊断。
发明内容
本发明提供了一种快速鸡骨组织的制片方法，不仅耗时短、高效，而且制作过程中鸡骨组织的结构及其他成分能保持完整性，不被破坏。
为实现上述目的，本发明提供一种鸡骨组织切片的快速制片方法，步骤如下所述：
S1：固定与第一次脱钙：将骨组织周围其它组织清理干净，放入特定的脱钙-固定液A1.5~5小时，水浴锅加热至38~55℃，固定和脱钙同时进行，直至组织用手指按压有弹性；
S2：修块：用LEICA819羽毛刀片将脱钙-固定液A处理过的鸡骨组织沿横切面切成2毫米的小段；
S3：固定与第二次脱钙：将S3处理的2毫米的骨组织进入特定的脱钙-固定液B 3~8小时，水浴锅加热至50~60℃，固定和脱钙同时进行，直至组织完全变软；
S4：沉糖与中和酸：骨组织进入30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液5~12小时，中间换液2~3次直至骨组织沉至容器底部。
S5：包埋与切片：将冰冻切片机预冷至-15℃，先用包埋剂OCT在载物台上形成一个2~3毫米高的一个平台，待OCT凝固之后；取出沉至容器底部的骨组织，用滤纸吸去多余的S4中的混合溶液，将骨组织放入OCT包埋剂中3分钟；取出骨组织，骨组织横切面放置在前面提到的OCT制作的2~3毫米平台的载物台上，再将OCT覆盖在骨组织上，直至凝固后骨组织不露出，将包埋好的骨组织固定至冰冻切片机上，设定10微米，匀速切片。
S6：染色与封片：将切片置于含有磷酸盐缓冲液PB的六孔板中，用PB清洗骨切片6次，每次10分钟，勾线笔将清洗好的骨切片贴至有多聚赖氨酸液滴的防脱载玻片上，吸去多余的多聚赖氨酸，待骨组织切片干时，在骨组织上滴加苏木精直至全部覆盖住骨组织，染色5分钟，冲洗掉多余染料，酸酒精分化1秒，伊红染色2m分钟，冲洗掉多余颜色，甘油明胶封片剂封片，30分钟后上镜观察。
根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S1中特定的脱钙-固定液A 它的配制过程如下：将浓盐酸、冰醋酸、用PB缓冲液配成的4％多聚甲醛溶液按体积比为22~28：2~8：63~76振荡器混合均匀，即可得到特定的脱钙-固定液A 。
根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S2中组织的修块方法应为：沿横切面切成2毫米的小段。
根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S3中特定的脱钙-固定液B 它的配制过程如下：将EDTA-Na2 、NaOH、用PB缓冲液配成的4％多聚甲醛溶液按质量比为8~15：1~2：85~92磁力搅拌器混合均匀，待完全溶解后HCl调节PH至7.38，即可得到特定的脱钙-固定液B 。
根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S4中磷酸缓冲液的PH为7.38。
根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S4中30％蔗糖和5％Na2SO4混合溶液，它的配制方法如下：每100ML水按蔗糖、Na2SO4按30：5的质量比配制，加入水后磁力搅拌器混合均匀，即可得30％蔗糖和5％Na2SO4混合溶液。
与现有技术相比，本发明有以下优点：
1、应用脱钙和固定同时进行的方式，很大程度上缩短了制片的时间。
2、应用脱钙固定-修块-脱钙固定这种分步脱钙的方法，第一次脱钙用的脱钙-固定液A，它主要是由无机酸组成，可以快速分解无机盐，在组织软化之后放入脱钙-固定液B，它的主要成分是钙离子螯合剂EDTA-Na2脱钙方式比较缓和，溶液PH为7.38，弱碱性的环境可以缓和脱钙-固定液A对组织的酸化。在两步脱钙的中间加入了修块2毫米的步骤，主要是为了在不损害骨组织的前提下让骨组织与脱钙液的接触面积更大，脱钙更完全。
3、在沉糖与中和酸这步将骨组织浸入30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液，加入30％蔗糖主要是为了脱水利于冰冻切片，而加入5％硫酸钠主要是为了中和无机酸的酸性，两步并在一起有效地缩短了制片时间。
具体实施方式
本发明所述的鸡骨组织的制片方法，包括以下步骤：第一步：固定与第一次脱钙：将骨组织周围其它组织清理干净，放入特定的脱钙-固定液A 1.5~5小时，水浴锅加热至38~55℃，固定和脱钙同时进行，直至组织用手指按压有弹性；第二步：修块：用LEICA819羽毛刀片将脱钙-固定液A处理过的鸡骨组织沿横切面切成2毫米的小段；第三步：固定与第二次脱钙：将S3处理的2毫米的骨组织进入特定的脱钙-固定液B 3~8小时，水浴锅加热至50~60℃，固定和脱钙同时进行，直至组织完全变软；第四步：沉糖与中和酸：骨组织进入30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液5~12小时，中间换液2~3次直至骨组织沉至容器底部。第五步：包埋与切片：将冰冻切片机预冷至-15℃，先用包埋剂OCT在载物台上形成一个2~3毫米高的一个平台，待OCT凝固之后；取出沉至容器底部的骨组织，用滤纸吸去多余的S4中的混合溶液，将骨组织放入OCT包埋剂中3分钟；取出骨组织，骨组织横切面放置在前面提到的OCT制作的2~3毫米平台的载物台上，再将OCT覆盖在骨组织上，直至凝固后骨组织不露出，将包埋好的骨组织固定至冰冻切片机上，设定10微米，匀速切片。第六步：染色与封片：将切片置于含有磷酸盐缓冲液PB的六孔板中，用PB清洗骨切片6次，每次10分钟，勾线笔将清洗好的骨切片贴至有多聚赖氨酸液滴的防脱载玻片上，吸去多余的多聚赖氨酸，待骨组织切片干时，在骨组织上滴加苏木精直至全部覆盖住骨组织，染色5分钟，冲洗掉多余染料，酸酒精分化1秒，伊红染色2分钟，冲洗掉多余颜色，甘油明胶封片剂封片，30分钟后上镜观察。
以下是本发明的实施例，对本发明技术进行详细描述，这些实施例仅是本发明一部分。
实施例
一种鸡尺骨切片的制作，步骤如下：第一步：固定与第一次脱钙：将骨组织周围其它组织清理干净，放入特定的脱钙-固定液A 3小时，水浴锅加热至40℃，固定和脱钙同时进行，直至组织用手指按压有弹性；第二步：修块：用LEICA819羽毛刀片将脱钙-固定液A处理过的鸡骨组织沿横切面切成2毫米的小段；第三步：固定与第二次脱钙：将S3处理的2毫米的骨组织进入特定的脱钙-固定液B 4小时，水浴锅加热至60℃，固定和脱钙同时进行，直至组织完全变软；第四步：沉糖与中和酸：骨组织进入30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液6小时，中间换液2~3次直至骨组织沉至容器底部。第五步：包埋与切片：将冰冻切片机预冷至-15℃，先用包埋剂OCT在载物台上形成一个2~3毫米高的一个平台，待OCT凝固之后；取出沉至容器底部的骨组织，用滤纸吸去多余的S4中的混合溶液，将骨组织放入OCT包埋剂中3分钟；取出骨组织，骨组织横切面放置在前面提到的OCT制作的2~3毫米平台的载物台上，再将OCT覆盖在骨组织上，直至凝固后骨组织不露出，将包埋好的骨组织固定至冰冻切片机上，设定10微米，匀速切片。第六步：染色与封片：将切片置于含有磷酸盐缓冲液PB的六孔板中，用PB清洗骨切片6次，每次10分钟，勾线笔将清洗好的骨切片贴至有多聚赖氨酸液滴的防脱载玻片上，吸去多余的多聚赖氨酸，待骨组织切片干时，在骨组织上滴加苏木精直至全部覆盖住骨组织，染色5分钟，冲洗掉多余染料，酸酒精分化1秒，伊红染色2分钟，冲洗掉多余颜色，甘油明胶封片剂封片，30分钟后上镜观察。
权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。 实施例只起到示范作用，没有绝对的限制性，所有使用到的试剂范围均由所附权利要求限定。本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。前来说，禽类骨组织制片的常用方法耗时较长，在一些紧急情况下，这种制片就存在很大的不实用性。便捷、高效、快速的鸡骨的制片方法有利于骨组织的结构及其他成分不被破坏。
Claims (7)
1.一种鸡骨组织切片的快速制片方法，其特征在于，步骤如下所述：
S1：固定与第一次脱钙：将骨组织周围其它组织清理干净，放入特定的脱钙-固定液A1.5~5小时，水浴锅加热至38~55℃，固定和脱钙同时进行，直至组织用手指按压有弹性；
S2：修块：用LEICA819羽毛刀片将脱钙-固定液A处理过的鸡骨组织沿横切面切成2毫米的小段；
S3：固定与第二次脱钙：将S2处理的2毫米的骨组织进入特定的脱钙-固定液B 3~8小时，水浴锅加热至50~60℃，固定和脱钙同时进行，直至组织完全变软；
S4：沉糖与中和酸：骨组织进入30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液5~12小时，中间换液2~3次直至骨组织沉至容器底部；
S5：包埋与切片：将冰冻切片机预冷至-15℃，先用包埋剂OCT在载物台上形成一个2~3毫米高的一个平台，待OCT凝固之后，取出沉至容器底部的骨组织，用滤纸吸去多余的S4中的混合溶液，将骨组织放入OCT包埋剂中3分钟，取出骨组织，骨组织横切面放置在前面提到的OCT制作的2~3毫米平台的载物台上，再将OCT覆盖在骨组织上，直至凝固后骨组织不露出，将包埋好的骨组织固定至冰冻切片机上，设定10微米，匀速切片；
S6：染色与封片：将切片置于含有磷酸盐缓冲液PB的六孔板中，用PB清洗骨切片6次，每次10分钟，勾线笔将清洗好的骨切片贴至有多聚赖氨酸液滴的防脱载玻片上，吸去多余的多聚赖氨酸，待骨组织切片干时，在骨组织上滴加苏木精直至全部覆盖住骨组织，染色5分钟，冲洗掉多余染料，酸酒精分化1秒，洗去多余的分化液，伊红染色2分钟，冲洗掉多余染料，甘油明胶封片剂封片，30分钟后上镜观察。
2.根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S1中特定的脱钙-固定液A 、步骤S2中特定的脱钙-固定液B 、步骤S4中30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液在使用时它们的体积与骨组织的比均为25~30：1。
3.根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S1中特定的脱钙-固定液A 的配制过程如下：将浓盐酸、冰醋酸、用PB缓冲液配成的4％多聚甲醛溶液按体积比为22~28：2~8：63~76振荡器混合均匀，即可得到特定的脱钙-固定液A 。
4.根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S2中组织的修块方法应为：沿横切面切成2毫米的小段，保证切面平整。
5.根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S3中特定的脱钙-固定液B 它的配制过程如下：将EDTA-Na2 、NaOH、用PB缓冲液配成的4％多聚甲醛溶液按质量比为8~15：1~2：85~92磁力搅拌器混合均匀，待完全溶解后HCl调节PH至7.38，即可得到特定的脱钙-固定液B 。
6.根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S4中磷酸缓冲液的PH为7.38。
7.根据权利要求1所述的一种鸡骨组织切片的快速染色制片方法，它的特征在于：步骤S4中30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液，它的配制方法如下：每100ML水按蔗糖、硫酸钠按30：5的质量比配制，加入水后磁力搅拌器混合均匀，即可得30％蔗糖和5％硫酸钠混合溶液。
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