CN110006721A - 黑老虎根的切片制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑老虎根的切片制备方法，是以黑老虎的根为原料，经过软化剂的浸泡并采用超声处理，得到所述黑老虎根的切片。其中，所述软化剂包括以下重量份的原料：5份浓度为50％的氢氧化钾或氢氧化钠溶液、3份体积分数为30％的丙三醇以及2份超纯水。以强碱、甘油和水配制而得软化剂，不仅能够快速有效的将黑老虎的根快速软化，并且该软化剂原料简单、来源方便、同时毒性较小，再结合超声加热技术使得软化处理更充分，使得制备得到的切片效果更佳。

Description

黑老虎根的切片制备方法

技术领域

本发明属于石蜡切片制备技术领域，具体涉及一种黑老虎根的切片制备方法。

背景技术

黑老虎Kadsura coccinea var.coccinea为木兰科Magnoliaceae南五味子属Kadsura多年生常绿藤本，以干燥根入药，是广西少数民族常用的传统壮瑶药材之一，具有行气活血、消肿止痛、治胃病、风湿骨痛、跌打瘀痛等多种生物活性，主要分布于我国江西、湖南、广东及香港、海南、广西、四川、贵州、云南等地黑老虎。由于近年来市场需求的加剧，加上野生黑老虎资源更新慢，黑老虎市场价格逐年攀升，正品的药材中经常出现混淆品，因此，急需对黑老虎药材的显微特征进行鉴别，分出真伪，从而规范黑老虎的药材市场。

石蜡切片是研究鉴别药材显微特征的重要技术方法，其基本步骤简单，包括：材料软化、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、烤片、脱蜡、复水、染色、封片等工艺。尽管工艺流程简单，但其中的每个步骤完成的质量均直接影响到最后切片的效果。其中，以药材的软硬度影响最大。大多数干品药材因为细胞失水而收缩变形、质地较硬，直接切成薄片容易使细胞破碎不成形，破坏原本的细胞的组织结构，因此需要采用软化剂进行经过特殊处理。药材黑老虎的根属于较硬的这一类药材，石蜡切片开展前需要进行软化处理。传统方法以氢氟酸或甘油的水溶液为软化剂，但是，氢氟酸属剧毒液体，腐蚀性强，危险性极高，有时还需备案；甘油水溶液温和，但处理时间较长，不利于推广应用。

在石蜡切片的软化处理中，往往采用减压、抽滤的办法以加快软化的速度，但是容易使得细胞膨胀过度而发生破裂，最终影响切片的效果。超声波可以在介质中进行传播，引起介质中的物质运动，促进介质与物质之间的接触，起到搅拌、扩散的作用。现如今，超声波已经被广泛的运用在清洗机中，通过超声波的空化作用在固体和液体界面产生高速的微射流，从而破坏污物，除去或削弱边界污层，强化化学清洗剂的清洗作用。而超声波并没有运用在石蜡切片的软化处理上。

发明内容

本发明的目的是解决至少上述的缺陷，并提供以后将说明的优点。

为了实现本发明的这些目的和其他优点，现提供一种黑老虎根的切片制备方法，不仅能够快速有效的将黑老虎的根快速软化，并且该软化剂原料简单、来源方便、同时毒性较小，再结合超声加热技术使得软化处理更充分，使得制备得到的切片效果更佳。

换言之，本发明公开了一种黑老虎根的切片制备方法，将黑老虎根为原料经过软化剂的浸泡并采用超声处理以后，再进行后续的步骤，最终得到黑老虎根的切片。

优选的是，所述软化剂包括以下重量份的原料：5份质量浓度为50％的氢氧化钾或氢氧化钠溶液、3份体积分数为30％的丙三醇以及2份超纯水。

优选的是，所述辅软化剂通过以下步骤制备：量取5份质量浓度为50％的氢氧化钾或氢氧化钠溶液，加入3份体积分数为30％的丙三醇以及2份超纯水，搅拌至完全溶解，即得到所述软化剂。

优选的是，所述超声处理为：将黑老虎的根完全浸泡在所述软化剂中，采用可加热的超声仪在温度50—60℃、80Hz的条件下进行软化处理24小时。优选的是，黑老虎根的切片制备方法包括以下步骤：

步骤一：配制软化剂：量取5份质量浓度为50％的氢氧化钾或氢氧化钠溶液，加入3份体积分数为30％的丙三醇、2份超纯水，搅拌至完全溶解，得到软化剂。

步骤二：将超声仪的温度调节至50—60℃，把干燥的黑老虎的根浸泡于软化剂中转移至超声仪中，在80Hz条件下进行超声处理24小时，得到软化的黑老虎根。

步骤三：配制固定液：取5份福尔马林溶液、5份正丙酸或冰醋酸溶液、90份体积浓度为70％的酒精混合，得到固定液。

步骤四：将步骤二所得的软化的黑老虎根切割成5mm的小块，放入步骤三所得的固定液中进行固定24小时，得到固定好的黑老虎根。

步骤五：将步骤四所得的固定好的黑老虎根取出，并依次转入体积浓度为75％、85％、95％、100％的酒精中浸泡40—45分钟，得到脱水后的黑老虎根。

步骤六：将步骤五所得的脱水后的黑老虎的根放入透明剂中进行透明处理70—90分钟，得到透明的黑老虎根。

步骤七：向步骤六所得的透明的黑老虎根中加入碎蜡，在温度为40℃的条件下保存10—20小时，取出浸蜡的黑老虎根加入纯石蜡并调节温度至55—60℃，保存9—15小时，期间每个3—5小时取出黑老虎根至新的纯石蜡一次，得到包埋好的黑老虎根。

步骤八：取出包埋好的黑老虎根，采用自动切片机将黑老虎根切割成12—18μm的根切片。

步骤九：用粘片剂将根切片粘附在载玻片上，并于35—45℃条件下将载玻片烤干，得到干燥的根切片。

步骤十：将干燥的根切片经过复水再脱水处理后进行染色，最后用封固剂将切片封固，即得到所述黑老虎根的切片。

优选的是，所述透明剂可以是二甲苯或环保透明剂。

优选的是，所述透明处理的步骤为：

S1：将二甲苯和无水酒精按1:2的体积比混合，得到第一混合液；将二甲苯和无水酒精按2:1的体积比混合，得到第二混合液。

S2：将步骤五所得的脱水后的黑老虎的根放入无水酒精中浸泡10—15分钟，然后取出再放入第一混合液中浸泡15—20分钟；再取出放入第二混合液中浸泡20—25分钟；最后取出放入二甲苯中浸泡25—30分钟，即得到所述透明的黑老虎根。

本发明的优点：

1、采用本发明所公开的软化剂对黑老虎根进行软化处理，通过强碱刺激皱缩细胞的膨胀，以促进细胞吸水，而在丙三醇能够避免组织解离，避免组织结构被破坏，并且不会破坏石细胞的结构，结合起来作为软化剂不仅能够使得黑老虎根的切片能够软化完全，并且能够有效的缩短了黑老虎根的软化处理时间，提高了工作效率。还有，本发明所公开的软化剂原料来源方便、成分简单、且毒性小，相对于现有技术更安全可靠，利于推广使用。

2、采用本发明所公开的软化剂结合超声加热技术，通过超声波使得软化剂均匀的与黑老虎根充分接触，避免因为丙三醇黏度过大而造成软化剂分层的现象，进一步促进了黑老虎根与软化剂的充分接触，使得软化剂更好的渗入切片中将黑老虎根进行更好的软化，避免因软化不好黑老虎根在切片的时候造成机械损伤，导致细胞结构不完整、碎裂、不平整而产生气泡等而影响最终切片的效果。

3、采用浓度梯度式进行脱水使得黑老虎根脱水更加彻底且不伤害黑老虎根的组织状态，从而使得透明彻底，进而保证浸蜡彻底。

4、将黑老虎根的切片厚度控制在12—18μm，所制备得到的切片组织细胞能够保存完整、避免被切碎，方便镜检观察鉴定。

附图说明

图1为采用本发明实施例1制备得到的黑老虎石蜡切片；

图2为采用本发明实施例3制备得到的黑老虎石蜡切片；

图3为采用本发明实施例4制备得到的黑老虎石蜡切片；

图4为采用本发明实施例5制备得到的黑老虎石蜡切片；

图5为采用本发明对比例1制备得到的黑老虎石蜡切片；

图6为采用本发明对比例2制备得到的黑老虎石蜡切片；

图7为采用本发明对比例3制备得到的黑老虎石蜡切片。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

一种黑老虎根的切片制备方法，包括以下步骤：

步骤一：配制软化剂：量取5份质量浓度为50％的氢氧化钾溶液，加入3份体积分数为30％的丙三醇、2份超纯水，搅拌至完全溶解，得到软化剂。

步骤二：将超声仪的温度调节至60℃，把干燥的黑老虎的根浸泡于软化剂中并转移至超声仪，在80Hz条件下进行超声处理5次，每次30分钟，得到软化的黑老虎根。

步骤三：配制固定液：取5份福尔马林溶液、5份正丙酸或冰醋酸溶液、90份体积浓度为70％的酒精混合，得到固定液。

步骤四：将步骤二所得的软化的黑老虎根切割成5mm的小块，放入步骤三所得的固定液中进行固定24小时，得到固定好的黑老虎根。

步骤五：将步骤四所得的固定好的黑老虎根取出，并依次转入体积浓度为75％、85％、95％、100％的酒精中浸泡40分钟，得到脱水后的黑老虎根。

步骤六：将二甲苯和无水酒精按1:2的体积比混合，得到第一混合液；将二甲苯和无水酒精按2:1的体积比混合，得到第二混合液；然后将步骤五所得的脱水后的黑老虎的根放入无水酒精中浸泡10分钟，然后取出再放入第一混合液中浸泡15分钟；再取出放入第二混合液中浸泡20分钟；最后取出放入二甲苯中浸泡30分钟，即得到所述透明的黑老虎根。

步骤七：向步骤六所得的透明的黑老虎根中加入碎蜡，在温度为40℃的条件下保存10小时，取出浸蜡的黑老虎根加入纯石蜡并调节温度至55℃，保存9小时，期间每个3小时取出黑老虎根至新的纯石蜡一次，得到包埋好的黑老虎根。

步骤八：取出包埋好的黑老虎根，采用自动切片机将黑老虎根切割成12μm的根切片。

步骤九：用粘片剂将根切片粘附在载玻片上，并于35℃条件下将载玻片烤干，得到干燥的根切片。

步骤十：将干燥的根切片经过复水再脱水处理后进行染色，最后用封固剂将切片封固，即得到所述黑老虎根的切片。

实施例2

将实施例1的步骤一替换为：量取5份质量浓度为50％的氢氧化钠溶液，加入3份体积分数为30％的丙三醇、2份超纯水，搅拌至完全溶解，得到软化剂。其余的参数均与实施例1完全相同，制备方法也完全相同。

实施例3

将实施例1的步骤二替换为：将超声仪的温度调节至50℃，把干燥的黑老虎的根浸泡于软化剂中并转移至超声仪，在80Hz条件下进行超声处理5次，每次30分钟，得到软化的黑老虎根。其余的参数均与实施例1完全相同，制备方法也完全相同。

实施例4

将实施例1的步骤六替换为：将二甲苯和无水酒精按1:2的体积比混合，得到第一混合液；将二甲苯和无水酒精按2:1的体积比混合，得到第二混合液；然后将步骤五所得的脱水后的黑老虎的根放入无水酒精中浸泡10分钟，然后取出再放入第一混合液中浸泡15分钟；再取出放入第二混合液中浸泡20分钟；最后取出放入二甲苯中浸泡30分钟，即得到所述透明的黑老虎根。其余的参数均与实施例1完全相同，制备方法也完全相同。

实施例5

将实施例1的步骤七替换为：向步骤六所得的透明的黑老虎根中加入碎蜡，在温度为40℃的条件下保存15小时，取出浸蜡的黑老虎根加入纯石蜡并调节温度至55℃，保存12小时，期间每个4小时取出黑老虎根至新的纯石蜡一次，得到包埋好的黑老虎根。其余的参数均与实施例1完全相同，制备方法也完全相同。

实施例6

将实施例1的步骤八替换为：取出包埋好的黑老虎根，采用自动切片机将黑老虎根切割成15μm的根切片。其余的参数均与实施例1完全相同，制备方法也完全相同。

实施例7

将实施例1的步骤八替换为：取出包埋好的黑老虎根，采用自动切片机将黑老虎根切割成18μm的根切片。其余的参数均与实施例1完全相同，制备方法也完全相同。

对比例1

一种黑老虎根的切片制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将黑老虎根放入体积分数为25％的甘油中浸泡11天，得到软化的黑老虎根。

步骤二：配制固定液：取5份福尔马林溶液、5份正丙酸或冰醋酸溶液、90份体积浓度为70％的酒精混合，得到固定液。

步骤三：将步骤二所得的软化的黑老虎根切割成5mm的小块，放入步骤三所得的固定液中进行固定24小时，得到固定好的黑老虎根。

步骤四：将步骤四所得的固定好的黑老虎根取出，并依次转入体积浓度为75％、85％、95％、100％的酒精中浸泡40分钟，得到脱水后的黑老虎根。

步骤五：将二甲苯和无水酒精按1:2的体积比混合，得到第一混合液；将二甲苯和无水酒精按2:1的体积比混合，得到第二混合液；然后将步骤五所得的脱水后的黑老虎的根放入无水酒精中浸泡10分钟，然后取出再放入第一混合液中浸泡15分钟；再取出放入第二混合液中浸泡20分钟；最后取出放入二甲苯中浸泡30分钟，即得到所述透明的黑老虎根。

步骤六：向步骤五所得的透明的黑老虎根中加入碎蜡，在温度为40℃的条件下保存10小时，取出浸蜡的黑老虎根加入纯石蜡并调节温度至55℃，保存9小时，期间每个3小时取出黑老虎根至新的纯石蜡一次，得到包埋好的黑老虎根。

步骤七：取出包埋好的黑老虎根，采用自动切片机将黑老虎根切割成12μm的根切片。

步骤八：用粘片剂将根切片粘附在载玻片上，并于35℃条件下将载玻片烤干，得到干燥的根切片。

步骤九：将干燥的根切片经过复水再脱水处理后进行染色，最后用封固剂将切片封固，即得到所述黑老虎根的切片。

对比例2

一种黑老虎根的切片制备方法，包括以下步骤：

步骤一：将黑老虎根放入体积分数为25％的甘油中浸泡5天；将超声仪的温度调节至60℃，把黑老虎的根以及25％的甘油转移至超声仪，进行超声处理5次，30分钟，得到软化的黑老虎根。

步骤二：配制固定液：取5份福尔马林溶液、5份正丙酸或冰醋酸溶液、90份体积浓度为70％的酒精混合，得到固定液。

步骤三：将步骤二所得的软化的黑老虎根切割成5mm的小块，放入步骤三所得的固定液中进行固定24小时，得到固定好的黑老虎根。

步骤四：将步骤四所得的固定好的黑老虎根取出，并依次转入体积浓度为75％、85％、95％、100％的酒精中浸泡40分钟，得到脱水后的黑老虎根。

步骤五：将二甲苯和无水酒精按1:2的体积比混合，得到第一混合液；将二甲苯和无水酒精按2:1的体积比混合，得到第二混合液；然后将步骤五所得的脱水后的黑老虎的根放入无水酒精中浸泡10分钟，然后取出再放入第一混合液中浸泡15分钟；再取出放入第二混合液中浸泡20分钟；最后取出放入二甲苯中浸泡30分钟，即得到所述透明的黑老虎根。

步骤六：向步骤五所得的透明的黑老虎根中加入碎蜡，在温度为40℃的条件下保存10小时，取出浸蜡的黑老虎根加入纯石蜡并调节温度至55℃，保存9小时，期间每个3小时取出黑老虎根至新的纯石蜡一次，得到包埋好的黑老虎根。

步骤七：取出包埋好的黑老虎根，采用自动切片机将黑老虎根切割成12μm的根切片。

步骤八：用粘片剂将根切片粘附在载玻片上，并于35℃条件下将载玻片烤干，得到干燥的根切片。

步骤九：将干燥的根切片经过复水再脱水处理后进行染色，最后用封固剂将切片封固，即得到所述黑老虎根的切片。

对比例3

将实施例1的步骤八替换为：取出包埋好的黑老虎根，采用自动切片机将黑老虎根切割成8μm的根切片。其余的参数均与实施例1完全相同，制备方法也完全相同。

为了说明本发明的效果，申请人采用本发明实施例1、实施例3、实施例4、实施例5、对比例1、对比例2以及对比例3的方法制备黑老虎根的石蜡切片，并在显微镜下观察拍照，分别得到图1—图7。由图可以看出，图1—图4切片中组织结构脉络清晰、细胞清晰可见，可以用于黑老虎真伪的鉴别；图5切片中的组织结构比较碎，细胞轮廓不清晰，难以用于黑老虎真伪的鉴别；图6切片中有大面积的组织结构看不到，其他部分的组织结构也不够清晰，不便用于黑老虎的鉴别；图7切片中边缘部分的组织结构比较碎，中间也有部分出现组织结构碎化、不清楚的现象，用于黑老虎的鉴别需要耗费较多的时间来进行观察比对。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此，在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.一种黑老虎根的切片制备方法，其特征在于：将黑老虎根为原料经过软化剂的浸泡并采用超声处理以后，再进行后续的步骤，最终得到黑老虎根的切片。

2.如权利要求1所述的黑老虎根的切片制备方法，其特征在于：所述软化剂包括以下重量份的原料：

5份质量浓度为50％的氢氧化钾或氢氧化钠溶液、3份体积分数为30％的丙三醇以及2份超纯水。

3.如权利要求1所述的黑老虎根的切片制备方法，其特征在于：所述软化剂通过以下步骤制备：

量取5份质量浓度为50％的氢氧化钾或氢氧化钠溶液，加入3份体积分数为30％的丙三醇以及2份超纯水，搅拌至完全溶解，即得到所述软化剂。

4.如权利要求1所述的黑老虎根的切片制备方法，其特征在于，所述超声处理为：

将黑老虎的根完全浸泡在所述软化剂中，采用可加热的超声仪在温度50—60℃、80Hz的条件下进行软化处理5次，每次30分钟。

5.如权利要求1所述的黑老虎根的切片制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：配制软化剂：量取5份质量浓度为50％的氢氧化钾或氢氧化钠溶液，加入3份体积分数为30％的丙三醇、2份超纯水，搅拌至完全溶解，得到软化剂；

步骤二：将超声仪的温度调节至50—60℃，把干燥的黑老虎的根浸泡于软化剂中转移至超声仪中，在80Hz条件下进行超声处理5次，每次30分钟，得到软化的黑老虎根；

步骤三：配制固定液：取5份福尔马林溶液、5份正丙酸或冰醋酸溶液、90份浓度为70％的酒精混合，得到固定液；

步骤四：将步骤二所得的软化的黑老虎根切割成5mm的小块，放入步骤三所得的固定液中进行固定24小时，得到固定好的黑老虎根；

步骤五：将步骤四所得的固定好的黑老虎根取出，并依次转入体积浓度为75％、85％、95％、100％的酒精中浸泡40—45分钟，得到脱水后的黑老虎根；

步骤六：将步骤五所得的脱水后的黑老虎的根放入透明剂中进行透明处理70—90分钟，得到透明的黑老虎根；

步骤七：向步骤六所得的透明的黑老虎根中加入碎蜡，在温度为40℃的条件下保存10—20小时，取出浸蜡的黑老虎根加入纯石蜡并调节温度至55—60℃，保存9—15小时，期间每个3—5小时取出黑老虎根至新的纯石蜡一次，得到包埋好的黑老虎根；

步骤八：取出包埋好的黑老虎根，采用自动切片机将黑老虎根切割成12—18μm的根切片；

步骤九：用粘片剂将根切片粘附在载玻片上，并于35—45℃条件下将载玻片烤干，得到干燥的根切片；

步骤十：将干燥的根切片经过复水再脱水处理后进行染色，最后用封固剂将切片封固，即得到所述黑老虎根的切片。

6.如权利要求5所述的黑老虎根的切片制备方法，其特征在于，所述透明剂可以是二甲苯或环保透明剂。

7.如权利要求5所述的黑老虎根的切片制备方法，其特征在于，所述透明处理的步骤为：

S1：将二甲苯和无水酒精按1:2的体积比混合，得到第一混合液；将二甲苯和无水酒精按2:1的体积比混合，得到第二混合液；

S2：将步骤五所得的脱水后的黑老虎的根放入无水酒精中浸泡10—15分钟，然后取出再放入第一混合液中浸泡15—20分钟；再取出放入第二混合液中浸泡20—25分钟；最后取出放入二甲苯中浸泡25—30分钟，即得到所述透明的黑老虎根。