CN106053126A - 一种福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法 - Google Patents

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王兰梅
董在杰
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Abstract

本发明涉及一种福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法，属于组织切片技术领域。其从福瑞鲤中取出成熟卵巢组织，经过固定、去脂、脱水、包埋和冷冻切片后得到福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片。相较于一般的冷冻切片法，本发明通过纯丙酮去脂，可高效去除福瑞鲤卵巢发育后期过多的脂肪，从而获得高质量、结构更清晰的卵巢冷冻切片。为福瑞鲤卵巢基因的免疫组化等组织定位以及功能研究提供重要且可靠的分子实验材料，并对福瑞鲤优良经济性状的分子机制探讨具有重要意义。

Description

一种福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法
技术领域
本发明涉及一种福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法，属于组织切片技术领域。
背景技术
福瑞鲤（FFRC Cyprinus carpio）以建鲤和黄河鲤为原始亲本，采用完全双列杂交的方法，在PIT标记的辅助下经1代群体选育和连续4代BLUP家系选育而得到的水产养殖新品种，获得了较大的遗传进展，生长性状得到显著提高，是农业部“十二五”主推的大宗淡水养殖鱼类新品种，目前已在国内绝大部分地区推广养殖。随着分子生物学的发展，探讨新品种优良经济性状的分子机制， 从而向分子育种技术过渡必将成为水产育种技术的发展趋势。而通过制作组织切片进行基因定位的研究，对基因功能的探讨从而揭示分子机制则尤为重要。
随着福瑞鲤性腺的发育成熟，其脂肪的积累逐渐增多，对卵巢组织冷冻切片的脱水过程以及切片后组织结构的观察影响很大，更不利于后期利用免疫组化等进行基因的定位研究。目前，很多研究都针对免疫组化等基因定位过程的改良方法，对冷冻切片的去脂前处理方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法。
按照本发明提供的技术方案，一种福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法，其特征是步骤如下：
（1）固定：从福瑞鲤中取出卵巢组织，切取适合大小的样品块用 1×PBS缓冲液冲洗后置于质量浓度为3.5%-4.5%的多聚甲醛中过夜固定；
（2）去脂：取出步骤（1）固定后所得卵巢组织，放入纯丙酮中处理2-3h；
（3）脱水：取出步骤（2）所得去脂后的卵巢组织，用1×PBS缓冲液冲洗后，置于质量浓度为10%-30%的蔗糖溶液中脱水，直至一般组织沉底；
（4）包埋：从步骤（3）的蔗糖溶液中取出组织，用1×PBS缓冲液冲洗后，采用OTC包埋剂在冷冻切片机里-20~-30℃下冷冻包埋；
（5）冷冻切片：将步骤（4）所得包埋块切成合适大小，然后在冷冻切片机上切片；将切片贴到载玻片上，-80℃冰箱冷冻保存，用于后期免疫组化等基因组织定位研究。
步骤（3）所述蔗糖溶液中脱水时，共脱水3次，蔗糖溶液的浓度依次递增。所述蔗糖溶液为质量浓度10%、20%和30%蔗糖溶液。
所述切片大小为3×5mm，厚度为6-9μm。
本发明的有益效果：本发明可快速获得结构完整的福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片，经过去脂处理，可以有效地缩短制片的周期，且结构清晰，有利于较快开展福瑞鲤基因的组织定位以及功能研究，对福瑞鲤优良经济性状的分子机制探讨具有重要意义。本发明提供的卵巢组织冷冻切片的方法也可借鉴应用到其它水生动物的脂肪含量较多的卵巢组织冷冻切片的制作中。
附图说明
图1是本发明处理后福瑞鲤成熟卵巢组织β-catenin基因的免疫组化图。
图2是未经去脂处理的福瑞鲤成熟卵巢组织β-catenin基因的免疫组化图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，但不构成对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法, 通常按照常规条件, 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1、取样前配制所需试剂
（1）1×PBS:
①称下列试剂，置于1L烧杯中：NaCl：8g；KCl: 0.2g；Na2HPO4•12H2O：3.58g；KH2PO4：0.27g；
②向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解；
③加NaOH，将PH调至7.4，然后加入去离子水定容至1L；
④高温高压灭菌后，室温保存。
（2）4%多聚甲醛：4g多聚甲醛+100mL 1×PBS，加少许NaOH，在水浴锅中60℃加热直至完全溶解。4℃冰箱保存，保存期1周。现用现配。
（3）蔗糖溶液：
10%蔗糖溶液：10g蔗糖+90ml 1×PBS；
20%蔗糖溶液：20g蔗糖+80ml 1×PBS；
30%蔗糖溶液：30g蔗糖+70ml 1×PBS；
2、冷冻切片制备
（1）固定：从雌性福瑞鲤中取出卵巢组织，切取适合大小的小块样品， 1×PBS冲洗后置于4%多聚甲醛中固定，过夜。
（2）去脂：福瑞鲤成熟卵巢组织的脂肪含量过多，将其放入纯丙酮中处理2-3小时；
（3）脱水：从纯丙酮中取出样品块，1×PBS冲洗后，置于10%蔗糖溶液中脱水，一般组织沉底即可，然后依次置于20%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液中脱水直至其沉下。
（4）包埋：从步骤（3）的蔗糖溶液中取出组织，用1×PBS缓冲液冲洗后，采用OTC包埋剂在冷冻切片机里-20℃~-30℃下冷冻包埋；
3、冰冻切片切取
将带有福瑞鲤卵巢组织的包埋剂块—样品块切成3×5mm 的大小，在LEICA CM1850冷冻切片机上切成8μm左右的切片，将切片贴到载玻片上，-80℃冰箱冷冻保存。
具体操作见冷冻切片机说明书。
4、免疫组化操作方法：免疫组化染色技术的操作流程参照Multhoff的方法(Multhoff, 2007)和相关的试剂盒说明书进行。
具体为：冷冻切片用0.01 M的PBS清洗三次（每次10 min）后，用0.1% Tween 20的柠檬酸缓冲液 (pH 6) 浸透，高压处理5min；封闭液处理，与基因一抗抗体（浓度根据预实验确定）4℃过夜孵育，然后用0.01M PBS清洗三次(每次5 min)；随后，将组织切片与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗共孵育30min，再用PBS漂洗三次，每次5min；以二氨基联苯胺DAB (diaminobenzidine, DAB) 作为底物观察免疫反应信号。相应的组织学切片使用HE(hematoxylin-eosin, HE) 染色方法进行染色，同时将组织切片与未经过免疫处理的兔血清共孵育及封闭液处理作为阴性对照。
实验结果：图1 显示利用本发明所采用的去脂处理制作的冷冻切片，福瑞鲤成熟卵巢组织β-catenin基因的免疫组化图。图2 为未经去脂处理制作的冷冻切片，福瑞鲤成熟卵巢组织β-catenin基因的免疫组化图。
由图2可见，其由于脂肪含量过高，使得结构不清晰、不完整，从而影响免疫组化定位结果。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法，其特征是步骤如下：
（1）固定：从福瑞鲤中取出卵巢组织，切取适合大小的样品块用 1×PBS缓冲液冲洗后置于质量浓度为3.5%-4.5%的多聚甲醛中过夜固定；
（2）去脂：取出步骤（1）固定后所得卵巢组织，放入纯丙酮中处理2-3h；
（3）脱水：取出步骤（2）所得去脂后的卵巢组织，用1×PBS缓冲液冲洗后，置于质量浓度为10%-30%的蔗糖溶液中脱水，直至一般组织沉底；
（4）包埋：从步骤（3）的蔗糖溶液中取出组织，用1×PBS缓冲液冲洗后，采用OTC包埋剂在冷冻切片机里-20~-30℃下冷冻包埋；
（5）冷冻切片：将步骤（4）所得包埋块切成合适大小，然后在冷冻切片机上切片；将切片贴到载玻片上，-80℃冰箱冷冻保存。
2.如权利要求1所述福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法，其特征是：步骤（3）所述蔗糖溶液中脱水时，共脱水3次，蔗糖溶液的浓度依次递增。
3.如权利要求2所述福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法，其特征是：步骤（3）所述蔗糖溶液依次为质量浓度为10%、20%和30%蔗糖溶液。
4.如权利要求1所述福瑞鲤成熟卵巢组织冷冻切片的制作方法，其特征是：所述切片大小为3×5mm，厚度为6-9μm。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106769364A (zh) * 2016-12-06 2017-05-31 国家海洋局南海环境监测中心 一种浮游植物标本包埋剂及其应用
CN108572105A (zh) * 2018-04-13 2018-09-25 山东中医药大学 一种脑组织冰冻切片的制备方法
CN110106245A (zh) * 2018-12-03 2019-08-09 浙江省淡水水产研究所 一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法
CN110274807A (zh) * 2019-06-27 2019-09-24 浙江省海洋水产养殖研究所 一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法
CN110441084A (zh) * 2019-09-04 2019-11-12 海南省农业科学院热带果树研究所 一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5432056A (en) * 1993-11-15 1995-07-11 Ventana Medical Systems, Inc. Bisulfite-based tissue fixative
US5460797A (en) * 1991-05-08 1995-10-24 Streck Laboratories, Inc. Method for fixing tissues and cells for analysis using oxazolidine compounds
US5679333A (en) * 1996-10-25 1997-10-21 Dunphy; Brian William Formaldehyde-free tissue preservative compositions
WO1999009390A1 (en) * 1997-08-20 1999-02-25 The University Of Miami A high quality, continuous throughput, tissue fixation-dehydration-fat removal-impregnation method

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5460797A (en) * 1991-05-08 1995-10-24 Streck Laboratories, Inc. Method for fixing tissues and cells for analysis using oxazolidine compounds
US5432056A (en) * 1993-11-15 1995-07-11 Ventana Medical Systems, Inc. Bisulfite-based tissue fixative
US5679333A (en) * 1996-10-25 1997-10-21 Dunphy; Brian William Formaldehyde-free tissue preservative compositions
WO1999009390A1 (en) * 1997-08-20 1999-02-25 The University Of Miami A high quality, continuous throughput, tissue fixation-dehydration-fat removal-impregnation method

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RESEARCHGATE: "cryoprotection with sucrose 30% after neutral-buffered formalin(NBF) fixation", 《HTTPS://WWW.RESEARCHGATE.NET/POST/CRYOPROTECTION_WITH_SUCROSE_30_AFTER_NEUTRAL-BUFFERED_FORMALIN_NBF_FIXATION》 *
蔡俊杰: "如何制作好活检大小标本", 《病理之家PATHOLOGY-HOME.COM/HTML/PATHOLOGY/20051207_1.SAP》 *
雪地里的稻草人: "冰冻切片", 《新浪网BLOG.SINA.COM.CN/BLOG_4A215DF70100FERB.HTML》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106769364A (zh) * 2016-12-06 2017-05-31 国家海洋局南海环境监测中心 一种浮游植物标本包埋剂及其应用
CN106769364B (zh) * 2016-12-06 2019-07-26 国家海洋局南海环境监测中心 一种浮游植物标本包埋剂及其应用
CN108572105A (zh) * 2018-04-13 2018-09-25 山东中医药大学 一种脑组织冰冻切片的制备方法
CN110106245A (zh) * 2018-12-03 2019-08-09 浙江省淡水水产研究所 一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法
CN110106245B (zh) * 2018-12-03 2022-12-30 浙江省淡水水产研究所 一种适于翘嘴鲌性腺组织mRNA冰冻切片原位杂交的方法
CN110274807A (zh) * 2019-06-27 2019-09-24 浙江省海洋水产养殖研究所 一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法
CN110274807B (zh) * 2019-06-27 2021-07-30 浙江省海洋水产养殖研究所 一种南美白对虾性腺组织冷冻切片的制作方法
CN110441084A (zh) * 2019-09-04 2019-11-12 海南省农业科学院热带果树研究所 一种菠萝蜜果肉的冰冻切片方法

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