CN105043841A - 一种硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法及其用途，在蚕丝组织工程韧带取材、固定后用树脂包被、做硬组织切片，利用苦味酸天狼猩红染色检测I、III型胶原分泌情况。本发明在硬组织切片上进行苦味酸天狼猩红染色，节省了标本处理的时间，简化了操作步骤，并且可在硬组织切片上直接观察I、III型胶原。

Description

一种硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测蚕丝组织工程韧带I、III型胶原的方法。

背景技术

前交叉韧带对膝关节正常的运动和稳定有十分重要的作用。前交叉韧带损伤后愈合能力极低，往往需要移植重建手术。韧带移植物的来源主要有自体或同种异体韧带移植和组织工程韧带。常用的自体韧带移植来源不足，而异体韧带移植物易造成免疫排斥。蚕丝组织工程韧带由于其良好的力学特性、可降解性及低免疫排斥性越来越受到重视。

蚕丝韧带移植物植入体内后常需要检测I、III型胶原的生成情况以判断其韧带组织的重建及与骨道交界处的结合情况。迄今为止，有多种检测胶原蛋白的方法，如免疫荧光、放射性核素标记、RT-PCR、Westernblot及免疫组织化学染色法等，上述方法多需要脱钙后石蜡切片或冰冻切片，故存在标本处理周期长，步骤繁琐、成本较高的问题，且难以在同一张切片上完成多型胶原的检测与观察。

蚕丝组织工程韧带常用的免疫组化染色需要对组织进行脱钙(约1月)，石蜡包埋或冰冻切片，染色需要修复抗原及孵育二抗等步骤，操作复杂、耗时长，而且由于蚕丝在切片后变成小段蚕丝，结构非常容易脱落。目前利用硬组织切片苦味酸天狼猩红染色检测I、III型胶原的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法及其用途。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。

一种硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法，包括以下步骤：

1)将标本用多聚甲醛固定后依次进行脱水和树脂包埋得样本；

2)利用硬组织切片机将样本切成150～200μm的样本切片后利用速干胶粘于树脂片上；将树脂片上的样本切片利用磨片机磨至30～50μm后抛光；

3)经过步骤2)后，利用苦味酸天狼猩红染液浸染树脂片上经抛光的样本切片1～1.5小时，然后流水冲洗附着的染液，然后依次脱水、透明，然后利用树胶封片得检测样片。

所述标本取材自蚕丝组织工程韧带。

上述硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法在检测蚕丝组织工程韧带I、III型胶原中的用途。

本发明的有益效果体现在：

本发明在标本(例如蚕丝组织工程韧带)取材、固定后用树脂包被、做硬组织切片，利用苦味酸天狼猩红染色，通过硬组织切片苦味酸天狼猩红染色观察由蚕丝韧带移植物重建得到的蚕丝组织工程韧带中I、III型胶原分泌情况，该方法样本需要处理的步骤少，时间短、成本低，在蚕丝组织工程韧带检测I、III型胶原上避免了常规染色的脱片现象，有效减少了由于组织缺失产生的观察误差。

附图说明

图1为免疫组化染色结果；其中：A、D分别为I、III型胶原1月取材染色；B、E分别为I、III型胶原2月取材染色；C、F分别为I、III型胶原3月取材染色；白色箭头所示为I型胶原，黑色箭头所示为III型胶原。

图2为硬组织切片苦味酸天狼猩红染色结果；其中：A、B、C分别为1、2、3月取材苦味酸天狼猩红染色；白色箭头所示为I型胶原，黑色箭头所示为III型胶原。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

蚕丝韧带移植物的制备和移植：编织机平针编织蚕丝丝线为网状结构，脱丝胶后，分区利用蚕丝溶液冻干造海绵状结构(内部区)，蚕丝溶液冻干后修饰羟基磷灰石(外部区)。辐照消毒后在内部区种植骨髓间充质干细胞，外部区种植成骨细胞，然后卷折成圆柱状后植入已造的兔前交叉韧带缺损模型中。

1)在植入后1、2、3月取材，取材时，处死动物，取前交叉韧带移植后的股骨远端和胫骨近端约5厘米(标本)，然后用多聚甲醛固定、脱水后，进行树脂包埋得到样本；

步骤1)中：

所述多聚甲醛固定的具体步骤以及工艺参数为：标本于质量浓度2.5～5％的多聚甲醛水溶液中浸泡固定7～14天；

所述脱水的具体步骤为：固定后，标本依次浸入70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、正丁醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2小时；

所述包埋的具体步骤为：脱水后，标本依次浸入1号试剂、2号试剂、3号试剂各5天，3号试剂在冰箱(4℃)中浸入。将标本干燥后置于包埋瓶中，调整标本方向，做上标签，加入4号试剂，然后放入抽真空泵内(-0.64大气压)，抽真空5小时。

1号试剂：甲基丙烯酸甲酯400mL，邻苯二甲酸二丁酯100mL以及二甲苯500mL组成。

2号试剂：甲基丙烯酸甲酯800mL以及邻苯二甲酸二丁酯200mL组成。

3号试剂：甲基丙烯酸甲酯800mL，过氧化苯甲酰20g以及邻苯二甲酸二丁酯200mL组成。

4号试剂：甲基丙烯酸甲酯800mL，过氧化苯甲酰60g以及邻苯二甲酸二丁酯200mL组成。

过氧化苯甲酰需在37℃温箱内干燥24小时后使用，3、4号试剂配制完毕后储存于4℃冰箱中。

2)利用硬组织切片机将样本切为150～200μm厚度的样本切片，将样本切片利用502速干胶粘于树脂片上，然后利用磨片机将样本切片磨至厚30～50μm，然后通过抛光机抛光；

3)经过步骤2)后，利用苦味酸天狼猩红染液浸染树脂片上的样本切片1～1.5小时，然后流水冲洗附着的染液，最后脱水、透明后利用树胶封片得检测样片；利用偏振光显微镜观察检测样片的I(红色)、III型(绿色)胶原；

步骤3)中：

所述苦味酸天狼猩红染液的制备方法为：将0.1～0.5g天狼猩红溶于100mL苦味酸饱和水溶液中。

所述流水冲洗的时间为5～10分钟。

所述脱水、透明的步骤以及工艺参数为：依次浸入80％乙醇1分钟，95％乙醇1分钟、无水乙醇2分钟，脱水完成，然后浸入二甲苯2分钟进行透明。

如图1所示，免疫组化染色可见材料出现掉片现象，而且材料上虽然可以看出随着时间的增加I、III型胶原逐渐增多，但材料上的I、III型胶原由于掉片不能明确染出从而影响结果的判读。而硬组织切片苦味酸天狼猩红染色，蚕丝材料表现明确、轮廓清晰，I、III型胶原染色明显，而且随着时间的增多两种胶原均明显增多，结果判读影响小，如图2所示。

硬组织切片制作不需要脱钙，树脂包埋使得组织结合牢靠，不会脱落。天狼猩红为强酸性阴离子，易与胶原蛋白的碱性基团发生特异性的染色，染色方法简便易行，偏振光显微镜下非胶原不显色，胶原染色突出，利于观察。常规的天狼猩红染色利用石蜡或冰冻切片，存在切片步骤繁琐，组织制备过程需要脱钙处理，时间较长等缺陷。虽然免疫组化染色特异性强，但硬组织切片由于是树脂包被，所以无法免疫组化染色。而且对于蚕丝这种特殊的支架材料在冰冻和石蜡切片中，容易由于材料的粘贴的松动造成出现染色过程中的掉片现象。

硬组织切片苦味酸天狼猩红染色不仅操作简便，省时省力，成本低廉，还有效避免了免疫组化染色产生的脱片现象。

Claims (3)

1.一种硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将标本用多聚甲醛固定后依次进行脱水和树脂包埋得样本；

2)利用硬组织切片机将样本切成150～200μm的样本切片后利用速干胶粘于树脂片上；将树脂片上的样本切片利用磨片机磨至30～50μm后抛光；

3)经过步骤2)后，利用苦味酸天狼猩红染液浸染树脂片上的样本切片1～1.5小时，然后流水冲洗附着的染液，然后依次脱水、透明，最后利用树胶封片得检测样片。

2.根据权利要求1所述一种硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法，其特征在于：所述标本取材自蚕丝组织工程韧带。

3.一种如权利要求1所述硬组织切片苦味酸天狼猩红染色方法在检测蚕丝组织工程韧带I、III型胶原中的用途。