CN103525119B - 一种软骨染色液、骨骼染色方法以及利用该方法制备胚胎骨骼标本的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种软骨染色液、骨骼染色方法以及利用该方法制备胚胎骨骼标本的方法，该染色液的pH范围为5-7，且每升染色液中至少含有0.14g的阿利新蓝。本发明的有益效果为：本发明利用阿利新蓝和茜素红可使骨骼快速染色，阿利新蓝和茜素红均为酸性物质染料，阿利新蓝用于动物骨骼中软骨的染色，茜素红用于骨骼中硬骨的染色，染色效果明显，骨骼与肌肉颜色区别较为清楚，染色方法简单，无需大量人力、物力，另外鸭胚胎骨骼标本的制作方法在保持标本外形完整的情况下显示出体内骨骼部分，便于观察，为研究和教学提供便利，制作方法操作简单，周期较短，普通科技人员均可以制作。
Description
技术领域
本发明涉及标本制备领域，具体而言，涉及一种软骨染色液、骨骼染色方法以及利用该方法制备胚胎骨骼标本的方法。
背景技术
家禽的骨骼在生长发育过程中不形成骨骺的次级骨化中心，所以无骨骺和骨骺软骨，骨的加长主要依赖于骨端软骨的增生和骨化。家禽的骨骼与哺乳动物等差异较大，家禽的骨骼具有强度大而重量轻的特点，含有较多的无机钙盐，并且躯干部有些骨已经互相愈合。
动物标本在生物学科研、教学以及科普工作中占有特别重要的地位，骨骼标本是研究动物骨骼的形态结构及其与其他器官相互关系的主要材料，动物骨骼的标本和骨骼标本制作技术也见于一些教科书和杂志文章，传统的骨骼标本制作方法一般包括：剔肉、去骨髓、腐蚀、漂白、串装等步骤，制作过程繁琐，尤其是剔肉和最后的串装步骤，工作量大且需要操作者具有较强的专业知识和操作技能，否则会造成骨骼的损坏和骨骼安装的错误，制作周期长，另外传统的骨骼制作方法主要适用于体型相对较大的动物，以及骨骼发育基本完成的动物，对于骨骼尚未钙化及硬化的胚胎则难以完成标本制作工作，实用性较低，应用范围比较局限，不适用于类似家鸭这种体型较小的动物，所以不能被人们广泛使用。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种软骨染色液、骨骼染色方法以及利用该方法制备胚胎骨骼标本的方法。
本发明实施例中提供了一种软骨染色液，该染色液的pH范围为5-7，且每升染色液中至少含有0.14g的阿利新蓝。
进一步的，该染色液中还包括无水乙醇、冰醋酸和水。
优选的，每升该染色液中包括阿利新蓝为0.14g-0.16g、无水乙醇690mL-710mL、冰醋酸40mL-60mL和水230mL-270mL。
本发明实施例中还提供了一种骨骼染色方法，该方法包括以下步骤：
401：染色剂的制备：染色剂包括软骨染色液和硬骨染色液，软骨染色液中包括阿利新蓝、无水乙醇、冰醋酸和水，硬骨染色液中包括茜素红、无水乙醇和水；
402：经过脱脂后的骨骼浸泡于软骨染色液中染色2-3天；
403：将骨骼由软骨染色液中取出后，使用70%的酒精溶液反复进行清洗，直至冲洗液颜色无色；
404：清洗后的骨骼浸泡在硬骨染色液中染色2-3天，然后取出，即得到染色后的骨骼。
优选的，步骤401中，每升软骨染色液中包括阿利新蓝0.14g-0.16g、无水乙醇690mL-710mL、冰醋酸40mL-60mL和水230mL-270mL；每升硬骨染色液中包括茜素红0.04g-0.06g、无水乙醇690mL-710mL和水290mL-310mL。
本发明实施例中进一步提供了一种利用骨骼染色方法制备胚胎骨骼标本的方法，该方法包括以下步骤：
601：取动物胚胎并剥去表皮，去除骨骼和腹腔内的脂肪，并清洗干净；
602：标本固定：将处理后的骨骼整理好姿势后，浸泡于95%的酒精固定液中固定1天，然后再次浸泡于新的95%的酒精固定液中固定2-3天，直至标本脱水硬化；
603：脱脂：将固定后的标本浸泡于丙酮溶液内脱脂2-3天，取出后用水持续冲洗8-16小时，直至标本可以沉入水底为止；
604：染色：将标本浸泡于软骨染色液中2-3天，取出后使用70%的酒精溶液反复进行清洗，直至冲洗液颜色无色，然后将标本浸泡于硬骨染色液中2-3天，然后取出，即得到染色后的骨骼标本；
605：脱色：将染色后的标本依次浸泡于不同浓度的KOH溶液中，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色；
606：将脱色后的标本依次浸泡于不同比例的1%的KOH溶液与丙三醇的梯度溶液中，每次均以标本沉入梯度溶液底部为准，最终将标本置于纯甘油中进行密封保存。
进一步的，步骤604中，每升软骨染色液中包括阿利新蓝0.14g-0.16g、无水乙醇690mL-710mL、冰醋酸40mL-60mL和水230mL-270mL；每1升硬骨染色液中包括茜素红0.04g-0.06g、无水乙醇690mL-710mL和水290mL-310mL。
进一步的，步骤605中，将染色后的标本浸泡于2%的KOH溶液中8-12小时，再浸泡于1.5%的KOH溶液中12-24小时，最后浸泡于1%的KOH溶液中2-3天，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色。
进一步的，步骤606中，1%的KOH溶液与丙三醇所形成的梯度溶液的配比比例分别为：1:4、2:3、3:2、4:1，标本在梯度溶液中浸泡的时间为1-2天。
本发明的有益效果为：本发明利用阿利新蓝和茜素红可使骨骼快速染色，阿利新蓝和茜素红均为酸性物质染料，阿利新蓝用于动物骨骼中软骨的染色，茜素红用于骨骼中硬骨的染色，染色效果明显，骨骼与肌肉颜色区别较为清楚，染色方法简单，无需大量人力物力，另外鸭胚胎骨骼标本的制作方法在保持标本外形完整的情况下显示出体内骨骼部分，从而显示出鸭胚胎发育过程中的骨骼发育情况，便于观察，为研究和教学等提供便利，并且该胚胎骨骼标本制作方法操作简单，周期较短，普通科技人员均可以制作。
附图说明
图1为本发明实施例所述的一种骨骼染色方法的流程图；
图2为本发明实施例所述的一种利用骨骼染色方法制备胚胎骨骼标本的方法的流程图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
本发明实施例所述的一种软骨染色液，该染色液的pH范围为5-7，且每升染色液中至少含有0.14g的阿利新蓝。本发明利用阿利新蓝可使骨骼中的软骨快速染色，阿利新蓝为酸性物质染料，在pH为5-7的染色液中染色效果明显，骨骼与肌肉颜色区别较为清楚，染色方法简单，无需大量人力、物力。
进一步的，该染色液中还包括无水乙醇、冰醋酸和水。冰醋酸为该染色液中提供酸性环境，保证了该溶液的pH为5-7。无水乙醇提供一个无毒的环境，可以使溶液中的阿利新蓝快速的进入到骨质中，染色速度加快，节省了染色的时间。
进一步的，每升该染色液中包括阿利新蓝0.14g-0.16g、无水乙醇690mL-710mL、冰醋酸40mL-60mL和水230mL-270mL。阿利新蓝为酸性物质染料，染料与酸性基团形成盐键，利用染料的不同pH及不同电解质浓度，可区分酸性黏液物质的类别，可以对骨骼中的软骨进行染色，在酸性环境下，呈蓝色，染色效果明显，对于胚胎时期的骨骼，每升软骨染色液中含有阿利新蓝0.14g-0.16g已经足以满足染色效果，含量过多不仅造成染料的浪费且染色颜色较深；染料过少将导致染色不均匀，染色效果不明显。冰醋酸主要用于提供酸性环境，操作简单，无水乙醇主要为染料液提供无毒环境，防止骨骼在浸泡过程中发霉、变质甚至腐烂。
如图1所示，本发明实施例中还提供了一种骨骼染色方法，该方法包括以下步骤：
401：染色剂的制备：染色剂包括软骨染色液和硬骨染色液，软骨染色液中包括阿利新蓝、无水乙醇、冰醋酸和水，硬骨染色液中包括茜素红、无水乙醇和水；
402：经过脱脂后的骨骼浸泡于软骨染色液中染色2-3天；
403：将骨骼由软骨染色液中取出后，使用70%的酒精溶液反复进行清洗，直至冲洗液颜色无色；
404：清洗后的骨骼浸泡在硬骨染色液中染色2-3天，然后取出，即得到染色后的骨骼。
本发明利用阿利新蓝和茜素红可使骨骼快速染色，阿利新蓝和茜素红均为酸性物质染料，阿利新蓝用于动物骨骼中软骨的染色，茜素红用于骨骼中硬骨的染色，染色效果明显，骨骼与肌肉颜色区别较为清楚，染色方法简单，无需大量人力物力，操作简单，使用方便，时间短，节省了大量的劳动和时间。
优选的，步骤401中，每升软骨染色液中包括阿利新蓝0.14g-0.16g、无水乙醇690mL-710mL、冰醋酸40mL-60mL和水230mL-270mL；每升硬骨染色液中包括茜素红0.04g-0.06g、无水乙醇690mL-710mL和水290mL-310mL。阿利新蓝为酸性物质染料，染料与酸性基团形成盐键，利用染料的不同pH及不同电解质浓度，可区分酸性黏液物质的类别，可以对骨骼中的软骨进行染色，在酸性环境下，呈蓝色，染色效果明显，对于胚胎时期的骨骼，每升软骨染色液中含有阿利新蓝0.14g-0.16g已经足以满足染色效果，染料过多不仅产生染料的浪费且染色颜色较深；染料过少，将导致染色不均匀，染色效果不明显。冰醋酸主要用于提供酸性环境，操作简单，无水乙醇则用于提供整个染料液的无毒环境，防止骨骼在浸泡过程中发霉、变质甚至腐烂。茜素红作为一种染色溶质，主要对骨骼中的硬骨进行染色，茜素红的量为0.04g-0.06g已经足以满足染色效果，过多不仅产生染料的浪费且染色颜色较深，染料过少，将导致染色不均匀，染色效果不明显，无水乙醇则提供整个染料液的无毒环境，防止骨骼在浸泡过程中发霉、变质甚至腐烂。
如图2所示，本发明实施例中进一步提供了一种利用骨骼染色方法制备胚胎骨骼标本的方法，该方法包括以下步骤：
601：取动物胚胎并剥去表皮，去除骨骼和腹腔内的脂肪，并清洗干净；
602：标本固定：将处理后的骨骼整理好姿势后，浸泡于95%的酒精固定液中固定1天，然后再次浸泡于新的95%的酒精固定液中固定2-3天，直至标本脱水硬化；
603：脱脂：将固定后的标本浸泡于丙酮溶液内脱脂2-3天，取出后用水持续冲洗8-16小时，直至标本可以沉入水底为止；
604：染色：将标本浸泡于软骨染色液中2-3天，取出后使用70%的酒精溶液反复进行清洗，直至冲洗液颜色无色，然后将标本浸泡于硬骨染色液中2-3天，然后取出，即得到染色后的骨骼标本；
605：脱色：将染色后的标本依次浸泡于不同浓度的KOH溶液中，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色；
606：将脱色后的标本依次浸泡于不同比例的1%的KOH溶液与丙三醇的梯度溶液中，每次均以标本沉入梯度溶液底部为准，最终将标本置于纯甘油中进行密封保存。
胚胎骨骼标本的制作方法在保持标本外形完整的情况下显示出体内骨骼部分，从而显示出胚胎发育过程中的骨骼发育情况，便于观察，为研究和教学等提供便利，并且该胚胎骨骼标本制作方法操作简单，周期较短，普通科技人员均可以制作。本方法主要运用骨骼染色方法进行制作，克服了现有技术只能适用于大型动物标本的制作的缺陷，本方法可适用于胚胎时期孵化的动物骨骼，操作简单，使用方便；在标本的制作方法中，由于染色剂的改变，从而缩短了标本制作的时间，同时染色效果明显，可以很清楚的看出染色的效果，以及标本中骨骼的形状，节省了工作人员的时间，操作简单、方便。
该方法中，由于染色剂的改变，同时改变了该骨骼的染色过程，由现有的一次性染色转化为层次性的染色，首先在软骨染色液中进行染色，然后在硬骨染色液中进行染色，这种两步法的染色方法缩短了染色的时间，同时染色效果明显，节省了工作人员的时间，操作方便。
进一步的，步骤604中，每升软骨染色液中包括阿利新蓝0.14g-0.16g、无水乙醇690mL-710mL、冰醋酸40mL-60mL和水230mL-270mL；每升硬骨染色液中包括茜素红0.04g-0.06g、无水乙醇690mL-710mL和水290mL-310mL。阿利新蓝为酸性物质染料，染料与酸性基团形成盐键，利用染料的不同pH及不同电解质浓度，可区分酸性黏液物质的类别，可以对骨骼中的软骨进行染色，在酸性环境下，呈蓝色，染色效果明显，对于胚胎时期的骨骼，每升软骨染色液中含有阿利新蓝0.14g-0.16g已经足以满足染色效果，染料过多不仅产生染料的浪费且染色颜色较深；染料过少，将导致染色不均匀，染色效果不明显。冰醋酸主要用于提供酸性环境，操作简单，无水乙醇主要为整个染料液提供的无毒环境，防止骨骼在浸泡过程中发霉、变质甚至腐烂。茜素红作为一种染色溶质，主要对骨骼中的硬骨进行染色，茜素红的量为0.04g-0.06g已经足以满足染色效果，过多不仅产生染料的浪费且染色颜色较深，染料过少，将导致染色不均匀，染色效果不明显，无水乙醇则提供整个染料液的无毒环境，防止骨骼在浸泡过程中发霉、变质甚至腐烂。
进一步的，步骤605中，将染色后的标本浸泡于2%的KOH溶液中8-12小时，再浸泡于1.5%的KOH溶液中12-24小时，最后浸泡于1%的KOH溶液中2-3天，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色。
进一步的，步骤606中，1%的KOH溶液与丙三醇所形成的梯度溶液的配比比例分别为：1:4、2:3、3:2、4:1，标本在梯度溶液中浸泡的时间为1-2天。
实施例1：选用鸭胚胎骨骼来制作标本，本发明提供了一种利用骨骼染色方法制备鸭胚胎骨骼标本的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将孵化14后的鸭种蛋中取出胚胎，剥去表皮，去除骨骼和腹腔内的脂肪，从肛门前开一小口从中掏出内脏，并清洗干净，处理完毕后要保持材料的形体完整；
（2）标本固定：将处理后的鸭胚骨骼整理好姿势后，浸泡于95%的酒精固定液中固定1天，然后再次浸泡于新的95%的酒精固定液中固定2天，直至标本脱水硬化；
（3）脱脂：将固定后的标本浸泡于丙酮溶液内脱脂2天，取出后用水持续冲洗8小时，直至标本可以沉入水底为止；
（4）染色：将标本浸泡与染色剂中进行染色，染色剂包括软骨染色液和硬骨染色液，将标本浸泡于软骨染色液中2天，取出后使用70%的酒精溶液反复进行清洗，直至冲洗液颜色无色，然后将标本浸泡于硬骨染色液中2天；每升软骨染色液中包括阿利新蓝0.14g、无水乙醇690mL、冰醋酸40mL和水270mL，每升硬骨染色液中包括茜素红0.04g、无水乙醇690mL和水310mL；
（5）脱色：将染色后的标本浸泡于2%的KOH溶液中8小时，再浸泡于1.5%的KOH溶液中12小时，最后浸泡于1%的KOH溶液中2天，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色；
（6）将脱色后的标本依次浸泡于不同比例的1%的KOH溶液与丙三醇的梯度溶液中，每次均以标本沉入梯度溶液底部为准，最终将标本置于纯甘油中进行密封保存；1%的KOH溶液与丙三醇所形成的梯度溶液的配比比例分别为：1:4、2:3、3:2、4:1，标本在梯度溶液中浸泡的时间为1天。
实施例2：选用鸭胚胎骨骼来制作标本，本发明提供了一种利用骨骼染色方法制备鸭胚胎骨骼标本的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将孵化21天后的鸭种蛋中取出胚胎，剥去表皮，去除骨骼和腹腔内的脂肪，从肛门前开一小口从中掏出内脏，并清洗干净，处理完毕后要保持材料的形体完整；
（2）标本固定：将处理后的鸭胚骨骼整理好姿势后，浸泡于95%的酒精固定液中固定1天，然后再次浸泡于新的95%的酒精固定液中固定2.5天，直至标本脱水硬化；
（3）脱脂：将固定后的标本浸泡于丙酮溶液内脱脂2.5天，取出后用水持续冲洗12小时，直至标本可以沉入水底为止；
（4）染色：将标本浸泡与染色剂中进行染色，染色剂包括软骨染色液和硬骨染色液，将标本浸泡于软骨染色液中2.5天，取出后使用70%的酒精溶液反复进行清洗，直至冲洗液颜色无色，然后将标本浸泡于硬骨染色液中2.5天；每升软骨染色液中包括阿利新蓝0.15g、无水乙醇700mL、冰醋酸50mL和水250mL，每升硬骨染色液中包括茜素红0.05g、无水乙醇700mL和水300mL；
（5）脱色：将染色后的标本浸泡于2%的KOH溶液中10小时，再浸泡于1.5%的KOH溶液中18小时，最后浸泡于1%的KOH溶液中2.5天，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色；
（6）将脱色后的标本依次浸泡于不同比例的1%的KOH溶液与丙三醇的梯度溶液中，每次均以标本沉入梯度溶液底部为准，最终将标本置于纯甘油中进行密封保存；1%的KOH溶液与丙三醇所形成的梯度溶液的配比比例分别为：1:4、2:3、3:2、4:1，标本在梯度溶液中浸泡的时间为1.5天。
实施例3：选用鸭胚胎骨骼来制作标本，本发明提供了一种利用骨骼染色方法制备鸭胚胎骨骼标本的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将孵化25天后的鸭种蛋中取出胚胎，剥去表皮，去除骨骼和腹腔内的脂肪，从肛门前开一小口从中掏出内脏，并清洗干净，处理完毕后要保持材料的形体完整；
（2）标本固定：将处理后的鸭胚骨骼整理好姿势后，浸泡于95%的酒精固定液中固定1天，然后再次浸泡于新的95%的酒精固定液中固定3天，直至标本脱水硬化；
（3）脱脂：将固定后的标本浸泡于丙酮溶液内脱脂3天，取出后用水持续冲洗16小时，直至标本可以沉入水底为止；
（4）染色：将标本浸泡与染色剂中进行染色，染色剂包括软骨染色液和硬骨染色液，将标本浸泡于软骨染色液中3天，取出后使用70%的酒精溶液反复进行清洗，直至冲洗液颜色无色，然后将标本浸泡于硬骨染色液中3天；每升软骨染色液中包括阿利新蓝0.16g、无水乙醇710mL、冰醋酸60mL和水230mL，每升硬骨染色液中包括茜素红0.06g、无水乙醇710mL和水290mL；
（5）脱色：将染色后的标本浸泡于2%的KOH溶液中12小时，再浸泡于1.5%的KOH溶液中24小时，最后浸泡于1%的KOH溶液中3天，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色；
（6）将脱色后的标本依次浸泡于不同比例的1%的KOH溶液与丙三醇的梯度溶液中，每次均以标本沉入梯度溶液底部为准，最终将标本置于纯甘油中进行密封保存；1%的KOH溶液与丙三醇所形成的梯度溶液的配比比例分别为：1:4、2:3、3:2、4:1，标本在梯度溶液中浸泡的时间为2天。
由上述实施例可知，本方法可适用于任何不同时期（胚胎孵化天数）的胚胎骨骼染色，尤其适用于小型的动物骨骼标本，克服了现有技术只能适用于大型动物的骨骼标本制作的缺陷，应用范围广泛，染色效果明显，肌肉颜色变浅，骨组织变为红色，便于观察；另外利用这种骨骼染色方法制作骨骼的标本，制作简单，制作成本低，制作周期短且效果好，可使骨骼的骨化部分清晰的显示，能满足医学、法医及科研工作的要求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种利用骨骼染色方法制备胚胎骨骼标本的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
301：取动物胚胎并剥去表皮，去除骨骼和腹腔内的脂肪，并清洗干净；其中，动物胚胎来自鸭；
302：标本固定：将处理后的骨骼整理好姿势后，浸泡于95％的酒精固定液中固定1天，然后再次浸泡于新的95％的酒精固定液中固定2-3天，直至标本脱水硬化；
303：脱脂：将固定后的标本浸泡于丙酮溶液内脱脂2-3天，取出后用水持续冲洗8-16小时，直至标本可以沉入水底为止；
304：染色：将标本浸泡于软骨染色液中2-3天，取出后使用70％的酒精溶液反复进行清洗，直至冲洗液颜色无色，然后将标本浸泡于硬骨染色液中2-3天，然后取出，即得到染色后的骨骼标本，
步骤304中，每升软骨染色液中包括阿利新蓝0.14g-0.16g、无水乙醇690mL-710mL、冰醋酸40mL-60mL和水230mL-270mL；每升硬骨染色液中包括茜素红0.04g-0.06g、无水乙醇690mL-710mL和水290mL-310mL；
305：脱色：将染色后的标本依次浸泡于不同浓度的KOH溶液中，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色；
将染色后的标本浸泡于2％的KOH溶液中8-12小时，再浸泡于1.5％的KOH溶液中12-24小时，最后浸泡于1％的KOH溶液中2-3天，直至肌肉颜色变浅，骨组织变为红色；
306：将脱色后的标本依次浸泡于不同比例的1％的KOH溶液与丙三醇的梯度溶液中，每次均以标本沉入梯度溶液底部为准，最终将标本置于纯甘油中进行密封保存；1％的KOH溶液与丙三醇所形成的梯度溶液的配比比例分别为：1:4、2:3、3:2、4:1，标本在梯度溶液中浸泡的时间为1-2天。
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2013
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| RU2819752C1 (ru) * | 2023-03-27 | 2024-05-23 | Дмитрий Андреевич Афанасьев | Методика изготовления сухих макропрепаратов млекопитающих |
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