CN107568198A - 制备小型动物透明骨骼标本的方法及以该方法制备的标本 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备小型动物透明骨骼标本的方法以及该方法制备得到的标本。本发明采用化学试剂使小动物肌肉变得透明，并采用染色剂进行浸泡，对动物身体不同部位进行显色和区分，直观准确地展现动物体硬骨和软骨原有的位置结构。本发明方法步骤简便，采用的试剂安全，可以用于制备金鱼、热带鱼、蛙或小鼠等小型动物的透明骨骼标本，制备得到的标本保持时间长久，显示结构清晰，有较高的科研和教学用价值。

Description

制备小型动物透明骨骼标本的方法及以该方法制备的标本

技术领域

本发明涉及动物标本制作领域，尤其是一种制备小型动物透明骨骼标本的方法以及采用该方法制备得到的标本。

背景技术

小型动物透明骨骼标本是一种通过解剖学方法对动物体进行处理、并采用化学试剂使小动物肌肉变得透明，从而显现出被染色的动物骨骼的标本。小型动物透明骨骼标本可以精确而直观地向我们展示动物体的骨骼形状和位置，犹如X光片一样。采用染色剂进行浸泡，可以对动物身体不同部位进行显色和区分，是比X光片更加直观的展现方式。透明骨骼标本能为科学研究提供准确的骨骼结构，相比传统的剥制骨骼标本，能更精确地展现动物硬骨和软骨的原有位置,有较高科研和教学用价值。同时，制备得到的彩色标本非常具有美观性，从长远看来将具有一定的市场价值。

目前，有关小型动物透明骨骼标本的制备方法的文献较少，现有方法有很多不确定性，成品率低，并且存在制备工艺时间长、得到的标本染色不清楚、透明度低、标本不能长久保存等缺点，尤其对硬骨进行染色通常要采用浓硫酸等危险试剂，不能普遍适用，有待进一步提高工艺条件。

因此，若能够开发一种操作步骤简便、采用的试剂安全、标本保持时间长久的制备透明骨骼标本的方法，必将有很大市场需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种更好的制备小型动物透明骨骼标本的方法。本发明通过一系列实验，摸索出一种操作步骤简便、工艺时间短、不需要危险试剂的制备方法，本发明采用的试剂安全、易得，可以用于制备金鱼、热带鱼、蛙或小鼠等小型动物的透明骨骼标本。

本发明还涉及由所述方法制备得到的小型动物的透明骨骼标本，采用本发明方法获得的标本结构染色清晰、透明度高，并且产品的成品率高、成品效果美观、保持时间长久。根据本发明的方法制备的标本既能使动物体各个精细结构展露无遗，又能从多角度呈现立体的骨骼结构，方便观察，避免了传统的解剖取骨清洗再组装而导致的骨骼相对位置的改变。

更具体说，本发明提供了一种制备小型动物透明骨骼标本的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)预处理：对新鲜小动物尸体进行解剖学处理，根据需要选择性地将动物体剥皮(剥去鳞片)和/或去除内脏及皮下脂肪，流水冲净；将动物体在无水乙醇中浸泡3-14天，优选5-10天，以使动物体硬化。

(2)去除脂肪：将动物体浸入溶脂质性溶液中约24-72小时，优选36-48小时，以去除脂肪，优选所述溶脂质性溶液是重铬酸钾稀溶液，优选所述重铬酸钾稀溶液浓度为0.05-0.5mol/l，更优选0.1-0.2mol/l，最优选0.1mol/l；将动物体再次浸入无水乙醇中，浸泡约12-36小时。

(3)选择性地进行软骨染色：配制阿利新蓝在体积比为2：1-8：1(优选3：1-5：1)的无水乙醇和冰醋酸中的饱和溶液，将动物体浸入其中约12-60小时(优选24-48小时)，从而为软骨染色，如果不需要，此步骤可以省略。

(4)肌肉预透明处理：用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液。浸入约0.5-5％(优选1-3％)氢氧化钾稀溶液中约2-8小时，优选4-6小时，以使肌肉呈半透明状态；选择性地，采用注射器吸取氢氧化钾溶液对动物体内部进行多次抽吸以清洗内脏和脑部。

(5)硬骨染色：配制茜素红在无水乙醇中的饱和溶液，加入5-15倍体积(优选8-15倍体积)的0.5-5％(优选1-3％)氢氧化钾稀溶液，浸泡动物体约24-72小时(优选36-60小时)，从而为硬骨染色。

(6)脱色：用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液，浸入1-10％(优选2-5％)过氧化氢溶液2-6小时，从而进行脱色。

(7)透明化处理并置换成保存液：采用体积比为10:1-4:1的0.5-5％(优选1-3％)氢氧化钠稀溶液与甘油的混合溶液浸泡2-8天进行脱色，之后逐步换成升序浓度的甘油溶液，每个梯度浸泡2-4天，最后将标本浸泡在纯甘油中,若需长期保存，可选择性加入防腐剂，优选所述防腐剂为麝香草酚。

在本发明优选实施方案中，所述方法包括下列步骤：

(1)预处理：对新鲜小动物尸体进行解剖学处理，清洗干净，将动物体在无水乙醇中浸泡5-10天，以使动物体硬化；

(2)去除脂肪：将动物体浸入溶脂质性溶液中约36-48小时，以去除脂肪，将动物体再次浸入无水乙醇中，浸泡约12-36小时；

(3)选择性地进行软骨染色：配制阿利新蓝在体积比为3：1-5：1的无水乙醇和冰醋酸中的饱和溶液，将动物体浸入其中约24-48小时，从而为软骨染色；

(4)肌肉预透明处理：用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液；浸入约1-3％氢氧化钾稀溶液中约4-6小时，以使肌肉呈半透明状态；

选择性地，采用注射器吸取氢氧化钾溶液对动物体内部进行多次抽吸以清洗内脏和脑部；

(5)硬骨染色：配制茜素红在无水乙醇中的饱和溶液，加入8-15倍体积的1-3％氢氧化钾稀溶液，浸泡动物体约36-60小时，从而为硬骨染色；

(6)脱色：用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液，浸入2-5％过氧化氢溶液2-6小时，从而进行脱色；

(7)透明化处理并置换成保存液：采用体积比为10:1-4:1的1-2％氢氧化钠稀溶液与甘油的混合溶液浸泡2-8天进行脱色，之后逐步换成升序浓度的甘油溶液，每个梯度浸泡2-4天，最后将标本浸泡在纯甘油中。

优选地，在步骤(2)中所述溶脂质性溶液是重铬酸钾稀溶液，浓度为0.05-0.5mol/l，更优选0.1-0.2mol/l，最优选0.1mol/l。

优选地，本发明的方法在10-28℃温度下进行，更优选15-25℃。

本发明还涉及由所述方法制备得到的小型动物的透明骨骼标本，在优选的实施方式中，动物体的硬骨和软骨被不同的染色剂染色。在更优选的方式中，其中硬骨被茜素红染色，软骨被阿利新蓝染色。

在本发明的制备方法中，有很多因素可以影响最终所制备的骨骼标本的成功率和产品质量。现介绍如下：

1.解剖学处理方式对于骨骼标本成品效果的影响

对于一些体型较小(小于5cm)的鱼类及幼体蛙类，剥皮是可选步骤，并且既可以在开始制备前进行，也可以在第4步预透明处理之后进行，这两者间没有过大的差异，但在制作开始前去除鱼鳞是必要的。而对于体型较大的动物或有皮毛的动物(如成体小鼠)，如果省略剥皮这一步骤，则会导致成品肌肉不透明。

处理内脏的过程也与剥皮相似，只对于较大的动物体是必要的。这一步骤可以在第1步就进行，而对于热带鱼等体型较小的动物，则可以使用注射器吸取与第4步所使用的溶液相同浓度的氢氧化钾溶液，不断冲洗腹腔以去除内脏，因为此时肌肉和各类组织已经变得柔软透明，比较容易进行处理。

由于脑组织不能随肌肉一起变得透明，会在制备完成后使头部发黑，不能完全地显示头骨的形态，所以优选进行去除，可以在第4步浸泡完成后用小镊子去除眼睛，将注射器伸进头骨，用氢氧化钾溶液不断冲洗头骨，以去除脑组织成分。

2.预透明处理步骤中氢氧化钾溶液浓度对于骨骼标本成品效果的影响

预透明处理步骤，也就是第4步，是整体制备过程中对于成品影响最大、也最难控制的一步。

首先，氢氧化钾溶液的浓度需要根据动物体的大小和实际的操作情况进行调节，浓度通常为0.5-5％，优选1-3％，更优选1％到2％之间，浸泡时间长短也要根据实际情况随时调节。优选地，体长约8厘米的金鱼需要在约1％氢氧化钾溶液中浸泡约4小时，体长约5厘米的金鱼浸泡约3小时；幼体青蛙如果不事先剥皮并处理皮下组织，会比较难透明，优选地，在约2％氢氧化钾溶液中浸泡大约6小时。

优选的，本发明方法通常在10-28℃温度下进行，更优选15-25℃，室内温度较高时可以相应的缩短这一步的时间，并保持标本体被置于阴凉处。肌肉变得柔软并呈半透明状即可，过度进行此步骤可能导致在接下来的步骤中肌肉组织腐烂，不能支撑骨骼结构。另外，在此步骤以及后续步骤中，多个标本体可以在同一容器中进行制备，只要保证试剂没过标本即可，这样既可以节约时间又可以节约试剂成本。

3.两种染色剂对于骨骼标本成品效果的影响

从原理上来讲，阿利新蓝与软骨中的酸结合，而茜素红与硬骨中的钙结合。这两种染色剂的使用可根据具体动物体的情况来决定。对于大多数动物，使用阿利新蓝的染色过程是一个可选步骤，因为茜素红已经能很好的显示硬骨的结构。而对于一些特殊的标本体，例如硬骨没有发育完全的幼体、以及鳐鱼等以软骨为主的动物，则优选使用阿利新蓝染色，以展现出其软骨组织的形态。

4.最终透明化处理阶段所采用的试剂及其浓度对于骨骼标本成品效果的影响

如制备方法的第7步中所述，最后的透明阶段需要使用升序梯度浓度的甘油(丙三醇)，例如，第一梯度可以使用6倍体积的1％氢氧化钠溶液与1倍体积的甘油的混合溶液进行浸泡。在这一步骤中，理论上来讲是时间越长越好，一般浸泡3-10天左右，因为随着甘油浸入肌肉，肌肉组织会变得越来越透明。需要注意的是，千万不要因为急于使肌肉变得透明而企图加热浸泡的溶液，这同样适用于其他各个步骤，虽然加热确实能使液体对流，更加迅速地完成制备，但这会对标本体造成很大伤害，导致肌肉不能很好的将骨骼连接在一起。

在使用第一梯度溶液浸泡一周之后，依次递阶更换成40％、60％、80％和100％浓度的甘油。较高浓度的甘油十分粘稠，很难对流，所以优选不时轻轻地上下颠倒混匀，在溶液均匀后(大约每个梯度浓度浸泡2-4天)，即可更换成下一浓度，直到更换为100％的纯甘油。密封于玻璃瓶中，标本体可以在纯甘油中长期保存。

5.个体差异对于骨骼标本成品效果的分析

动物体的皮下脂肪也对标本质量具有一定影响，例如小鼠，如果不经处理，会导致皮下脂肪较多的小鼠出现肌肉部分浑浊，并伴有乳白色的脂肪块，透明效果欠佳。优选地，在剥皮时尽量去除皮下脂肪，或是使用溶脂性溶液(如重铬酸钾稀溶液等)进行浸泡。

附图说明

图1显示了根据实施例1制备的普通金鱼透明骨骼标本的照片。

图2显示了根据实施例2制备的热带鱼(铅笔鱼)透明骨骼标本的照片。

图3显示了根据实施例3制备的热带鱼(雁鱼)透明骨骼标本的照片。

图4显示了根据实施例4制备的热带宠物青蛙透明骨骼标本的照片。

具体实施方式

本申请发明人制备了多批次金鱼、热带鱼、热带宠物青蛙或小鼠的标本。实验证明，对小动物体的处理方式、各个阶段所采用的试剂的浓度、浸渍时间长短等因素都会对骨骼标本的成品效果会产生一定影响。

实施例1

普通金鱼透明骨骼标本的制备

将普通家养金鱼用40-50℃温水处理，剥去鳞片，流水冲净，浸入无水乙醇中一周，以使鱼体硬化。浸入重铬酸钾溶液(0.2mol/l)中约48h，以去除脂肪，再加入无水乙醇中浸泡约24h。配制阿利新蓝在8倍体积的无水乙醇和2倍体积的冰醋酸中的饱和溶液，将鱼体浸入其中约24h，从而为软骨染色。用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液。浸入约2％氢氧化钾溶液中约4h，以使肌肉呈半透明状态。采用注射器吸取氢氧化钾溶液对鱼体内部进行多次抽吸以清洗内脏。配制茜素红在无水乙醇中的饱和溶液，加入9倍体积的2％氢氧化钾溶液，浸泡鱼体约48h，从而为硬骨染色。用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液，浸入3％过氧化氢溶液约4小时，从而进行脱色。使用6倍体积的1％氢氧化钠溶液与1倍体积的甘油的混合溶液浸泡5天，逐步使用升序梯度浓度的甘油溶液进行脱色，最后将标本浸泡在纯甘油中保存。所制备得到标本如图1所示。

实施例2

热带鱼(铅笔鱼)透明骨骼标本的制备

采用与实施例1相似的方法，但所采用的重铬酸钾溶液浓度为0.1mol/l，采用的氢氧化钾溶液浓度为1％。

所制备得到标本如图2所示。

实施例3

热带鱼(雁鱼)透明骨骼标本的制备

采用与实施例1相似的方法。但在鱼体硬化后，浸入重铬酸钾溶液(0.1mol/l)中约60h，以去除脂肪，再加入无水乙醇中浸泡约36h。配制阿利新蓝在8倍体积的无水乙醇和2倍体积的冰醋酸中的饱和溶液，将鱼体浸入其中约36h，从而为软骨染色。用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液。浸入约1％氢氧化钾溶液中约6h，以使肌肉呈半透明状态。配制茜素红在无水乙醇中的饱和溶液，加入9倍体积的1％氢氧化钾溶液，浸泡鱼体约48h，从而为硬骨染色。

所制备得到标本如图3所示。

实施例4

热带宠物青蛙透明骨骼标本的制备

将热带宠物青蛙用40-50℃温水处理，浸入无水乙醇中一周，使得蛙体硬化。浸入重铬酸钾溶液(0.2mol/l)中约60h，以去除脂肪，再加入无水乙醇中浸泡约24h。配制阿利新蓝在8倍体积的无水乙醇和2倍体积的冰醋酸中的饱和溶液，将蛙体浸入其中约48h，从而为软骨染色。用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液。浸入约2％氢氧化钾溶液中约8h，以使肌肉呈半透明状态。配制茜素红在无水乙醇中的饱和溶液，加入9倍体积的2％氢氧化钾溶液，浸泡蛙体约72h，从而为硬骨染色。用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液，浸入2％过氧化氢溶液约5小时，从而进行脱色。使用5倍体积的1％氢氧化钠溶液与1倍体积的甘油的混合溶液浸泡7天，逐步使用升序梯度浓度的甘油溶液进行脱色，最后将蛙体标本浸泡在纯甘油中保存。所制备得到蛙体标本如图4所示。

应该注意的是上述实施例是示例而非限制本发明，本领域技术人员将能够设计很多替代实施例而不脱离附后的权利要求书的范围。

Claims (10)

1.一种制备小型动物透明骨骼标本的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)预处理：对新鲜小动物尸体进行解剖学处理，清洗干净，将动物体在无水乙醇中浸泡3-14天，优选5-10天，以使动物体硬化；

(2)去除脂肪：将动物体浸入溶脂质性溶液中约24-72小时，优选36-48小时，以去除脂肪，将动物体再次浸入无水乙醇中，浸泡约12-36小时；

(3)选择性地进行软骨染色：配制阿利新蓝在体积比为2：1-8：1(优选3：1-5：1)的无水乙醇和冰醋酸中的饱和溶液，将动物体浸入其中约12-60小时(优选24-48小时)，从而为软骨染色；

(4)肌肉预透明处理：用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液；浸入约0.5-5％(优选1-3％，更优选1-2％)氢氧化钾稀溶液中约2-8小时，优选4-6小时，以使肌肉呈半透明状态；

选择性地，采用注射器吸取氢氧化钾溶液对动物体内部进行多次抽吸以清洗内脏和脑部；

(5)硬骨染色：配制茜素红在无水乙醇中的饱和溶液，加入5-15倍体积(优选8-15倍体积)的0.5-5％(优选1-3％，更优选1-2％)氢氧化钾稀溶液，浸泡动物体约24-72小时(优选36-60小时)，从而为硬骨染色；

(6)脱色：用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液，浸入1-10％(优选2-5％)过氧化氢溶液2-6小时，从而进行脱色；

(7)透明化处理并置换成保存液：采用体积比为10:1-4:1的0.5-5％(优选1-2％)氢氧化钠稀溶液与甘油的混合溶液浸泡3-10天(优选2-8天)进行脱色，之后逐步换成升序浓度的甘油溶液，每个梯度浸泡2-4天，最后将标本浸泡在纯甘油中。

2.根据权利要求1的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)预处理：对新鲜小动物尸体进行解剖学处理，清洗干净，将动物体在无水乙醇中浸泡5-10天，以使动物体硬化；

(2)去除脂肪：将动物体浸入溶脂质性溶液中约36-48小时，以去除脂肪，将动物体再次浸入无水乙醇中，浸泡约12-36小时；

(3)选择性地进行软骨染色：配制阿利新蓝在体积比为3：1-5：1的无水乙醇和冰醋酸中的饱和溶液，将动物体浸入其中约24-48小时，从而为软骨染色；

(4)肌肉预透明处理：用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液；浸入约1-3％氢氧化钾稀溶液中约4-6小时，以使肌肉呈半透明状态；

选择性地，采用注射器吸取氢氧化钾溶液对动物体内部进行多次抽吸以清洗内脏和脑部；

(5)硬骨染色：配制茜素红在无水乙醇中的饱和溶液，加入8-15倍体积的1-3％氢氧化钾稀溶液，浸泡动物体约36-60小时，从而为硬骨染色；

(6)脱色：用纯净水浸泡，并不断换液以去除残留溶液，浸入2-5％过氧化氢溶液2-6小时，从而进行脱色；

(7)透明化处理并置换成保存液：采用体积比为10:1-4:1的1-2％氢氧化钠稀溶液与甘油的混合溶液浸泡2-8天进行脱色，之后逐步换成升序浓度的甘油溶液，每个梯度浸泡2-4天，最后将标本浸泡在纯甘油中。

3.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤(2)中所述溶脂质性溶液是重铬酸钾稀溶液，优选所述重铬酸钾稀溶液浓度为0.05-0.5mol/l，更优选0.1-0.2mol/l，最优选0.1mol/l。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法在10-28℃温度下进行，优选15-25℃。

5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中在第7步骤中，使用第一梯度溶液浸泡之后，依次递阶更换成40％、60％、80％和100％浓度的甘油，每个梯度浓度浸泡2-4天，直到更换为100％的纯甘油。

6.根据权利要求1的方法，其中所述在步骤(7)中，所述甘油中含有防腐剂，优选所述防腐剂为麝香草酚。

7.根据权利要求1-6任一项的方法制备得到的小型动物透明骨骼标本。

8.根据权利要求7的小型动物透明骨骼标本，其为金鱼、热带鱼、蛙或小鼠。

9.根据权利要求7或8的小型动物透明骨骼标本，其中动物体的硬骨和软骨被不同的染色剂染色。

10.根据权利要求7-9的小型动物透明骨骼标本，其中硬骨被茜素红染色，软骨被阿利新蓝染色。