CN105973663B - 一种炫彩骨骼标本的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种炫彩骨骼标本的制备方法，包括取材、固定、染色、透明化和显微处理步骤，在固定步骤之后、染色步骤之前设有再固定步骤，所述再固定步骤为采用60~95体积%酒精浸泡固定步骤获得的动物标本，并在温度为0~4℃条件下固定1~3天。本发明制备的炫彩骨骼标本美观、透明度高、保真度高、制作周期短、可量产。
Description
技术领域
本发明涉及生物标本领域，尤其涉及一种炫彩骨骼标本的制备方法。
背景技术
目前国内市场上制作出来的动物标本大多数是采用涂抹防腐剂后风干保存，或者就是直接福尔马林固定保存，其整体美观度差，认为的假象较重，且无法展示出微妙的大自然美。国外有做关于骨骼艺术的研究，形成艺术潮流，目前国内关于骨骼艺术的研究处于初始阶段，制作技术较为粗糙，同样也缺乏规模制作骨骼标本的厂家。
随着研究的深入，申请号为201510284053.5的中国专利《水晶骨骼标本的制作方法》公开了一种水晶骨骼标本的制作方法，所述方法包括如下步骤：获取动物标本后采用50%乙醇、100%甲醇、100%丙酮和100%乙醇固定动物标本；然后采用0.5~3%过氧化氢溶液和100%丙酮脱脂和脱色；再采用Alizerin red和/或Alcian blue进行骨骼染色处理；去除特异性着色，采用100%乙醇和/或1.5%氢氧化钾处理；之后采用50%丙三醇、75%丙三醇和100%丙三醇进行梯度透明化处理；最后在显微镜下，除去相应部位的软组织，得到所述水晶骨骼标本。本发明制作方法的制作周期缩短为15~30天，制作出的水晶骨骼在质量上优越，且制作种类较多，具有商业化大规模生产的潜力。该专利固定不够充分，并且染色的时候，特异性较差，冰醋酸的浓度较固定，容易脱掉钙化组织中的钙，氢氧化钾的浓度较含糊，不易实现柔韧而完整的骨骼标本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种美观、透明度高、保真度高、制作周期短、可量产的炫彩骨骼标本的制备方法。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种炫彩骨骼标本的制备方法，包括取材、固定、染色、透明化和显微处理步骤，在固定步骤之后、染色步骤之前设有再固定步骤，所述再固定步骤为采用60~95体积%酒精浸泡固定步骤获得的动物标本，并在温度为0~4℃条件下固定1~3天。
炫彩骨骼是一种能够快速使动物骨骼以“4D X光”的效果展现出来的方法，使得平时无法观察到微细的骨骼系统能够清晰地、丝发未损且原生态地呈现出来。与传统的骨骼标本不同，炫彩骨骼艺术品色彩斑斓，呈现多彩的奇幻效果，不用传统防腐剂处理，而采用环保无毒的溶液进行保存，不仅用于科学研究，还可以用于市民的科普教育。本发明增加再固定步骤，保证固定充分，并且防止在固定的时候温度过高，引起组织腐败影响后续的染色，保证组织染色柔韧，易于特异染色。
进一步地，一种炫彩骨骼标本的制备方法，包括如下步骤：
S1、取材：新鲜动物去皮去内脏，获取新鲜动物标本；
S2、固定：依次采用80~100体积%乙醇浸泡12~24小时、50~75体积%甲醇浸泡6~12小时、50~75体积%丙酮浸泡6~12小时和60~95体积%乙醇浸泡12~24小时固定步骤S1获得的动物标本；
S3、再固定：采用60~95体积%酒精浸泡步骤S2获得的动物标本，并在温度为0~4℃条件下固定1~3天；
S4、染色：采用Alcian blue染色液和/或Alizerin red染色液对步骤S3固定的动物标本进行骨骼染色处理；
S5、透明化：依次采用60~70体积%丙三醇浸泡6~12小时、80~100体积%丙三醇Ⅰ浸泡2~5天和90~100体积%丙三醇Ⅱ浸泡6~12天，对步骤S4染色后的动物标本进行定型透明化处理；
S6、显微处理：在显微镜下，对步骤S5透明化处理后的动物标本除去多余的软组织，得到炫彩骨骼标本。
其中，由于新鲜组织含水量大，步骤S2中，80~100体积%乙醇可以使组织快速固定、50~75体积%甲醇可以初步去脂而不破坏组织、50~75体积%丙酮进一步去脂、60~95体积%乙醇洗去多余的丙酮。步骤S3中，60~95体积%酒精、0~4℃冰箱固定可以在保护组织的同时洗净丙酮为下步染色做准备。步骤S5中，甘油的浓度梯度升高可以使组织不至于皱缩而破坏骨骼的形态。
步骤S2、S3中，固定过程中需要不停地摇动；在步骤S4中，染色前对动物标本展示的形态进行初步的整形。
进一步地，所述步骤S2采用的固定液80~100体积%乙醇、50~75体积%甲醇、50~75体积%丙酮和60~95体积%乙醇与动物标本之间的体积比均为（20~30）:1。
所述步骤S4的具体步骤为：
S41、配制冰醋酸和乙醇的混合液，其体积比为（1~3）：（ 5~7），然后按照（200~300）μL/100mL的比例将Alcian blue储存液加入混合液中，得到Alcian blue染色液，所述储存液是用80~95%酒精配制的Alcian blue 8GX饱和液；
S42、配制质量百分数为1~5%的氢氧化钾工作液，按照300~800μL/100mL的比例加入Alizerin red储存液，得到Alizerin red染色液；
S43、采用步骤S41和/或S42配制的染色液对步骤S3固定的动物进行骨骼染色处理。
根据材料的不同所需要的染色液的酸碱程度而有所差异，Alizerin red染色液的pH值一般为7~10，硬化骨骼大量的钙盐，在碱性的环境下易于与Alizerin red螯合，Alcian blue染色液的pH值一般为1~2，软骨的主要组织成分是硫酸软骨素，在酸性的条件下Alcian blue 易于与软骨组织螯合。优选地，在步骤S4染色过程中使用冰醋酸和/或氢氧化钾对染液pH进行调节，使染色剂和骨骼快速而特异的结合。
优选地，染色前用0.1~1%过氧化氢行去除浮色。浓度过高会使组织内部产生大量的气泡，影响后期的标本的透明度。
优选地，染色前用质量百分数为1~5%的氢氧化钾溶液进行组织的软化处理。高浓度的氢氧化钾可以使骨骼关节处的组织过度软化而使整体骨骼的完整性遭到破坏，所以本发明中采用1~5%的氢氧化钾溶液。
再进一步地，在步骤S4中，采用Alcian blue 染色液染色后用70%乙醇洗净浮色，方便后续染色；采用Alizerin red 染色液染色后用质量百分数为0.5~3%的氢氧化钾溶液洗净浮色，低浓度的氧化钾溶液易于保护骨骼的完整性。
染色后采用质量百分数为0.5~2%的氢氧化钾溶液进行反复处理3天，每次都要更换新的氢氧化钾溶液，以便去掉浮色。反复处理为反复浸泡，更换时间根据氢氧化钾溶液的颜色，以达到洗脱浮色为准，间隔时间每天一次。通过该步骤，易于骨骼观察。
染色后用质量百分比为4~10%的多聚甲醛溶液对标本进行形态定型。多聚甲醛能够使固定迅速，并且固定后稳定性好，与甘油互溶性好。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
（1）无污染，固定液所采用80~100%乙醇、50~75%甲醇、50~75%丙酮和60~95%乙醇，对环境不会带来污染；
（2）在Alizerin red 和/或 Alcian blue进行骨骼染色的染色液进行了化繁为简的处理，可选择性强，且易于操作；
（3）本发明制作方法的制作周期缩短为5~50天；
（4）制作出的炫彩骨骼艺术品原生态的保留了骨骼系统的美，且制作种类繁多，适用于所有脊椎动物，具有大规模生产的潜力；本发明制作方法所得炫彩骨骼艺术品，具有骨骼精细、美观、透明度高、制作周期短、可量产等特点。
附图说明
图1为实施例1的标本效果图；
图2为对比例1的标本效果图；
图3为实施例2的标本效果图；
图4为实施例3的标本效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
一种炫彩骨骼标本的制备方法，包括如下步骤：
S1、取材：将12天鸡胚去皮去内脏，获取鱼标本；
S2、固定：依次采用80体积%乙醇浸泡12小时、50体积%甲醇浸泡6小时、50体积%丙酮浸泡6小时和60体积%乙醇浸泡12小时固定步骤S1获得的动物标本；采用的固定液80体积%乙醇、50体积%甲醇、50体积%丙酮和60体积%乙醇与动物标本之间的体积比均为20:1；
S3、再固定：采用60体积%酒精浸泡步骤S2获得的动物标本，并在温度为0℃条件下固定1天；
S4、染色：采用Alcian blue染色液对步骤S3固定的动物标本进行骨骼染色处理；
S5、Alizerin red 染色液染色，采用Alizerin red 染色液染色后用质量百分数为0.5~3%的氢氧化钾溶液洗净浮色，低浓度的氧化钾溶液易于保护骨骼的完整性；
S6、透明化：依次采用60体积%丙三醇浸泡6小时、80体积%丙三醇Ⅰ浸泡2天和90体积%丙三醇Ⅱ浸泡6天，对步骤S5染色后的动物标本进行定型透明化处理；
S7、显微处理：在显微镜下，对步骤S6透明化处理后的动物标本除去多余的软组织，得到炫彩骨骼标本。
进一步地，所述步骤S5的具体步骤为：
S51、配制冰醋酸和乙醇的混合液，其体积比为1:5，然后按照200μL/100mL的比例将Alcian blue储存液加入混合液中，得到Alcian blue染色液，所述储存液是用80%酒精配制的Alcian blue 8GX饱和液；
S51、配制质量百分数为1%的氢氧化钾工作液，按照300μL/100mL的比例加入Alizerin red储存液，得到Alizerin red染色液；
S43、采用步骤S41和/或S51配制的染色液对步骤S3固定的动物进行骨骼染色处理。
染色前先用0.1%过氧化氢进行去除浮色，然后用质量百分数为1%的氢氧化钾溶液进行组织的软化处理。
在步骤S4中，采用Alcian blue 染色液染色后用70%乙醇洗净浮色；采用Alizerinred 染色液染色后用质量百分数为0.5%的氢氧化钾溶液洗净浮色。
染色后采用质量百分数为0.5%的氢氧化钾溶液进行反复处理3天，每次都要更换新的氢氧化钾溶液，以便去掉浮色。然后，用质量百分比为4%的多聚甲醛溶液对标本进行形态定型。
实施例2
一种炫彩骨骼标本的制备方法，包括如下步骤：
S1、取材：将鱼去皮去内脏，获取鱼标本；
S2、固定：依次采用90体积%乙醇浸泡8小时、65体积%甲醇浸泡9小时、65体积%丙酮浸泡9小时和75体积%乙醇浸泡18小时固定步骤S1获得的动物标本；采用的固定液90体积%乙醇、65体积%甲醇、65体积%丙酮和75体积%乙醇与动物标本之间的体积比均为25:1；
S3、再固定：采用75体积%酒精浸泡步骤S2获得的动物标本，并在温度为2℃条件下固定2天；
S4、染色：采用Alizerin red染色液对步骤S3固定的动物标本进行骨骼染色处理；
S5、透明化：依次采用65体积%丙三醇浸泡9小时、90体积%丙三醇Ⅰ浸泡3天和95体积%丙三醇Ⅱ浸泡9天，对步骤S4染色后的动物标本进行定型透明化处理；
S6、显微处理：在显微镜下，对步骤S5透明化处理后的动物标本除去多余的软组织，得到炫彩骨骼标本。
进一步地，所述步骤S4的具体步骤为：
S41、配制质量百分数为3%的氢氧化钾工作液，按照550μL/100mL的比例加入Alizerin red储存液，得到Alizerin red染色液；
S43、采用步骤S41配制的染色液对步骤S3固定的动物进行骨骼染色处理。
染色前先用0.5%过氧化氢进行去除浮色，然后用质量百分数为3%的氢氧化钾溶液进行组织的软化处理。在步骤S4中，采用Alizerin red 染色液染色后用质量百分数为2%的氢氧化钾溶液洗净浮色。
染色后采用质量百分数为1.2%的氢氧化钾溶液进行反复处理3天，每次都要更换新的氢氧化钾溶液，以便去掉浮色。然后，再用质量百分比为7%的多聚甲醛溶液对标本进行形态定型。
实施例3
一种炫彩骨骼标本的制备方法，包括如下步骤：
S1、取材：将巴西龟去皮去内脏，获取巴西龟标本；
S2、固定：依次采用100体积%乙醇浸泡24小时、75体积%甲醇浸泡12小时、75体积%丙酮浸泡12小时和95体积%乙醇浸泡24小时固定步骤S1获得的动物标本；采用的固定液100体积%乙醇、75体积%甲醇、75体积%丙酮和95体积%乙醇与动物标本之间的体积比均为30:1；
S3、再固定：采用95体积%酒精浸泡步骤S2获得的动物标本，并在温度为4℃条件下固定3天；
S4、染色：采用Alizerin red染色液对步骤S3固定的动物标本进行骨骼染色处理；
S5、透明化：依次采用70体积%丙三醇浸泡12小时、100体积%丙三醇Ⅰ浸泡5天和100体积%丙三醇Ⅱ浸泡12天，对步骤S4染色后的动物标本进行定型透明化处理；
S6、显微处理：在显微镜下，对步骤S5透明化处理后的动物标本除去多余的软组织，得到炫彩骨骼标本。
进一步地，所述步骤S4的具体步骤为：
S41、配制质量百分数为5%的氢氧化钾工作液，按照800μL/100mL的比例加入Alizerin red储存液，得到Alizerin red染色液；
S42、采用步骤S41配制的染色液对步骤S3固定的动物进行骨骼染色处理。
染色前先用1%过氧化氢进行去除浮色，然后用质量百分数为5%的氢氧化钾溶液进行组织的软化处理。
在步骤S4中，采用Alizerin red 染色液染色后用质量百分数为3%的氢氧化钾溶液洗净浮色。
染色后采用质量百分数为2%的氢氧化钾溶液进行反复处理3天，每次都要更换新的氢氧化钾溶液，以便去掉浮色，然后再用质量百分比为10%的多聚甲醛溶液对标本进行形态定型。
对比例1
采用普通方法制作鸡胚骨骼标本的方法，具体步骤如下：
取孵化12天鸡胚，放入50%乙醇中固定，放摇床12小时；然后放入100%甲醇中固定12小时；再放入100%丙酮中固定12小时；最后将鸡胚放入100%乙醇中固定12小时；
Alcian blue 染色(100~500μL/100mL的比例将Alcian blue储存液加入混合液中)，将鸡胚行去皮术后放入染色液中约14小时；之后放入100%乙醇中洗去浮色，将鸡胚放入5 %氢氧化钾溶液中约26小时；
Alizerin red 染色(配制质量百分数为0.5~3%的氢氧化钾溶液，按照100μL/100mL的比例加入Alizerin red)，将鸡胚放入染色液中染色7天；再将鸡胚放入1.5%氢氧化钾溶液中漂洗非特异性着色约12小时；
放入50%丙三醇中约48小时，后依次进入75%丙三醇、100%丙三醇进行梯度透明化处理大约2天直至胚胎沉到底部；对染色后的鸡胚进行显微处理完成制作。
对实施例1~3和对比例1制备的骨骼标本进行观察，如图1~4，结果如下：
实施例1~3与对比例1比较，可以看出本发明①效果通透性高，②微细结构显示清晰，③肌肉完全透明，④没有黄色、红色等非特异染色，⑤作品的柔软度好，不易损坏，耐搬运。
Claims (7)
1.一种炫彩骨骼标本的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取材：新鲜动物去皮去内脏，获取新鲜动物标本；
S2、固定：依次采用80~100体积%乙醇浸泡12~24小时、50~75体积%甲醇浸泡6~12小时、50~75体积%丙酮浸泡6~12小时和60~95体积%乙醇浸泡12~24小时固定步骤S1获得的动物标本；
S3、再固定：采用60~95体积%酒精浸泡步骤S2获得的动物标本，并在温度为0~4℃条件下固定1~3天；
S4、染色：采用Alcian blue染色液和/或Alizerin red染色液对步骤S3固定的动物标本进行骨骼染色处理；
S5、透明化：依次采用60~70体积%丙三醇浸泡6~12小时、80~100体积%丙三醇浸泡2~5天和90~100体积%丙三醇浸泡6~12天，对步骤S4染色后的动物标本进行定型透明化处理；
S6、显微处理：在显微镜下，对步骤S5透明化处理后的动物标本除去多余的软组织，得到炫彩骨骼标本；
所述步骤S4的具体步骤为：
S41、配制冰醋酸和乙醇的混合液，其体积比为（1~3）：（5~7），然后按照（200~300）μL/100mL的比例将Alcian blue储存液加入混合液中，得到Alcian blue染色液，所述储存液是用80~95%酒精配制的Alcian blue 8GX饱和液；
S42、配制质量百分数为1~5%的氢氧化钾工作液，按照300~800μL/100mL的比例加入Alizerin red储存液，得到Alizerin red染色液；
S43、采用步骤S41和/或S42配制的染色液对步骤S3固定的动物进行骨骼染色处理。
2.根据权利要求1所述的炫彩骨骼标本的制备方法，其特征在于，所述步骤S2采用的固定液80~100体积%乙醇、50~75体积%甲醇、50~75体积%丙酮和60~95体积%乙醇与动物标本之间的体积比均为（20~30）:1。
3.根据权利要求1所述炫彩骨骼标本的制备方法，其特征在于，染色前用0.1~1%过氧化氢进行去除浮色。
4.根据权利要求1所述炫彩骨骼标本的制备方法，其特征在于，染色前用质量百分数为1~5%的氢氧化钾溶液进行组织的软化处理。
5.根据权利要求1所述炫彩骨骼标本的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，采用Alcian blue 染色液染色后用70%乙醇洗净浮色；采用Alizerin red 染色液染色后用质量百分数为0.5~3%的氢氧化钾溶液洗净浮色。
6.根据权利要求1所述炫彩骨骼标本的制备方法，其特征在于，当采用Alizerin red染色液染色后采用质量百分数为0.5~2%的氢氧化钾溶液进行反复处理3天，直至去掉浮色。
7.根据权利要求1所述炫彩骨骼标本的制备方法，其特征在于，染色后用质量百分比为4~10%的多聚甲醛溶液对标本进行形态定型。
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